Charakterisierung von mehrschichtigen Fischschuppen (

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Struktur, Chemie und mechanischen Eigenschaften mehrschichtiger mineralisierter Fischschuppen durch Röntgen-Computertomographie, nanoindentierte Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie sowie Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die einzelnen Schuppen für die Analyse vorbereitet werden – durch Entfernung des Weichgewebes von den Schuppen, Montage und Einbetten der Schuppen sowie anschließendes stufenweises Polieren. Der zweite Schritt besteht darin, entlang des Querschnitts der Schuppe eine räumlich korrelierte Nanoindentierung mit einer Diamant-Percovich-Spitze durchzuführen, um die lokalen nanomechanischen Eigenschaften zu ermitteln.

Anschließend werden die innere und äußere Schicht der Fischschuppen mit einem FTIR-Mikroskop untersucht, um die Hauptfunktionsgruppen in den jeweiligen Schichten zu identifizieren. Im letzten Schritt erfolgt die Verwendung des EDX-Detektors am Rasterelektronenmikroskop, um die lokale chemische Zusammensetzung mit den in den Fischschuppen erzeugten Nano-Eindrücken zu korrelieren und Bilder der Eindrücke in den verschiedenen Schichten sowie der Bruchflächen aufzunehmen. Letztlich werden durch die Kombination dieser verschiedenen experimentellen Techniken die natürlichen Konstruktionsprinzipien mineralisierter Fischschuppen mittels des Verständnisses der Struktur-Eigenschafts-Beziehungen aufgeklärt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Testverfahren wie der statistischen Nanoindentierung im Makromaßstab besteht darin, dass sie tatsächlich eine direkte Korrelation zwischen chemischer Zusammensetzung, Struktur und lokalen mechanischen Eigenschaften liefert. In interessierenden Bereichen haben wir diese Methode insbesondere angewandt, um die räumliche Verteilung sowie die chemische Zusammensetzung, Struktur und mechanischen Eigenschaften in strukturellen Biomaterialien zu untersuchen. Sie bietet zudem zahlreiche Anwendungen, darunter zementbasierte Materialien, mehrphasige Verbundwerkstoffe und grundsätzlich jegliche Art heterogener Materialien, die eine solche Heterogenität auf mikrometer- und nanometerskaliger Länge aufweisen.

Um eine Querschnittsuntersuchung der kurzen Achse einer Fischschuppe durchzuführen, halten Sie die Fischschuppe in einer Probenform mit 32 Millimeter Durchmesser mithilfe eines handelsüblichen Kunststoff-Probenhalters, um die Probe während des Einbetten in Epoxidharz korrekt auszurichten. Sobald die Probe in der Form fixiert ist, gießen Sie ungehärtetes Epoxidharz auf die Probe. Nachdem das Epoxidharz gemäß den Herstellerangaben gehärtet wurde, schneiden Sie die eingebettete Probe mittig mit einer hochpräzisen Trennsäge mit Diamanttrennscheibe.

Nachdem die Probe in das Nanoindentiergerät geladen und positioniert wurde, verwenden Sie die Software-Steuerung, um die Probe an die Position für die erste Eindrückung zu bewegen, und führen Sie vier parallele Reihen von Eindrückungen im Abstand von 15 µm durch, um an dieser Stelle einen statistisch signifikanten Datensatz zu erhalten. Stellen Sie anschließend das Nanoindentierverfahren auf eine maximale Belastung von fünf Millinewton, Lade- und Entladeraten von 0,1 Millinewton pro Sekunde, eine Haltezeit von 30 Sekunden und einen minimalen Abstand zwischen den Eindrückungen von fünf Mikrometern pro Reihe ein. Sobald der Durchlauf abgeschlossen ist, erzeugt die Hälfte der Nanoindentierungen Markierungseindrückungen (Fiducial Indents) mit einer maximalen Belastung von 100 Millinewton am ersten und letzten Eindruck, die sich jeweils im Epoxidharz vor der Anoebene und nach der Knochenlage befinden sollten.

Nach der Nanoindentierung die Probe zur Vermeidung weiterer Dehydrierung wieder in die PBS-Lösung stellen. Die Probe fest montieren, sodass ihre längste Dimension parallel zum Detektor ausgerichtet ist. Nach dem Einrichten des Scanners die montierte Probe mit Materialien, die für Röntgenstrahlen transparent sind – wie Styropor und Parafom –, am Scannertisch befestigen.

Platzieren Sie die Probe so, dass sie sich im Zentrum der Drehachse befindet. Wählen Sie während des gesamten Scans die höchste Auflösung, bei der die gesamte Skala im Sichtfeld bleibt, in diesem Fall 7,5 µm. Rekonstruieren Sie nach der Datenaufnahme die Röntgenprojektionsbilder, um einen Datensatz mit Querschnittsbildern zu erzeugen.

Verwenden Sie anschließend die Software, um das endgültige 3D-Graustufenbild zu erhalten. Passen Sie den Graustufenbereich auf ein geeignetes Niveau an, um Artefakte aus dem Styropor und dem Paraffin zu entfernen. Für die REM- oder Rasterelektronenmikroskopie-Aufnahme von Nano-Eindrücken auf der polierten Probe befestigen Sie die Probe mit doppelseitigem Kohleband an einem REM-Präparatenträger, wobei die eingedrückte Oberfläche nach oben zeigt. Danach platzieren Sie die Probe in die REM-Kammer und pumpen die Kammer in den Niedervakuummodus.

Stellen Sie den Arbeitsabstand auf einen Wert zwischen 3,0 und 5,0 Millimetern ein. Aktivieren Sie die Hochspannung und navigieren Sie zu den interessierenden Bereichen der Probe, in diesem Fall zu den Strukturen in den Anoe- und Knochenschichten. Erstellen Sie anschließend Bilder bei einer Hochspannung zwischen fünf und 15 Kilovolt und einem niedrigeren Strahlstrom von 3,9 Nanoampere.

Um die Auflösung zu verbessern, erfassen Sie Bilder von mindestens drei interessierenden Bereichen bei 250× bis 10.000× Vergrößerung unter Verwendung des Rückstreuelektronen-(BSE-)Detektors im Niedervakuum, um Veränderungen im Biominalgehalt und in der Dichte identifizieren zu können. Navigieren Sie anschließend zu einem interessierenden Bereich an der polierten Probe, der ein durch Markierungspunkte an den Enden jeder Eindruckreihe gekennzeichnetes Nanoindentionsraster einschließt. Stellen Sie sicher, dass die Hochspannung mindestens 15 Kilovolt beträgt.

Der Strahlstrom beträgt mindestens 3,9 Nanoampere und der Arbeitsabstand ist größer als 5,0 Millimeter. Erfassen Sie dann das Bild der rückgestreuten Elektronen der zu analysierenden Region mithilfe von EDX. Mithilfe der EDX-Analyse-Software.

Nehmen Sie das gleiche Bild auf, um Bereiche zur Durchführung der chemischen Analyse entlang der Reihe von Eindrücken zu identifizieren. Verwenden Sie anschließend die Linienanalysemethode, indem Sie eine Linie entlang der interessierenden Eindruckreihe positionieren, beginnend beim ersten und endend beim letzten Eindruck. Legen Sie die Anzahl der Analysepunkte entlang der Linie fest, wobei dieselbe Anzahl wie die vorhandenen Eindrücke verwendet wird, um eine direkte räumliche Korrelation zwischen der chemischen Zusammensetzung und den mechanischen Eigenschaften zu gewährleisten.

Wenn die Linie korrekt positioniert ist und die Punkte genau festgelegt wurden, starten Sie die Linienanalyse mithilfe der EDX-Software. Nach Abschluss der Linienanalyse identifizieren Sie die interessierenden Elemente, die anhand der entlang der festgelegten Linie auf der polierten Oberfläche der Probe gewonnenen Punktspektren quantifiziert werden sollen.

Nachdem die Elemente von Interesse identifiziert wurden, führen Sie eine Hintergrundkalibrierung durch, um die Bremsstrahlungsstrahlung und andere Effekte zu berücksichtigen. Wählen Sie die Dekonvolutionsanalyse-Option der Software, um eine quantitative Analyse an jedem Punkt entlang der festgelegten Linie durchzuführen und die chemische Zusammensetzung an jeder Stelle zu quantifizieren. Speichern Sie abschließend die Ergebnisse der quantitativen chemischen Analyse zusammen mit dem Bild der analysierten Linie, um eine räumliche Korrelation mit den mittels Nanoindentierung in der Ano-Schicht gemessenen mechanischen Eigenschaften zu erleichtern; die berechnete Nanoindentierung ergab einen durchschnittlichen E-Modul von 69,0 Giga-Pascal und eine Härte von 3,3 Giga-Pascal.

Die Nanoindentierung ergab einen durchschnittlichen E-Modul von 14,3 Giga-Pascal und eine Härte von 0,5 Giga-Pascal für die Knochenschicht. Die ENE- und Knochenschicht weisen quantifizierbare Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung auf. Der Kohlenstoffpeak in der Knochenschicht könnte auf eine geringe Mineralisierung zurückzuführen sein, was zu einem Anstieg des Kohlenstoffgehalts und einer Abnahme der Helligkeit im BSE-Bild führt. FTIR-Spektren der Knochen- und ENE-Schichten zeigen Hydroxylapatit-Signaturen in der äußeren GWE-Schicht und Kollagen-Signaturen in der inneren Knochenschicht.

Die Röntgen-Computertomographie zeigt, dass die Gwe-Schicht die Knochenschicht an den Stellen, an denen sich die Schuppen überlappen, nicht bedeckt. Die helleren grauen Gwe-Schichten sind dichter, härter und steifer, während die dunkleren grauen Knochenschichten weniger dicht und weniger steif sind. In der Nähe des Zentrum der Ging-Schicht sind deutliche Vertiefungen zu erkennen, die deren Unregelmäßigkeit belegen.

Das SEM-Bild mit niedrigerer Vergrößerung der geätzten Bruchfläche zeigte Nanostrukturen, die in einem geschichteten Muster für die Gingiva-Schicht angeordnet sind, was mit den FTIR-Ergebnissen korreliert. Die SEM-Aufnahmen mit höherer Vergrößerung der geätzten Bruchfläche zeigen orientierte Nanostäbe in der Gingiva-Schicht, während in der Knochen-Schicht eine faserartige Nanostruktur nach der Entwicklung beobachtet wird. Diese Technik ebnete den Weg für weitere Forschungsarbeiten an Biomaterialien und Verbundwerkstoffen, um die räumliche Verteilung der chemischen Zusammensetzung, Struktur und mechanischen Eigenschaften zu untersuchen sowie Grenzflächen in mehrphasigen Verbundmaterialien zu analysieren. Gut, nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proben präpariert und Analysen durchgeführt werden, um bei strukturellen Biomaterialien die chemische Zusammensetzung räumlich mit der Struktur und mechanischen Eigenschaften zu korrelieren.

Diese Techniken sind ebenfalls anwendbar und anpassbar, um andere Arten heterogener mehrphasiger Materialien zu untersuchen.