Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Verschlingung präsynaptischer Inputs durch Mikroglia sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die fluoreszierenden Tracer der vorderen Stufe in die Augen injiziert werden, um präsynaptische Inputs für retinale Ganglienzellen im Nucleus genant lateralis zu markieren. Der zweite Schritt besteht darin, das Gehirn zu sezieren, zu reparieren und auszugleichen.

Als nächstes wird das Gehirn in Scheiben geschnitten. Der letzte Schritt besteht darin, die Gehirnabschnitte für die Bildgebung und Analyse auf eine Decklippe zu montieren. Letztendlich wird die konfokale Mikroskopie verwendet, um die Verschlingung präsynaptischer Inputs durch Mikroglia zu beurteilen.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie phagozytäre Böden zur Plastizität und zum Umbau synaptischer Schaltkreise beitragen. Obwohl diese Methode Einblicke in den Umbau synaptischer Schaltkreise im gesunden Gehirn geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. den Umbau des synaptischen Schaltkreises bei Erkrankungen des Nervensystems. Chris Heller, ein Techniker, und Emily Laman, eine Doktorandin des Stevens Laboratory, werden das Verfahren vorführen.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Maus mit 4% ISO-Fluor in einer Plexiglas-Induktionskammer betäuben. Stellen Sie nach ein bis drei Minuten sicher, dass ein angemessenes Maß an Anästhesie erreicht wird, indem Sie den Schwanz einklemmen. Legen Sie dann die Maus auf die Seite unter das Stereomikroskop und platzieren Sie den Nasenkonus, der drei bis 4 % ISO-Fluor liefert, über der Schnauze.

Um die Sklera freizulegen, öffnen Sie mit einer kleinen Federschere das Augenlid und ziehen Sie die Haut zurück. Bei Neugeborenen ist manchmal ein weiterer senkrechter Schnitt im Augenwinkel notwendig. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Augenwinkel aufschneiden, da sich dort ein Blutgefäß befindet.

Verwende eine sterile 30,5-Gauge-Nadel, um ein kleines Loch an der Seite des Auges zu stechen, wo die Sklera beginnt. Achten Sie darauf, die Linse nicht zu beschädigen, indem Sie die Nadel gerade so weit einführen, dass die Fase in das Auge eindringt. Lassen Sie den Glaskörper aus dem Loch fließen und verwenden Sie einen sterilen Schnitt und einen Applikator mit Spitze, um die Flüssigkeit aufzunehmen.

Sobald der Glaskörper nicht mehr aus dem Loch fließt, führen Sie langsam eine stumpfe Nadel ein, die an einer Hamilton-Spritze befestigt ist, die mit der vorderen Gradabtastung vorgeladen wurde. Färben Sie in das Loch und injizieren Sie die Farbe langsam in das Auge. Typischerweise wird die Choleratoxin-beta-Untereinheit, die an Alexa 5 94, 6 47 oder 4 88 konjugiert ist, bis zum vorderen Grad verwendet.

Späte Leiterbahn R GC-Eingänge Lassen Sie die Nadel einige Sekunden lang im Loch und entfernen Sie sie dann langsam. Verwenden Sie einen Applikator mit Wattespitze, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen und zu verhindern, dass der Farbstoff ausläuft. Tragen Sie dann eine kleine Menge antibiotische Salbe auf das Auge auf.

Wenn das Auge operativ geöffnet wurde. Positionieren Sie die Augenlider nach der Injektion vorsichtig wieder zusammen. Lassen Sie die Maus unter einer Wärmelampe oder auf einem Wärmekissen, bis sie sich von der Narkose zu erholen beginnt.

Bringen Sie die Maus in einen sauberen Heimkäfig zurück und überwachen Sie sie, um sicherzustellen, dass sie vollständig wach ist, bevor Sie sie in die Kolonie zurückbringen. Etwa 24 Stunden nach der Injektion opfern Sie die Maus und sezieren Sie das Gehirn. Fixieren Sie das Gehirn in einer mit 4%PFA gefüllten Falcon-Tube über Nacht bei vier Grad Celsius am nächsten Tag.

Spülen Sie das Gehirn dreimal in PBS, indem Sie zuerst das Gehirn und PFA in ein leeres Molkeschiffchen gießen und dann das Gehirn mit einem Spatel in ein anderes mit PBS gefülltes Molkeschiffchen übertragen. Waschen Sie das Gehirn noch zwei weitere Male in PBS, bevor Sie es in ein Falcon-Röhrchen geben, das mit 30%iger Saccharoselösung gefüllt ist. Lassen Sie es in Saccharose bei vier Grad Celsius, bis es auf den Boden der Tube sinkt.

Entfernen Sie anschließend alle Teile des Gehirns, die nicht benötigt werden, mit einer Rasierklinge. Frieren Sie das Gehirn auf einem Stück Alufolie über Trockeneis ein. In der Zwischenzeit frieren Sie die Mikrotomstufe ein und füllen Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit einem halben Milliliter 0,1 molaren PP, um das gefrorene Gehirn auf die Gefrierstufe zu setzen.

Tragen Sie eine kleine Menge OCT auf die Bühne auf. Sobald das OCT zu gefrieren beginnt, legen Sie das Gehirn hinein. Die Seite des Gehirns, die geschnitten wird, sollte nach oben zeigen.

Als nächstes bedecken Sie das Gehirn und die OCT mit sehr fein zerstoßenem Trockeneis. Lassen Sie das Trockeneis etwa 30 Sekunden lang auf dem Gehirn. Verwenden Sie dann einen großen Pinsel, um das Trockeneis zu entfernen.

Beginnen Sie mit dem Schneiden der Scheiben mit einer Dicke von 40 Mikrometern. Entfernen Sie dann mit einem kleinen feuchten Pinsel die Abschnitte mit dem interessierenden Bereich von der Klinge und übertragen Sie sie auf die 24-Well-Platte mit 0,1 molaren pb. Nachdem die Schnitte entnommen wurden, visualisieren Sie die Markierung des Frontzahnbereichs unter einem Fluoreszenzmikroskop und wählen Sie Schnitte aus, die den interessierenden Bereich enthalten, um die Schnitte auf einen Objektträger zu montieren.

Wenden Sie zunächst einen kleinen Pool von 0,1 molaren PB auf ein geladenes Mikroskop an. Schieben Sie als nächstes und übertragen Sie die Gewebeschnitte in den Pb-Pool. Verwenden Sie dann den Pinsel, um die Taschentücher auszurichten und zu verteilen.

Verwenden Sie ein Kim-Tuch, um XSPB abzuleiten, und achten Sie darauf, dass der Abschnitt nicht abgesaugt wird. Lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen. Tragen Sie dann einen kleinen Tropfen Eindeckmittel auf jede Sektion auf und montieren Sie am Ende einen Decklas.

Versiegeln Sie die Ränder der Folie mit Nagellack. Lagern Sie den Objektträger bei minus 20 Grad Celsius bis zur gezeigten Bildgebungssitzung. Hier ist ein Schema der Strategie zur Abgrenzung des vorderen Grades.

Die RGC-Eingänge des linken und rechten Auges werden mit CTB 6 47 bzw. CTB 5 94 verfolgt. Anschließend wird der Mikroglia-vermittelte Engulfment von Inputs bewertet. Hier ist ein repräsentatives Bild mit geringer Vergrößerung der Maus DLGN nach der intergradellen Abgrenzung von Eingaben des linken und rechten Auges.

Dabei handelt es sich um eine Mikroglia, die aus der Grenzregion des linken und rechten Auges entnommen wurde. Die gesamte CTB-Fluoreszenz außerhalb des Mikrogliavolumens wurde subtrahiert, wodurch die verschlungenen RGC-Eingänge und die Oberflächenwiedergabe der Mikroglia und verschlungen sichtbar wurden. Hier werden RGC-Eingänge angezeigt.

Hier ist die repräsentative Oberfläche der Mikroglia von P fünf, P neun und P 30 Maus. DLGN Das Engulfment von RGC-Inputs ist während des Peak-Pruning im DLGN im Vergleich zu älteren Altersgruppen signifikant erhöht. Mikroglia von Mäusen, denen der Komplementrezeptor drei fehlt, verschlingen signifikant weniger RGC-Inputs im Vergleich zu Wildtyp-Wurfgeschwistern, sobald sie gemeistert wurden.

Diese Technik kann in 72 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Markierungsneuronen intergradiert und Mikroglia-Synapseninteraktionen bewertet.