Mapping und Anwendung von Enhancer-trap Flippase Expression in Larven und Erwachsene Drosophila CNS

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die GAL-4-Expression durch die Verwendung von gewebespezifischer Lipase mit GAL 80-Converting-Werkzeugen zu verfeinern. Dies wird durch die Generierung einer Sammlung von transgenen Fliegenlinien der Enhancer-Falle Philippe und die Bestimmung des ZNS-Expressionsmusters der Lipase in jeder Linie erreicht. Unter Verwendung eines GFP-Reporters können IMMUNOCHEMISTRY und GFP-Berichte GL von der neuronalen Expression unterscheiden, um die GAL-4-Expression in interessanten Linien zu schneiden, ET-Flip-Linien über die Fliegen zu legen, die ein GAL 80-Konvertierungswerkzeug in den Nachkommen enthalten.

Die klonale Analyse kann verwendet werden, um die Verfeinerung der GAL-4-Expression zu analysieren, z. B. im Auge. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass Enhancer-Track-Play-basierte Lines zusammen mit GAL 80-Konvertierungswerkzeugen mit einer schnellen Sammlung von GAL Four-Allianz verwendet werden können, die bereits in der Fly-Community verfügbar ist. Darüber hinaus kann dieses Konzept auf andere GALI four UAS emerging Model Organismen wie Zebrafische ausgeweitet werden.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Kartierung neuronaler Schaltkreise zu beantworten, die dem Verhalten zugrunde liegen. Obwohl dieses Protokoll die Verwendung von Flip-Base in einer Untergruppe von Photorezeptorzellen demonstriert, kann die intersektionale Methode auf die Analyse anderer Gewebe, einschließlich nicht-neuronaler Gewebe, angewendet werden. Je mehr Enhancer, desto mehr fallen Lipaselinien ein.

Gicht vier US ist eine wichtige Technik, die von Fliegenbiologen weit verbreitet ist. Ein Nachteil der meisten vier GAL-Linien ist, dass sie zu breit ausgedrückt werden, um für die Verhaltenskartierung des Gehirns mit den Fingermethoden verwendet zu werden. Es ist nicht möglich, die GAL-Four-Expression in T-Shirts von Interesse zu optimieren, bevor ein ET-Flip-Transgen verwendet wird, um die Expression von GAL-4-Mimikfalten teilweise einzuschränken.

Es ist zunächst hilfreich, das Expressionsmuster von ET flip x zwei Transgen im späten Stadium der sich entwickelnden Lava zu kennen und bei Erwachsenen die Expression von flip a zu visualisieren. Im ZNS wurde eine Kreuzung zwischen Männchen mit dem ET t flip X zwei Transgen von Interesse und jungfräulichen Weibchen, die einen GFP-Reporter für die et flip-Expression von Nachkommen beherbergen, gebildet. Sammle wandernde dritte F1-Larven zum Sezieren. Legen Sie sie in eine saubere S-Guard-Schüssel, entfernen Sie alle Ablagerungen mit einem Pinsel und spülen Sie die Schale einmal mit PBS aus.

Füllen Sie nun die Schale einmal mit eiskaltem PBS, um die Larven zu betäuben, um Zugang zum ZNS einer Lava zu erhalten, halten Sie ihren Mundhaken mit einer Pinzette. Fassen Sie die Nagelhaut in der Nähe der sich ausdehnenden vorderen Kugel und schälen Sie sie zurück. Das ZNS bleibt zusammen mit einigen anderen Strukturen am Maulhaken befestigt.

Entfernen Sie nun mit einer Pinzette alle überschüssigen Strukturen, die das ZNS umgeben, während Sie das ZNS präparieren. Übertragen Sie sie einzeln in eine mit PBS gefüllte Drei-Welten-Pyrex-Schale. Sobald alle ZNS präpariert sind, fixieren Sie sie, indem Sie sie vollständig in 200 Mikroliter 4%PFA auf Eis tauchen.

Wenn ein ZNS schwimmt, wurde es nicht vollständig von dem gesamten umgebenden Gewebe gereinigt. In diesem Fall tauchen Sie das ZNS nach 15-minütiger Fixierung mit einer Pinzette wieder in das Fixiermittel ein, waschen Sie das Gewebe 3 Mal mit eiskaltem PB S3 und waschen Sie das Gewebe dann noch drei Mal in eiskaltem PBT. Das Gewebe ist nun bereit, abgebildet oder mit Antikörpern markiert oder in PBT bei vier Grad Celsius für später gelagert zu werden.

Färbung aus derselben Kreuzung, die verwendet wird, um Larven dazu zu bringen, F1-Erwachsene vor der Sektion zu sammeln. Tauchen Sie fünf bis 10 Fliegen ein und kühlen Sie 95%iges Ethanol für 30 Sekunden, um das Wachs auf der Oberfläche der Nagelhaut zu entfernen. Um das Ethanol zu entfernen, waschen Sie die Erwachsenen dreimal mit eiskaltem PBS und nach dem dritten Waschgang geben Sie einen von ihnen in eine 35-Millimeter-Silguard-Schale, die einmal mit eiskaltem PBS gefüllt ist, um einen Erwachsenen für die Dissektion vorzubereiten.

Platzieren Sie ihn mit der Bauchseite nach oben und führen Sie einen Minion-Stift in der Mitte des Bauches ein. Beginnen Sie mit dem Präparieren, indem Sie die Beine mit einer Zange entfernen. Entfernen Sie dann die Nagelhaut, indem Sie den Kopf an den Stützen befestigen und gleichzeitig die Nagelhaut unter dem Auge in Richtung Oberkopf schälen.

Verwenden Sie vorsichtig eine geschärfte Pinzette, entfernen und verfolgen Sie Ihr Gewebe, das das Gehirn umgibt, da die Spur Ihres Gewebes eine starke Autofluoreszenz aufweist und das Gehirn während der Fixierung schweben lässt. Das Gehirn ist nur ein Teil des erwachsenen ZNS. Der andere Teil ist der ventrale Nervenstrang oder VNC im Thorax und muss ebenfalls präpariert werden.

Entfernen Sie zunächst die Brustschuppenschicht, indem Sie den Hosenschlitz an der Basis des Hinterbeins befestigen und die Brustschuppenschicht vorsichtig bis zum Halsansatz abziehen. Zweitens, um das VNC freizulegen, spreizen Sie vorsichtig die beiden Hälften der Brustschuppenschicht. Drittens, entfernen Sie den Bauch vom Thorax, indem Sie ihn an der Basis des zweiten Beins befestigen und den Bauch in der Nähe der ersten Bauchrührung wegziehen.

Viertens, reinigen Sie den VNC, indem Sie ihn im Humerusbereich befestigen und das Gewebe, das den VNC umgibt, vorsichtig abreißen. Reißen Sie den Ring aus Bindegewebe, der das zervikale Bindegewebe umgibt, auseinander und entfernen Sie weiterhin überschüssiges Gewebe, während Sie das Gehirn entnehmen. Und VNC überträgt sie als Birnen in eine Neun-Welten-Pyrex-Schale, gefüllt mit gekühltem PBS, das auf Eis gehalten wird.

Um das Gewebe der Erwachsenen zu fixieren, tauchen Sie es 15 Minuten lang in 4%PFA auf Eis. Nach dem Bad drei eiskalte PBS-Waschungen und drei PBT-Waschmaschinen durchführen. Das Gewebe ist nun bereit, abgebildet oder mit Antikörpern markiert zu werden, um die Transgenexpression genau zu analysieren.

Es ist nützlich, das ZNS mit neuronalen oder glialen Markern zu markieren, um einen Bezugsrahmen zu schaffen: Beginnen Sie damit, das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius mit Antikörpern gegen Neuronen oder Gliazellen am nächsten Tag zu inkubieren. Das Präparat wird fünfmal mit PBT gewaschen und mit dem fluoreszierenden Sekundärantikörper zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Wickeln Sie die Platte und die Folie ein, um ein Photobleichen des Antikörpers zu verhindern, wenn die Inkubation beendet ist.

Waschen Sie das Präparat mit PBS und befestigen Sie das Präparat ganz auf einem Objektträger. Verwenden Sie einen OSHA-Kunststoffring, um zu verhindern, dass das Gewebe durch den Deckglas zerquetscht wird. Das Nervensystem ist nun bereit, unter einem Fluoreszenzmikroskop auf GFP- und LL-Expressionsmuster untersucht zu werden.

In der Regel werden drei bis fünf Replikate untersucht, um die Reproduzierbarkeit des Flip-Expressionsmusters zu bestimmen. Das Expressionsmuster von flip in the flip, einer Linie, kann zusammen mit anderen Transgenen verwendet werden, um zu ändern, wie der GAL vier Repressor GAL 80 exprimiert wird. Das Ändern des Repressorausdrucks GAL 80 ist eine effektive Methode, um Änderungen vorzunehmen.

Bei der GAL-4-Expression besteht eine Methode darin, die GAL-80-Expression auszuschalten, wobei die Expression von GAL 80 GAL 4 inaktiviert, was ansonsten zu einer Augendegeneration im gesamten Auge führt. Der ET-Flip-Line-Hash 6 88 A wird hier verwendet, um die Wirksamkeit des GAL 80-Converting-Tools in einer Untergruppe von Photorezeptoren in den F1-Nachkommen zu bewerten und den Augenphänotyp mit dem Augenphänotyp der Elternstämme zu vergleichen. Jedes Auftreten von Augendeformität oder Depigmentierung bestätigt, dass das Flip-Expressionsmuster in den Photorezeptoren vorhanden ist und GAL 80 Flipout erfolgreich war.

Eine komplementäre, nicht redundante Strategie besteht darin, den GAL 80-Ausdruck mit der gleichen Flip-Linie von Interesse einzublenden. Diese Strategie ist der anderen sehr ähnlich, aber jetzt wird die ID-Pigmentierung und -Degeneration bei den F1-Nachkommen unterdrückt. Im Flip X zwei.

Exprimierende Photorezeptoren: Sobald die Beherrschung des ZNS abgeschlossen ist, kann die Dissektion des ZNS bei Erwachsenen in etwa fünf Minuten und bei Larven in einer Minute durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine scharfe Pinzette zu verwenden, um die Luftröhre und das Gewebe zu entfernen, das sowohl den Erwachsenen als auch den Libre C umgibt, und Ss.It ist wichtig, eine fixiermittelfreie Schale für die Dissektion zu verwenden. Heat Shock Flip wird derzeit verwendet, um zufällige Klone zu generieren.

Im Gegensatz dazu ermöglicht der Enhancer Trap Flip die Generierung reproduzierbarer Klone, was die morphologische und Verhaltensanalyse erleichtert. Eine weitere Stärke der Fingermethode besteht darin, dass man die Expressionsmuster von GAL vier weiter einschränken kann, indem man zusätzliche Anan-Trap-Flip-basierte Linien und andere Gal-Linien verwendet. Eine Schwäche der Tubulinstopp-GAL 80-Konfiguration besteht darin, dass bestimmte Kombinationen von GA four und UAS-Effektoren wie LAG four und U-A-S-K-I-R nicht kompatibel sind, da sie die Fliegen töten.

Dieses Problem kann leicht durch die Verwendung eines bedingten UAS-Effektors wie UAS Shiri Ts überwunden werden, der es ermöglicht, ein Verhalten bei restriktiven Temperaturen wie erwartet zu untersuchen. Nicht alle Enhancer-Trap-Lipaselinien exprimieren ausreichend hohe Mengen an Lipase, um nützlich zu sein. Nichtsdestotrotz bietet die hier beschriebene Fingertechnik einen neuen Ansatz für Drosophila-Forscher, um die Mosaikanalyse entweder für Entwicklungsschaltkreise oder für das Verhalten zu verfeinern.