Name: Mapping und Anwendung von Enhancer-trap Flippase Expression in Larven und Erwachsene Drosophila CNS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Erfahren Sie die FINGR-Methode zur präzisen Kontrolle von Gal4-Expression im ZNS von Drosophila. Diese Technik ermöglicht gewebespezifische genetische Manipulationen für die Analyse neuronaler Schaltkreise.

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Wir bedanken uns bei einem internen Fonds von der University of Oklahoma (bis BZ) und einen Zuschuss von NSF (IOS-1025556, zur BZ und RAB) für die Unterstützung TRF, RAB, XP, AAO, MLW, CAS, und diese Forschung. Eine NIH (RO1 NS060878, um BZ) teilweise RAB unterstützt. RAB erkennt ein NIH NRSA (T32 NS07292) Ausbildung Zuschuss für Brandeis University und einen NIH (RO1 GM21473) bewilligt, um Jeffrey Hall an der Brandeis, für die Unterstützung der frühen Phasen der Studie. Wir danken Jeffrey Hall für seine kontinuierliche Ermutigungen für dieses Projekt. Wir danken Dr. Kristin Scott für die Bereitstellung der Wanne P&gt; GAL80&gt; Stamm.

1. Drosophila-Stämmen <ol><li> Gal4-Treiber: GMR-Gal4, die Gal4 drückt in Sehzellen. </li><li> UAS-Linien UAS-MJD78Q (oder UAS-polyQ), die neuronale Degeneration verursacht in Gal4-exprimierenden Zellen. UAS-GFP, die GFP drückt in Gal4-exprimierenden Zellen. </li><li> FLP-Linien ey-FLP, das FLP drückt in Photorezeptoren und in Teilmengen von Hirnregionen. ET-FLPx2 Linien, die Enhancer-trap-Linien, die zwei Kopien von FLP (FLP-IRES-FLP) sind. Wir haben ~ 1.000 ET-FLP-Linien (Bohm et al., 2010), dessen Expressionsmuster sind noch nicht charakterisiert werden generiert. Hier beschreiben wir die Charakterisierung der Expressionsmuster wählen ET-FLPx2 in die Larven und erwachsene Fliege zentralen Nervensystems (ZNS). </li><li> FLP-Reporter yw, Aktin P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997), in der über die Expression der ET-FLPx2 durch Aktin-P&gt; Gal4; UAS-GFP auf FLP-vermittelte recombinational Exzision&gt; CD2. </li><li> Zwei komplementäre GAL80-converting-Tools Tub P&gt; GAL80&gt; (Gordon &amp; Scott, 2009), die Flip-out-Konstrukt, das konstitutiv GAL80 in allen Geweben durch eine starke Tubulin-Promotor angetrieben. Bei FLP-vermittelte Rekombination, ist&gt; GAL80 ausgeflippt und GAL80 Ausdruck wird nur in gekündigt ET-FLPx2-exprimierenden Geweben. Tub P&gt; stop&gt; GAL80 (Bohm et al., 2010), die Flip-in zu konstruieren, die nicht exprimiert GAL80 unter normalen Bedingungen. GAL80 Ausdruck ist auf die Tubulin-Promotor nur in sich ET-FLPx2-exprimierenden Geweben, in denen FLP Flips out&gt; Stop und Flips in GAL80. </li><li> Fliegen zum Testen FLP Aktivität im Facettenauge GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 (Bohm et al, 2010.), Das hat entartet und depigmented Augen. In FLP-exprimierenden Sehzellen ist polyQ Ausdruck aus folgenden GAL80 Flip-in aktiviert. GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) Wanne P&gt; GAL80&gt;, die normale Augen hat. In FLP-exprimierenden Sehzellen ist polyQ Ausdruck auf folgenden GAL80 Flip-herausstellen. </li></ol> 2. Reagenzien Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, 1X), pH 7,4. 4% Paraformaldehyd (PFA), in PBS von 16% PFA, EM Grad (Kat. Nr. 15710, Electronic Microscopy Sciences, Hatfield, PA) verdünnt PBT, 1XPBS mit 0,1% Triton-X 100 (Sigma) Anti-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa), Flecken alle Neuronen in Drosophila. Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa) Flecken Gliazellen in Drosophila. Alexa 594 Hühner gegen Maus Sekundär-Antikörper (Invitrogen) 3. Mapping the Expressionsmuster von Enhancer-trap FLPx2 Zeilen (* entscheidende Schritte) <ol><li> Sammeln Jungfrauen Frauen aus der yw, Aktin P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP Linie und Kreuz Männchen einzelnen ET-FLPx2 Linien. Der ehemalige dient als GFP-Reporter für die Gewebe-Expression von ET-FLP. </li><li> * Dissect wandernde 3 rd instar F1-Larven, behalten das ZNS (dh, das Gehirn und das Bauchmark, VNC) und die Wand des Körpers, fix für 1 Stunde in 4% PFA auf Eis, wäscht mit eiskaltem PBS 3X gefolgt von 3X Waschen mit PBT. Zergliederung <ol><li> Entfernen Sie wandern 3 rd instar F1-Larven und legen Sie sie in eine saubere Schüssel Sylgard (35 mm x 10 mm Petrischale mit 2 Gramm Sylgard gefüllt - gemischt nach den Anweisungen der Herstellung). <ol><li> Entfernen Sie Speisereste mit Pinsel </li></ol></li><li> Füllen Sie die Schüssel mit eiskaltem 1XPBS und auf Eis stellen, um die Larven zu betäuben </li><li> Halten Sie den Mund Haken einer Larve mit einer Pinzette und greifen die Schuppenschicht in der Nähe der Erweiterung vorderen Luftloch mit einer anderen Pinzette und schälen die Oberhaut sich zum hinteren Ende. Das ZNS wird in den Mund befestigt werden Haken zusammen mit den Speicheldrüsen, Darm und Imaginalscheiben. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Gewebe und Imaginalscheiben Umgebung des ZNS. </li><li> Übertragung des ZNS zu einer PBS-gefüllten 3 gut Pyrex Schüssel. <ol><li> Eine silikonisierte P200 Pipettenspitze kann verwendet werden, um zu vermeiden das Trocknen des Gewebes werden. </li></ol></li><li> Fix für 1 Stunde in 200 ul 4% PFA auf Eis. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass das ZNS ist voll in die PFA untergetaucht. <ol><li> Wenn das ZNS schwimmt, dies in der Regel darauf hin, dass das ZNS nicht richtig aus dem umgebenden Gewebe gereinigt. </li></ol></li></ol></li><li> 3x mit eiskaltem PBS von 3X Waschen mit PBT gefolgt. </li></ol></li><li> * Dissect des ZNS von adulten F1 Fliegen. <ol><li> Anesthetize die Fliegen mit CO 2 oder legen Sie das Fliegen in ein leeres Fläschchen auf Eis für 10 Minuten enthalten. </li><li> Ort erwachsenen Fliegen in eine 95% EtOH gefüllten Glasschale auf Eis für 30 sek. </li><li> Übertragen Sie die erwachsenen Fliegen in eine 1XPBS gefüllt Glasschale auf dem Eis. <ol><li> Waschen mit eiskaltem 1X PBS 3X, um restliches EtOH entfernen </li></ol></li><li> Platzieren Sie eine Fliege in einer 35-Sylgard Schüssel mit eiskaltem 1X PBS gefüllt </li><li> Legen Sie die Bauchseite nach oben und stecken ein kleines Insekt Stift (minutiens Stifte 0,1 mm) auf halbem Wege durch die Bauchdecke. <ol><li> Mit einer Pinzette halten die Basis der Beine und entfernen Sie die Beine mit einer anderen Pinzette. </li></ol></li><li> Entfernen Sie den Kopf Nagelhaut <ol><li> Während packte den Rüssel mit einer Pinzette, legen Sie eine weitere unterhalb des Auges und schälen die Oberhaut auf der dorsalen Mittellinie der Fliege den Kopf. </li><li> Schnappen Sie das andere Auge und entfernen Sie die restlichen Schuppenschicht auf der anderen Seite. </li><li> Mit scharfen Pinzette und / oder geschärft Wolframnadel, entfernen tracheale umgebende Gewebe des Gehirns <ol><li> Unsachgemäße Reinigung der Luftröhre wird in starker Autofluoreszenz dadurch behindert GFP-Expression, und damit das Gehirn beim Fixieren float </li></ol></li></ol></li><li> VNC Dissection <ol><li> Entfernen Sie die Brust Nagelhaut <ol><li> Beginnend am hinteren Ende des Thorax, Platz zwei Pinzetten an jeder Seite des 3. preepisternum (dh, packte der Basis der Hinterbeine). </li><li> Vorsichtig trennen die Nagelhaut entfernt von der ventralen Mittellinie Linie, wiederholen Sie diesen, bis Sie die Basis des Halses erreichen. </li><li> Spreizen Sie die beiden Hälften des Thorax Nagelhaut Freilegung der VNC </li></ol></li><li> Nächste entfernen den Bauch aus dem Thorax. Bei der Verwendung einer Pinzette auf den Thorax bei der zweiten Etappe Basis zu halten, verwenden Sie eine andere Zange auf den Bauch in der Nähe der 1. Bauch-Sternit packen und ziehen Sie den Bauch ab. </li><li> Um den VNC aus den umliegenden thorakalen Gewebe zu entfernen. Halten Sie den Oberarmkopf mit einer Pinzette und mit einer anderen Pinzette sanft losreißen die Mehrheit der Brust-Karkasse. </li><li> An diesem Punkt sollte es einen Ring aus Bindegewebe um den zervikalen Bindegewebe (Hals) werden. Mit zwei Zangen reißen den Ring auseinander. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Brust-Gewebe um den VNC </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Gehirn-und VNC auf 9-und Pyrex Schüssel mit 1X PBS auf Eis <ol><li> Eine silikonisierte P200 Pipettenspitze kann verwendet werden, um zu vermeiden das Trocknen des Gewebes werden </li></ol></li></ol></li><li> * Fix der erwachsenen ZNS für 1 Stunde in 4% PFA auf Eis und wäscht mit eiskaltem PBS und 3X mit PBT 3X. </li><li> Inkubieren Sie die erwachsenen ZNS Vorbereitung oder die Larven ZNS und Körper Wand bei 4 ° C über Nacht mit Antikörpern entweder Neuronen (anti-Elav, 1:10) oder Gliazellen (anti-Repo. 1:10). Waschen Sie die Vorbereitung 5X mit PBT. </li><li> Inkubieren mit Erwachsenen oder Larven-Vorbereitung mit Alexa 594 Hühner gegen Maus Sekundär-Antikörper (1:100) bei Raumtemperatur für 2 Stunden, und waschen Sie das Präparat mit PBS. </li><li> Montieren Sie die Larve oder das adulte ZNS auf einer Folie. Zur Erhaltung der natürlichen Form des ZNS, verwenden Sie einen O-förmigen Kunststoff-Ring (Clear Reinforcement Label, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) auf der Folie als Mini-Brücke zum Deckglas auszusetzen. </li><li> Untersuchen Sie die Vorbereitung für GFP und Elav (oder Repo) Expressionsmuster unter einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> 4. Die Anwendung von zwei sich ergänzenden GAL80-Converting-Werkzeuge der Repression Gal4 in Photorezeptoren <ol><li> Flipping GAL80 erfolgt über Wanne P&gt; GAL80&gt; (Abbildung 5A). <ol><li> Sammeln Männchen von den GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; GAL80&gt; Linie. Beachten Sie, dass die Facettenaugen sind normal in diesen Fliegen. </li><li> Mate mit ey-FLP Jungfrauen. </li><li> Sammeln Sie die F1 Fliegen und untersuchen das Auge Phänotyp. </li></ol></li><li> Flipping GAL80 in über Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 (Abbildung 5B). <ol><li> Sammeln GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 männlichen Fliegen und untersuchen das Auge Phänotyp. Beachten Sie die entarten und depigmented Augen in diese Fliegen zu Wildtyp-Stämme (Canton-S) im Vergleich </li><li> Mate mit ey-FLP Jungfrauen; </li><li> Sammeln Sie die F1 Fliegen und untersuchen das Auge Phänotyp. </li></ol></li><li> Wählen ET-FLPx2 Linien mit Ausdruck in Sehzellen </li></ol> Schritte 4.1 und 4.2 kann wiederholt werden, mit ET-FLPx2 Linien sein, dass ausdrückliche FLP in einer Untergruppe von Sehzellen. Alternativ entweder der GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Fliegen oder GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; GAL80&gt; Fliegen können die einzelnen ET-FLPx2 Zeilen-Bildschirm für Linien überschritten, die zum Ausdruck FLP in Sehzellen. Wertvolle ET-FLPx2 Linien sind diejenigen, die nur ausdrücken FLP in einer Untergruppe oder einzelne Sehzellen (Abbildung 6). 5. Repräsentative Ergebnisse Das Expressionsmuster von einer bestimmten ET-FLPx2 Linie kann leicht überprüft und dokumentiert in der F1-Larven oder erwachsenen Fliegen aus der Kreuzung zwischen yw, Aktin P abgeleitet&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP Jungfrauen und ET-FLPx2 Männer (Abbildung 1) . Typischerweise repliziert drei vor fünf der F1-Tiere werden seziert und untersucht, um die Reproduzierbarkeit der FLP Expressionsmuster (Bohm et al., 2010) zu bestimmen. (Abb. 3 und 4). Die Ergebnisse in Abbildung 7 zeigen die Wirksamkeit von GAL80 Flip-in-und Flip-out-Systeme in intersectional Verdrängung der Gal4 folgenden FLP-vermittelte Rekombination. Die Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Konstrukt scheint nicht alle undichten Ausdruck GAL80 (basierend auf den einheitlichen Degeneration und Depigmentierung von Photorezeptoren) haben, und doch ist es 100% effektiv in Spiegeln GAL80 in mit Hilfe von eyFLP zu unterdrücken GMR- Gal4 und zur Wiederherstellung der Blick auf normale Erscheinungen (Abb. 7A). Im Gegenteil, Badewanne P&gt; GAL80&gt; voll unterdrückt GMR-Gal4 vor der Einführung von eyFLP. Nach GAL80 Flip-out,, GMR-Gal4-Laufwerke UAS-polyQ Ausdruck, was zu entarten und depigmented Augen (Abb. 7B). In diesem Beispiel verwendeten wir ein pan-photorecetor FLP zu dem Fotorezeptor "Schaltungen" Karte, aber nicht untersuchen die Auswirkung auf das Verhalten. Mit ähnlichen Ansätzen mit verhaltensrelevanter Gal4 Linien, wir Teil der CCAP-Gal4 Schaltung abgebildet Regulierung Flügel Expansion in erwachsenen Fliegen (Bohm et al., 2010). Wir glauben, dass die FINGR Methode wird bei der Unterstützung von unserem Verständnis der neuronalen Grundlagen von Verhalten wertvoll. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. . Untersuchung des Expressionsmusters eines ET-FLPx2 line Das FLP Expressionsmuster (blau Ovale) von einem ET-FLPx2 Linie kann durch Überschreiten einer ET-FLPx2 männlichen (oben links) mit einem Aktin-P&gt; CD2&gt; Gal4 bestimmt werden; UAS- GFP Jungfrau (oben rechts). Ubiquitous Aktin P&gt; Gal4 Ausdruck in der elterlichen Weibchen ist durch die Einfügung der FRT (graue Dreiecke) flankiert CD2 Folge behindert. In der F1-Nachkommen, wird FLP Verbrauchsteuern die CD2-Sequenz erlaubt Aktin P&gt; Gal4 zu UAS-GFP-Expression zu fahren. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Expression Muster einer ET-FLPx2 Linie in der larvalen und adulten Zentralnervensystems. Diese Bilder zeigen das ZNS (Gehirn und Bauchmark, VNC) aus dem Nachwuchs von der Paarung yw, Aktin P produziert seziert&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP Eltern auf die ET-FLPx2 173A Linie. Durch Rekombination aus dem&gt; CD2&gt; Kassette, aktiviert FLP Aktin P&gt; GAL4 Ausdruck (die konsequente Ausdruck der UAS-GFP). Daher meldet der GFP-Muster FLP-exprimierenden Zellen. Panel A zeigt die Larven FLP Expressionsmuster während Panel B zeigt die Erwachsenen Expressionsmuster in line 173A. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Charakterisierung von Zelltypen, die Flippase Ausdruck in ET-FLPx2 Line # 688A. A, A Composite-Bild von einem festen F1 3 rd instar Larve mit anti-REPO aus einer Kreuzung zwischen ET-FLPx2 Zeile # 688A und ein GFP Flippase Berichtslinie gefärbt. BD, A hoher Vergrößerung (Zeiss Plan-Apochromat 63x Öl) Blick aus dem hinteren Ende eines VNC von einem 3 rd Larvenstadium übernommen. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Charakterisierung von Zelltypen innerhalb der Pilzkörper von ET-FLPx2 Line # 150. AC, A hoher Vergrößerung Bild (63x Öl-Immersion) der Pilzkörper von einem festen F1 dritten Larvenstadium Larve mit anti-REPO gefärbt. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Illustration von GAL80 Flip-in und Flip-out-Strategien. A. In den Flip-out-Strategie, Tubulin-Promotor angetrieben GAL80 (Tub P&gt; GAL80&gt;) ist konstitutiv aktiv, was die Unterdrückung der GMR-Gal4 und einem Wildtyp-Augen-Phänotyp (rote Augen). Diese Repression ist durch die Einführung von FLP (violett), die GAL80 out (Mitte, rot) Flip und ermöglichen es GMR-Gal4 zu UAS-polyQ Ausdruck Laufwerk entfernt. Dies führt in Photorezeptorzelle Degeneration (dargestellt durch weiße Punkte im Auge). B. In der reziproke Wert der bisherigen Strategie, ist Tubulin-Promotor angetrieben GAL80 Ausdruck von FRT (graues Dreieck) flankiert "Stop"-Codon unterbrochen. In Abwesenheit von GAL80 bindet GMR-Gal4 zu UAS-polyQ verursacht neuronale Degeneration in Photorezeptoren (dargestellt durch weiße Punkte im Auge). Nach der Überquerung der GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Männchen mit jungfräulichen Weibchen, die FLP auszudrücken in der Sehzellen, FLP (violett) wird Rekombination am FRT Websites katalysieren, Ausschneiden der "Stop"-Codon (Mitte, rot), so dass für GAL80 Meinungsäußerung und der GMR-Gal4. Dieser behält die Neurodegeneration in Sehzellen (dargestellt durch den Mangel an white Punkte im Auge). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Die Anwendung der Methode in FINGR Spiegeln GAL80 erfolgt mit ET-FLPx2 Line # 688A F1-Nachkommen aus einer Kreuzung zwischen ET-FLPx2 Zeile # 688A Jungfrau GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP&gt; GAL80 männlich. Das Fehlen von Pigment in der Mitte des Auges Ommatidia stellt FLP Ausdruck in Zeile # 688A. In diesem Bereich GAL80 Unterdrückung von GMR-Gal4 war erleichtert, so dass die Gal4 zu UAS-polyQ fahren. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Die Anwendung der Methode in FINGR Spiegeln GAL80 in oder out zu Gal4 in Photorezeptoren schneiden. A. Die Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Flip-in-System beschränkt GAL4 Ausdruck in einer FLP-abhängigen Weise. In GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Fliegen, Sehzellen sind entartet und depigmented (links fliegen). Nach der Einführung der eyFLP ist GAL80 in Photorezeptor-Zellen exprimiert, was zu einem vollen Unterdrückung von GMR-Gal4, die wiederum schaltet den Ausdruck polyQ und produziert Fliegen mit normalen Augen (rechts fliegen). B. Die Wanne P&gt; GAL80&gt; flip -out-System funktioniert in umgekehrter Weise, wie die Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Flip-in-System. Tub P&gt; GAL80&gt; konstitutiv reprimiert GAL4 und unterdrückt die Expression von polyQ (links fliegen, mit normalen Augen). Nach der Einführung der eyFLP ist GAL80 ausgeflippt von Sehzellen, entlastet die Unterdrückung der GMR-Gal4 und Drehen auf die Expression polyQ. Dies führt zu Fliegen mit degenerierten und depigmented Augen (rechts fliegen).

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</ol>

Die Gal4/UAS System wurde vielfach und erfolgreich durch Drosophilists für verschiedene biologische Studien (; Duffy, 2002 Brand &amp; Perrimon, 1993) verwendet. Bis heute hat die Fliege-Community Tausende von Promotor-driven und Enhancer-trap Gal4 Linien erzeugt. Eine wesentliche Stärke des FINGR Methode ist, dass es mit dem Gal4/UAS ist, die es ermöglichen, deutlich erweitern die Macht der Gal4 in Drosophila-Studien. Eine wichtige Anwendung der FINGR Methode ist die Feinabstimmung neuronalen Schaltkreisen zugrunde liegende Verhalten durch Gal4/Gal80 Kreuzung. Diese Verhaltensweisen können beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Lernen und Gedächtnis, Balz, Schlaf und zirkadiane Rhythmik beschränkt. Die FINGR Methode kann auch verwendet werden, um die kritische Neuronen, die anfällig für Neurodegeneration bei der Modellierung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), und der Parkinson-Erkrankungen sind abzubilden. In ähnlicher Weise könnte Brennpunkte von Neuronen oder neuronalen Schaltkreisen entscheidend für die Vermittlung von Kokain, Alkohol und andere Substanzabhängigkeit abgebildet mit dem FINGR Methode. Anzumerken ist, dass bedingte Gal4s (Osterwalder et al, 2001..; Roman et al, 2001) werden mit dem FINGR Methode könnte benutzt werden, um zeitliche Steuerung der neuralen Schaltkreisen und Verhaltensweisen zu erlangen. Änderung des GAL80-converting-Tools mit einem temperaturempfindlichen GAL80 (GAL80 ts, McGuire et al., 2003) produzieren kann Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 ts oder Badewanne P&gt; GAL80 ts&gt;, Hinzufügen weiterer zeitlicher Flexibilität in der Schaltung Manipulation. Jenseits des Nervensystems ist die FINGR Methode gleichermaßen für die Beschränkung Gal4 Ausdruck in Teilmengen von Zellen, ob es die Flügel oder das Bein. Die ET-FLPx2 Linien eine wertvolle Ressource für alle Drosophila Biologen in FRT / FLP-basierte klonale Analyse (Xu &amp; Rubin, 1993), einschließlich MARCM (Lee &amp; Luo, 1999) interessiert sein. Es wird auch erwartet, dass einige ET-FLPx2 Linien können Hitzeschock-FLP für die Herstellung von reproduzierbaren Klonen und für die wiederholte morphologischen und Verhaltensanalysen zu ersetzen. Wie Enhancer-trap Gal4-Linien sind die meisten ET-FLPx2 Linien unwahrscheinlich, dass speziell in den Zellen ein Interesse ausgedrückt werden. Die meisten Linien werden FLP in die Zellen von Interesse und in anderen Zellen oder Geweben, wie gut ausdrücken. Allerdings wird der Mangel an &quot;Gewebsspezifität &#39;der beiden Gal4 und ET-FLPx2 nicht ein wichtiges Anliegen für die FINGR Methode, solange ihre überlappenden Bereich wünschenswert für ein bestimmtes Experiment ist. FINGR wurde entwickelt, um zwei &quot;großen&quot; Systemen in einer raffinierten eine Umdrehung. Die Methoden in diesen Protokollen dargestellt sind eher Standard und sollte reproduzierbar sein. Die wichtigsten Vorsichtsmaßnahmen Schritte, die die Aufmerksamkeit erfordern, sind die Auswahl und Nutzung der Fixateur. Fixative andere als PFA sollte vermieden werden, da sie GFP Signal auslöschen werden. Wir haben auch festgestellt, dass die Dissektion Gericht sollte nicht zur Fixierung mit PFA verwendet werden, um die Möglichkeit, dass FLP Ausdruck nicht zuverlässig von GFP gemeldet werden vermieden.

mapping und anwendung von enhancer-trap flippase expression in larven und erwachsene drosophila cns

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Die Gal4 / UAS binären Methode ist mächtig für die Gen-und neuronalen Schaltkreisen Manipulation in Drosophila. Für die meisten neurobiologischen Studien ist jedoch Gal4 Ausdruck selten Gewebe-spezifisch genug, um für eine präzise Korrelation der Schaltung mit Verhaltensproblemen Auslesen zu ermöglichen. Zur Überwindung dieser großen Hürde haben wir vor kurzem entwickelte die FINGR Methode zu einer restriktiveren Gal4 Ausdruck in das Gewebe von Interesse zu erreichen. Die FINGR Methode besteht aus drei Komponenten: 1) die traditionelle Gal4/UAS System, 2) eine Reihe von FLP / FRT-vermittelte GAL80 Konvertierungstools, und 3) Enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 wird verwendet, um die primären neuronalen Schaltkreise von Interesse zu definieren. Vergleich der Gal4 mit einem UAS-Effektorzellen, wie UAS-MJD78Q oder UAS-Shi ts, regelt die neuronale Aktivität, die wiederum durch Veränderungen in-the-fly Verhalten manifestiert. Mit einem zusätzlichen UAS-Reporter wie UAS-GFP, die neuronalen Schaltkreis in das spezifische Verhalten Beteiligten können gleichzeitig für die morphologische Analyse zugeordnet werden. Wanne P&gt; GAL80&gt; (&quot;flip out&quot;) und Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 (&quot;Flip-in &#39;):. Für Gal4 Linien mit breiten Ausdruck kann Gal4 Ausdruck mithilfe zweier komplementärer GAL80-converting-Tools beschränkt werden Schließlich können die Ermittler wiederum GAL80-oder ausschalten, bzw. mit Hilfe von Gewebe-spezifischen ET-FLP. In den Flip-in-Modus, GAL80 wird Gal4 Ausdruck, wo Gal4 und ET-FLP schneiden zu unterdrücken. In den Flip-out-Modus, wird GAL80 entlasten Gal4 Repression in Zellen, in denen Gal4 und FLP überlappen. Beide Ansätze ermöglichen die Beschränkung der Anzahl der Zellen in der Gal4-Schaltung definiert, sondern in einer inversen Muster. Die FINGR Methode ist kompatibel mit dem riesigen Sammlung von Gal4-Linien in-the-fly-Community und vielseitig einsetzbar für traditionelle klonale Analyse und neuronalen Schaltkreis-Mapping. In diesem Protokoll, zeigen wir die Zuordnung von FLP Expressionsmuster in ausgewählten ET-FLPx2 Linien und die Wirksamkeit der Methode FINGR in Sehzellen. Das Prinzip der FINGR Methode sollte auch auf andere genetische Modellorganismen in der Gal4/UAS, GAL80 und FLP / FRT verwendet werden.

Wir beschreiben ein Flippase-induzierte intersectional Gal80/Gal4 Repression (FINGR)-Methode, so dass Gewebe-spezifische FLP zu GAL80 Expressionsmuster zu bestimmen. Überall dort, wo Gal4 und FLP überlappen, wird Gal4 Ausdruck eingeschaltet (GAL80 ausgeflippt) oder aus (GAL80 gespiegelt in). Die FINGR Methode ist vielseitig für klonale Analyse und neuronalen Schaltkreis-Mapping.

Mapping und Anwendung von Enhancer-trap Flippase Expression in Larven und Erwachsene Drosophila CNS

Die Gal4/UAS-Binärmethode ist ein leistungsfähiges Instrument zur Manipulation von Genen und neuronalen Schaltkreisen in Drosophila. Für die meisten neurobiologischen Studien ist Gal4 jedoch ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die GAL4-Expression durch die Verwendung eines gewebespezifischen Lipases in Kombination mit GAL80-Umwandlungswerkzeugen zu verfeinern. Dies wird erreicht, indem eine Sammlung von Enhancer-Trap-Philippe-transgenen Fliegenlinien erzeugt und das Expressionsmuster der Lipase im zentralen Nervensystem (ZNS) in jeder Linie bestimmt wird. Mithilfe einer GFP-Reporter-Immunchemie und GFP-Berichtssystemen können GL- von neuronaler Expression unterschieden werden, um die GAL4-Expression in den interessierenden ET-flip-Linien bei den Nachkommen der Fliegen, die ein GAL80-Umwandlungswerkzeug enthalten, zu überlappen.Mithilfe der klonalen Analyse kann die Verfeinerung der GAL4-Expression, beispielsweise im Auge, untersucht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass Enhancer-Trap-Linien in Kombination mit GAL80-konvertierenden Werkzeugen verwendet werden können, zusammen mit einer umfangreichen Sammlung bereits in der Fliegen-Community verfügbaren GAL4-Linien. Zudem kann dieses Konzept auf andere GAL4/UAS-Modellorganismen wie Zebrafische erweitert werden.Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen bei der Kartierung neuronaler Schaltkreise, die Verhaltensweisen zugrunde liegen, zu beantworten. Obwohl dieses Protokoll die Verwendung von Flip-Basen in einer Untermenge von Photorezeptorzellen demonstriert, kann die intersectionelle Methode auch zur Analyse anderer Gewebe, einschließlich nicht-neuronaler Gewebe, angewendet werden. Sofern mehr Enhancer-Trap-Lipase-Linien charakterisiert werden.Gout vier US ist eine wichtige Technik, die weit verbreitet von Fliegenbiologen verwendet wird. Ein Nachteil der meisten GAL-vier-Linien ist, dass sie zu breit exprimiert werden, um mit den Fingermethoden für die Abbildung von Gehirnverhalten eingesetzt zu werden. Es ist nicht möglich, die GAL-vier-Expression in interessierenden T-Shirts feinabzustimmen, bevor man ein ET-Flip-Transgen verwendet, um die Expression von GAL-vier-Expressionslinien teilweise einzuschränken.Zunächst ist es hilfreich, das Expressionsmuster des ET flip x zwei-Transgens in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien der Larven und bei Erwachsenen zu kennen, um die Expression von flip a im ZNS zu visualisieren. Stellen Sie eine Kreuzung zwischen Männchen mit dem ET flip X zwei-Transgen von Interesse und jungfräulichen Weibchen her, die einen GFP-Reporter für die et flip-Expression enthalten. Sammeln Sie wandernde F1-Larven des dritten Instars für die Präparation. Geben Sie sie in eine saubere S-Schild-Dish, entfernen Sie Verunreinigungen mit einem Pinsel und spülen Sie die Schale einmal mit 1× PBS aus.Füllen Sie die Petrischale nun mit eiskaltem 1× PBS, um die Larven zu betäuben, um Zugang zum ZNS zu erhalten. Halten Sie den Mundhaken einer Larve mit einer Pinzette fest. Greifen Sie das Cuticula in der Nähe der vorderen sphärischen Ausstülpung und ziehen Sie es zurück. Das ZNS bleibt zusammen mit einigen anderen Strukturen am Mundhaken haften.Entfernen Sie nun mit einer Pinzette alle überschüssigen Strukturen, die das ZNS umgeben, während Sie das ZNS präparieren. Überführen Sie sie einzeln in eine dreigeteilte Pyrex-Schale, gefüllt mit PBS. Sobald alle ZNS präpariert sind, fixieren Sie sie, indem Sie sie vollständig in 200 Mikroliter 4 % PFA auf Eis eintauchen.Falls ein ZNS schwimmt, wurde es nicht vollständig von dem umgebenden Gewebe befreit. Sollte dies der Fall sein, verwenden Sie eine Pinzette, um das ZNS erneut in das Fixativ einzutauchen, nachdem es 15 Minuten fixiert wurde. Waschen Sie das Gewebe dreimal mit eiskaltem PBS und anschließend noch dreimal mit eiskaltem PBT. Das Gewebe ist nun bereit, entweder abgebildet oder mit Antikörpern markiert zu werden, oder kann bei vier Grad Celsius in PBT für spätere Analysen aufbewahrt werden.Färbung aus demselben Kreuz, das verwendet wurde, um Larven zu sammeln, um F1-Erwachsene vor der Dissektion zu erhalten. Fünf bis zehn Fliegen untergetaucht und 30 Sekunden lang in 95 % Ethanol gekühlt, um das Wachs auf der Oberfläche der Cuticula zu entfernen. Um das Ethanol zu entfernen, die erwachsenen Fliegen dreimal mit eiskaltem 1× PBS gewaschen und nach dem dritten Waschgang eine davon in eine 35-Millimeter-Silikon-Schutzschale überführt, die mit eiskaltem 1× PBS gefüllt ist, um einen Erwachsenen für die Dissektion vorzubereiten.Platzieren Sie es mit der Bauchseite nach oben und stechen Sie eine Minion-Nadel in die Mitte des Abdomens. Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie mit einer Pinzette die Beine entfernen. Entfernen Sie dann die Kopfkutikula, indem Sie den Kopf an den Vorderbeinen fixieren und gleichzeitig die Kutikula von unterhalb des Auges in Richtung Oberseite des Kopfes ablösen.Entfernen und verfolgen Sie vorsichtig mit einer geschärften Pinzette das umliegende Gewebe des Gehirns, da dieses Gewebe eine starke Autofluoreszenz aufweist und das Gehirn während der Fixierung zum Schwimmen bringen kann. Das Gehirn ist nur ein Teil des adulten zentralen Nervensystems. Der andere Teil ist die ventrale Nervenkordel oder VNC im Thorax, die ebenfalls disseziert werden muss.Zuerst wird das thorakale Cuticula entfernt, indem die Fliege am Ansatz des Hinterbeins fixiert und das thorakale Cuticula vorsichtig bis zum Halsansatz abgezogen wird. Danach wird das VNC freigelegt, indem die beiden Hälften des thorakalen Cuticula vorsichtig auseinandergezogen werden. Anschließend wird der Abdomen vom Thorax getrennt, indem am Ansatz des zweiten Beins fixiert und der Abdomen nahe der ersten abdominalen Stirnrippe abgezogen wird.Viertens reinigen Sie das VNC, indem Sie im humeralen Bereich fixieren und vorsichtig das das VNC umgebende Gewebe abtrennen. Lösen Sie den Ring aus Bindegewebe um die Halsverbindung und entfernen Sie weiterhin überschüssiges Gewebe, während Sie das Gehirn sammeln. Überführen Sie das Gehirn und das VNC dann wie Birnen in eine 9-Loch-Pyrex-Schale, die mit gekühlter 1×-PBS gefüllt ist und auf Eis steht.Um die erwachsenen Gewebe zu fixieren, tauchen Sie diese für 15 Minuten in 4 % PFA auf Eis ein. Anschließend führen Sie drei Waschungen mit eiskaltem PBS und drei Waschungen mit PBT durch. Das Gewebe ist nun bereit, entweder direkt bildgebend untersucht oder mit Antikörpern markiert zu werden, um die Transgenexpression genau analysieren zu können.Es ist sinnvoll, das zentrale Nervensystem mit neuronalen oder glialen Markern zu markieren, um eine Referenzgrundlage zu schaffen. Beginnen Sie damit, das Gewebe am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius mit Antikörpern gegen Neuronen oder Gliazellen zu inkubieren. Spülen Sie die Probe danach fünfmal mit PBT und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei Raumtemperatur mit dem fluoreszierenden Sekundärantikörper. Wickeln Sie die Platte in Folie, um eine Photobleiche des Antikörpers zu verhindern, sobald die Inkubation abgeschlossen ist.Spülen Sie die Präparation mit PBS und montieren Sie sie ganz auf einen Objektträger. Verwenden Sie einen OSHA-Kunststoffring, um zu verhindern, dass das Gewebe durch die Deckglasplatte zerdrückt wird. Das Nervensystem ist nun bereit, unter einem Fluoreszenzmikroskop auf GFP- und LL-Expressionsmuster untersucht zu werden.Üblicherweise werden drei bis fünf Wiederholungen untersucht, um die Reproduzierbarkeit des Flip-Expressionsmusters zu bestimmen. Das Expressionsmuster von flip in der flip-Linie kann zusammen mit anderen Transgenen verwendet werden, um die Expression des GAL4-Repressors GAL80 zu verändern. Die Modulation der GAL80-Repressor-Expression ist eine wirksame Methode, um Veränderungen vorzunehmen.Bei der GAL4-Expression besteht eine Methode darin, die GAL80-Expression durch eine Transgen-vermittelte GAL80-Expression auszuschalten, wodurch GAL4 inaktiviert wird, welches andernfalls eine Degeneration des Auges im gesamten Auge verursacht. Die ET-Flip-Linie mit der Kennung 688A wird hier verwendet, um die Effektivität des GAL80-Umschaltwerkzeugs in einer Teilmenge der Photorezeptoren in der F1-Nachkommenschaft zu bewerten und den Augenphänotyp mit dem der Elternstämme zu vergleichen. Jede sichtbare Augenverformung oder Entfärbung bestätigt, dass das Umschaltmuster in den Photorezeptoren vorliegt und der GAL80-Flipout erfolgreich war.Eine komplementäre, nicht redundante Strategie besteht darin, die Expression von GAL80 mithilfe derselben interessierenden Flip-Linie einzuschalten. Diese Strategie ähnelt stark der anderen, jedoch wird nun die Pigmentierung und Degeneration in der F1-Nachkommenschaft unterdrückt. In Flip X zwei.Expression von Photorezeptoren: Sobald die Präparation des ZNS beherrscht ist, kann sie bei Erwachsenen in etwa fünf Minuten und bei Larven in einer Minute durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, scharfe Pinzetten zu verwenden, um die Tracheen und das umgebende Gewebe sowohl von erwachsenen als auch von larvalen C- und Ss-Zellen zu entfernen. Für die Präparation sollte eine fixativfreie Schale verwendet werden. Der Hitzeschock-Flip wird derzeit zur Erzeugung zufälliger Klone eingesetzt.Im Gegensatz dazu ermöglicht der Enhancer-Trap-Flop die Erzeugung reproduzierbarer Klone, wodurch die morphologische und verhaltensbezogene Analyse erleichtert wird. Eine weitere Stärke der Finger-Methode besteht darin, dass man die GAL4-Expressionsmuster durch den Einsatz zusätzlicher Enhancer-Trap-Flop-Linien und anderer GAL-Linien weiter einschränken kann. Ein Nachteil der Tubulin-Stop-GAL80-Konfiguration ist, dass bestimmte Kombinationen von GAL4 und UAS-Effektoren, wie beispielsweise LAG4 und UAS-KIR, nicht kompatibel sind, da sie die Fliegen töten würden.Dieses Problem kann leicht durch die Verwendung eines bedingten UAS-Effektors wie UAS Shiri Ts überwunden werden, der es ermöglicht, ein Verhalten bei restriktiven Temperaturen zu untersuchen. Wie erwartet werden nicht alle Enhancer-Trap-Lipase-Linien ausreichend hohe Lipase-Spiegel exprimieren, um nützlich zu sein. Dennoch bietet die hier beschriebene Fingertechnik einen neuen Ansatz für Drosophila-Forscher, die Mosaik-Analyse entweder für Entwicklungsschaltkreise oder für Verhalten zu verfeinern.

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Mapping und Anwendung von Enhancer-trap Flippase Expression in Larven und Erwachsene Drosophila CNS

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