Von Voxel zu Wissen: ein praktischer Leitfaden für die Segmentierung der Elektronenmikroskopie Komplexe 3D-Daten

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, interessante Merkmale aus komplexen 3D-Elektronenmikroskopie-Datensätzen von Zellen und Geweben für die Analyse ihrer 3D-Organisationsnation zu segmentieren. Dies wird erreicht, indem ein Datensatz gesammelt wird, der aus einzelnen elektronenmikroskopischen Bildern besteht. Die 2D-Rohdaten werden dann in ein 3D-Volumen rekonstruiert und gefiltert, um Rauschen zu reduzieren und interessante Merkmale zu verbessern. In einem zweiten Schritt werden die objektiven und subjektiven Eigenschaften der Daten bewertet, um die beste Methode für die Segmentierung zu treffen.

Als nächstes entweder manuell abstrahiert, Modellgenerierung oder manuelle Verfolgung von interessanten Features. Eine automatisierte dichtebasierte Segmentierung oder eine maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung werden durchgeführt, um die interessierenden Merkmale zu extrahieren. Die Ergebnisse zeigen endgültige segmentierte 3D-Modelle von interessanten Merkmalen, die auf der Sichtung von Bildmerkmalen und persönlichen Zielen basieren, um den optimalen Segmentierungsansatz zu wählen.

Ein Vergleich zwischen den verschiedenen Ansätzen für die verschiedenen Datensätze hilft bei der Auswahl der richtigen Segmentierungsstrategie. Wir demonstrieren verschiedene Methoden zur Extraktion von interessanten Merkmalen. Angesichts der Komplexität der subzellulären Elektromikroskopie-Volumina hat jeder Ansatz seine Vor- und Nachteile.

Im Allgemeinen können Personen, die neu in der Segmentierung sind, Schwierigkeiten haben, da es nicht immer klar ist, den besten Ansatz für verschiedene Datensätze zu identifizieren. Zusammen mit der Entlüftung von Doktoranden. Tai, der das Verfahren demonstriert, wird als Auto-Postdoc BU sein.

In meinem Labor haben Amit Hassan, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in meinem Labor, und Joaquin Korea, ein Computersystemingenieur in meinem Labor. Die manuelle Erstellung abstrahierter Modelle wird verwendet, wenn das einzige Ziel darin besteht, ein geometrisches Modell zu erstellen, um geometrische Messungen durchzuführen. Importieren Sie zunächst das Datenvolumen in ein geeignetes Programm. Für die manuelle Generierung abstrahierter Modelle wird in dieser Demonstration die kymera-Software verwendet.

Wählen Sie zuerst Datei und öffnen aus, um den Dialog zum Öffnen der Datei aufzurufen, navigieren Sie zum Dateispeicherort der gewünschten Karte. Rufen Sie als Nächstes den Volume-Viewer auf, und wählen Sie den Anzeigestil für Features aus, um Daten mit unterschiedlichen Rendering-Stilen anzuzeigen. Passen Sie den Schwellenwert für die Anzeige an, indem Sie den vertikalen Balken auf dem Histogramm im Fenster der Volumenanzeige ziehen.

Navigieren Sie durch das 3D-Volumen, um einen Interessenbereich für die Segmentierung auszuwählen und bei Bedarf ein kleineres Teilvolumen auszuschneiden. Wählen Sie im Dialogfeld für die Volumenanzeige Funktionen aus, wählen Sie den Unterbereich aus, klicken und ziehen Sie, um einen rechteckigen Rahmen um den gewünschten Bereich zu erstellen. Platzieren Sie als Nächstes Marker entlang des interessierenden Features, und verbinden Sie sie gegebenenfalls mit Linkern, bis das Modell fertiggestellt ist.

Um dies in der Menüleiste der Lautstärkeanzeige zu erreichen, wählen Sie Werkzeuge, Dialogfeld für die Lautstärkeüberwachung. Um dort den Dialog für die Lautstärkeverfolgung zu öffnen, wählen Sie Datei, Neuer Marker. Garnitur. Im Dialogfeld "Volumenmarkierung" können Sie den Mauszeiger überprüfen, Marker auf hoher Dichte platzieren, Marker auf Daten platzieren, Marker verschieben und skalieren, neue Marker mit ausgewähltem Marker verknüpfen und nacheinander ausgewählte Marker verknüpfen.

Wählen Sie dann im Volumen-Tracer-Fenster mit der rechten Maustaste die Option "Marker platzieren" aus und fügen Sie Radien für Marker und Verknüpfungen ein. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf die Volume-Daten, um mit dem Festlegen von Markierungen zu beginnen. Marker werden automatisch im Lautstärke-Tracer-Dialog verbunden.

Datei auswählen, aktuelle Markierung speichern. Setzen Sie dann die Markierung zum Schließen der Datei. Garnitur. Öffnen Sie einen neuen Markierungssatz, um mit dem Erstellen eines Modells in einem zweiten gewünschten Feature von Interesse zu beginnen.

Verwenden Sie kontrastierende Farben zwischen den Markierungssätzen, um Unterschiede in den Funktionen hervorzuheben. Die manuelle Verfolgung von interessierenden Features ist ein zeitaufwändiger Ansatz, der verwendet wird, wenn die Bevölkerungsdichte relativ gering ist und die Genauigkeit der Merkmalsextraktion von größter Bedeutung ist. So beginnen Sie mit dem Importieren von Volume-Daten in ein Programm mit manuellen Protokollierungsoptionen. Software.

Mit dieser Funktion bieten Sie in der Regel ein grundlegendes Pinselwerkzeug an. In dieser Demonstration wird die Amira-Software für große Tomos verwendet. Wählen Sie "Daten öffnen" und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dateinamen rec.

Klicken Sie dann auf Formatieren und wählen Sie Raw als große Disc-Daten aus. Okay, und laden. Wählen Sie die entsprechenden Rohdatenparameter aus den Kopfzeileninformationen aus und klicken Sie auf OK.

Umschalten und Speichern als neuer Dateiname. Wählen Sie für die 3D-Bildsequenz die Option "Daten öffnen" und dann "Dateiname" "tiff" oder "Dateiname" dot mrmc aus.

Schalten Sie dann um, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Als Dateiname speichern am. Wählen Sie im 3D-Viewer-Fenster Ortho-Slice aus, um die Bilddatei zu öffnen. Verwenden Sie dann einen Schieberegler am unteren Rand, um durch die Slices zu navigieren und größere Daten zu beschneiden, die als große Disc-Daten geöffnet sind.

Schalten Sie den Dateinamen im Pool-Fenster um, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Gitterzugriff aus. Geben Sie die gewünschte Feldgröße ein, verschieben Sie die Box in den gewünschten Bereich und klicken Sie auf Übernehmen. Speichern Sie die neue Datei.

Erstellen Sie als Nächstes eine Segmentierungsdatei, indem Sie die Datei im Poolfenster umschalten. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste und wählen Sie das Beschriftungsfeld aus. Eine neue Datei wird sowohl auf der Registerkarte des Segmentierungseditors als auch im Objektpool erstellt und automatisch geladen.

Verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um den Rand des ersten interessierenden Features nachzuzeichnen. Ändern Sie die Pinselgröße wie gewünscht, und verwenden Sie dann den Mauszeiger, um den Rand des gewünschten Features nachzuzeichnen. Füllen Sie den nachgezeichneten Bereich mit der Tastenkombination F.Fügen Sie die Auswahl hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche mit dem Pluszeichen klicken.

Verfolgen Sie das gewünschte Merkmal durch alle Slices und wiederholen Sie die manuelle Nachverfolgungssegmentierung. Generieren Sie ein Oberflächen-Rendering für die Visualisierung und grundlegende qualitative oder quantitative Analyse gemäß den Anweisungen des Software-Benutzerhandbuchs auf der Registerkarte Objekt-Pool, schalten Sie die Dateinamensbeschriftungen am im Pool-Fenster um. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Oberflächengenerierung aus.

Wählen Sie die gewünschten Oberflächeneigenschaften aus, und klicken Sie auf Anwenden. Im Pool wird ein neuer Dateiname surf erstellt. Um das segmentierte Volume zu visualisieren, schalten Sie den Dateinamen im Poolfenster um.

Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Oberflächenansicht aus. Generieren Sie eine Oberfläche für die Visualisierung und qualitative Analyse, wie im Textprotokoll beschrieben. Die automatisierte dichtebasierte Segmentierung wird für Datensätze mit einer beliebigen Vielfalt an Kontrasten, Schärfe oder Überfüllung verwendet, um die interessierenden Dichten zu extrahieren und mit dem Import von Volumendaten in ein Programm zu beginnen, das mit dem Schwellenwert-Zauberstab oder anderen dichtebasierten Tools für die automatische Segmentierung ausgestattet ist.

Wie bei der manuellen Tracing-Technik für interessante Merkmale wird auch in dieser Demonstration die Amira-Software für Merkmale ohne klar unterscheidbare Ränder verwendet. Verwenden Sie das Schwellenwert-Werkzeug, indem Sie das Schwellenwertsymbol auswählen. Passen Sie einen Schieberegler an, um die Dichte innerhalb des gewünschten Bereichs anzupassen, sodass nur die interessierenden Features maskiert werden.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Auswählen" und fügen Sie dann eine Auswahl hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche mit dem Pluszeichen oder auf den Kurzbefehl klicken. A generieren eine Oberfläche für die Visualisierung und qualitative Analyse, wie im Textprotokoll beschrieben. Alles ein vierter Ansatz.

Eine maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung kann zur effizienten Segmentierung großer Datensätze verwendet werden, erfordert jedoch Kenntnisse in Programmen wie Matlab. Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zu dieser Methode finden Sie im ergänzenden Video zur maßgeschneiderten Segmentierung. Sechs Beispieldatensätze wurden nach vier Ansätzen segmentiert. Die manuelle Generierung abstrahierter Modelle, die manuelle Verfolgung von Merkmalen von Interesse, die automatisierte dichtebasierte Segmentierung und die kundenspezifische automatisierte Segmentierung Die manuelle Generierung abstrahierter Modelle war für das Harz effektiv.

Die eingebettete gefärbte Tomographie von Stereozilien hatte den Zweck, ein Modell für quantitative Zwecke zu erstellen, anstatt genaue Dichten für die in das Harz eingebettete gefärbte Tomographie einer pflanzlichen Zellwand zu extrahieren. Die automatisierte dichtebasierte Segmentierung war am effektivsten, um die Zellulose schnell durch viele Scheiben zu extrahieren. Die manuellen Methoden erforderten mehr Aufwand für nur wenige Datenmengen.

Die manuelle Generierung abstrahierter Modelle erzeugte das Mikrotubuli-Triplett in der Stadientomographie von Kinocilium, während die beiden automatisierten Ansätze die Dichten schneller extrahierten und daher aufgrund der Form der Mitochondrien aus fokussierten Ionenstrahlen, der Rasterelektronenmikroskopie von Brustepithelzellen, bevorzugt wurden. Die manuelle Rückverfolgung lieferte das sauberste Ergebnis und die geringe Populationsdichte ermöglichte eine schnelle Segmentierung. Angesichts des großen Volumens, das segmentiert werden musste, erwies sich eine maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung als am effizientesten, um die Bakteriendaten der seriellen Blockflächenrasterelektronenmikroskopie zu segmentieren.

Die einzige Methode, um die fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie der Brustepithelzellmembran zu extrahieren, war die manuelle Verfolgung, obwohl sie zeitaufwändig war. Die Entwicklung der Segmentierungsansätze ebnet Forschern in diesem aufstrebenden Bereich der strukturellen Zellbiologie den Weg, um die zelluläre 3D-Architektur auf der Ebene makromolekularer Komplexe, Organellen und Zellen in einer Vielzahl von Zellkulturen, Organoidkulturen oder Modellorganismen zu erforschen und zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den optimalen Segmentierungsansatz für Ihren Datensatz auswählen und anwenden können.