Korrelat konfokale und 3D-Elektronenmikroskopie eines spezifischen Sinneszelle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die vollständige Ultrastruktur einer bestimmten Darmsensorikzelle zu dokumentieren, die zwischen anderen Epithelzellen im nativen Darmgewebe verstreut ist. Dies wird erreicht, indem zunächst ein 300 x 50 Mikrometer großes Gewebesegment aus dem Darm gewonnen wird. Als nächstes werden optische Z-Stapel des Segments mit konfokaler Mikroskopie erhalten.

Dann dienen die konfokalen Daten als Leitfaden, um das Gewebe mit Hilfe der seriellen Block-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zu verarbeiten und abzubilden. Schließlich werden die SBEM-Daten segmentiert, um die Ultrastruktur einer bestimmten Darmsensorzelle in 3D darzustellen. Letztendlich korrelative konfokale Mikroskopie und serielles Blockflächenscannen.

Die Elektronenmikroskopie wird verwendet, um eine bestimmte Zelle in ihrem nativen Gewebe zu zeigen und ihre Ultrastruktur in 3D zu zeigen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, wie z. B. die spezifischen Zell-zu-Zell-Interaktionen, die sonst auf lichtmikroskopischer Ebene nicht sichtbar gemacht werden könnten. Mit dieser Methode haben wir bereits über eine versteckte physikalisch-chemische Beziehung zwischen sensorischen endokrinen Zellen und ggl berichtet.

Nachdem Sie den Dickdarm der Maus gemäß dem Textprotokoll isoliert haben, legen Sie ihn in ein schönes kaltes PBS und schneiden Sie unter Wasser das Gewebe entlang des Mesentärs auf, übertragen Sie das Gewebe in einige Tropfen PBS auf ein Blatt Zahnwachs und schlagen Sie mit einem Skalpell etwa sechs kleine Gewebesegmente aus dem distalen Dickdarm. Nachdem Sie 5% niedrigschmelzende Aros in PBS vorbereitet haben, verwenden Sie es, um die Gewebesegmente in einen kleinen Kunststoffbehälter einzubetten, wie z. B. die Tissue-Tech-Kryoform in Standardgröße, montieren Sie die eingebetteten Abschnitte auf ein vibrierendes Klingenmikrotom und verwenden Sie eiskaltes PBS, um die Pufferschale zu füllen. Schneiden Sie dann 300 Mikrometer große Gewebestreifen mit einer Amplitude von 0,8 und einer Geschwindigkeit von 0,04 Millimetern pro Sekunde.

Schneiden Sie die 300 Mikrometer großen Gewebestreifen in Aros und montieren Sie sie auf einem Mikroton senkrecht zur Klinge. Schneiden Sie dann Gewebestreifen mit einer Dicke von 50 Mikrometern und beziehen Sie sich dabei auf das Textprotokoll, bevor Sie die Blöcke in PBS bei vier Grad Celsius lagern. Nach der Bildgebung von Gewebeblöcken mit konfokaler Mikroskopie gemäß dem Textprotokoll zum Infiltrieren und Einbetten von Gewebeschnitten in Harz.

Entfernen Sie das Gewebe aus PBS und spülen Sie es mit 0,1 molaren Cocoate-Puffer dreimal für jeweils fünf Minuten aus. Sobald das Harz vorbereitet und die Gewebe für die Elektronenmikroskopie gemäß dem Textprotokoll gefärbt wurden, verwenden Sie es, um Gewebeblöcke zwischen Glasobjektträgern zu sandwichen, die mit einem flüssigen Trennmittel ausgehärtet wurden, nachdem die Gewebeblöcke eingebettet wurden, und härten Sie die Blöcke weitere 48 Stunden lang bei 60 Grad Celsius flach aus. Ziehen Sie dann die Objektträger auseinander, um die Blöcke unter einem Präparierrohr freizugeben, und passen Sie die Ausrichtung der in Harz eingebetteten Gewebeblöcke an die der konfokalen Mikroskopaufnahmen an.

Um die Identifizierung der Bereiche zu erleichtern, in denen sich die interessierenden Zellen befinden, montieren Sie den Block flach auf einen Stift, der ein leitfähiges Epoxidharz enthält, und trocknen Sie ihn 30 Minuten lang. Legen Sie den Block dann flach auf eine Unterlage und trocknen Sie ihn am nächsten Tag über Nacht bei 60 Grad Celsius. Bestreichen Sie den Block mit kolloidaler Silberflüssigkeit.

Halten Sie die Gewebeschnitte flach, um sicherzustellen, dass der Block im richtigen Winkel geschnitten wird, um die Korrelation der seriellen Blockfläche und der konfokalen Mikroskopaufnahmen zu erleichtern. Nachdem Sie die Rasterelektronenmikroskopie gemäß dem Textprotokoll durchgeführt haben, konvertieren Sie die SPEM-Bilder von rohen DM-Dreiformaten in Acht-Bit-TIFF-Bilder mit einem 0,8-Gaußschen Unschärfefilter in Fidschi. Filtern Sie die TIFF-Bilder.

Skalieren Sie den Datensatz auf 25 % der Originalgröße herunter und speichern Sie ihn als TIFF-Stack, um die Menge an RAM-Speicher zu minimieren, die für die Verarbeitung des Datensatzes mit dem Fiji-Plugin für die lineare Stack-Ausrichtung mit Sichtung im Übersetzungsmodus erforderlich ist. Richten Sie den Stapel der SPEM-Bilder aus und verwenden Sie das Plugin crop 3D, um sie zuzuschneiden. Verwenden Sie zum Rendern der Daten das Oberflächenwerkzeug im Zeichenmodus und die Konturoption im Zeichenmodus von 50 Millisekunden, um die gewünschte Zelle manuell zu segmentieren und volumenmäßig zu rendern.

Zeichnen Sie Konturen auf jedem Segment der Zelle nach, um ein glatteres Rendering zu erzielen, oder alle fünf Segmente für ein schnelleres Rendern. Verwenden Sie das Schnappschuss-Werkzeug, um die endgültigen Bilder mit einer Auflösung von 300 DPI oder mehr mit der P-Y-Y-G-F-P-Maus zu exportieren. Alle enteroendokrinen Zellen des distalen Teils des Dünndarms werden identifiziert und für SBEM aufbereitet, wie hier gezeigt.

Ein ausgewähltes Gewebesegment wurde durch konfokale Mikroskopie abgebildet, um Zack-Bilder zu erhalten, die optisch einen Mikrometerabstand von einem Mikrometer haben. Die Optimierung der Abmessungen der Gewebeblöcke ist entscheidend für die topographische Korrelation zwischen konfokalen und SBEM-Daten. Diese volumengerenderte Ansicht einer enteroendokrinen Zelle im Ileum der Maus zeigt einen markanten Neuropoden, der sich etwa 60 Mikrometer unter den Epithelzellen erstreckt

Durch Korrelation der konfokalen Z-Stapel mit einem SBEM-Bild der gesamten Blockfläche wird die interessierende Zelle in einem Block aus dem distalen Dickdarm der Maus A-P-Y-Y-G-F-P identifiziert. Es ist wichtig, die Ausrichtung des Blocks so flach wie möglich zu halten, um den optischen Schichten in den SBEM-Bildern zu entsprechen. Sobald die Zelle identifiziert wurde, wird die SBEM-Bildgebung mit einer Auflösung durchgeführt, die hoch genug ist, um sekretorische Sles und andere Zellorganellen zu identifizieren.

Dieses Video enthält ein 3D-Rendering der enteroendokrinen Zelle. Der Datensatz enthält 643 Bilder, die sich über eine Gewebetiefe von 45 Mikrometern erstrecken. Die Zelle enthält einen Neuro-Pod, der mit sekretorischen Les sowie Mikrovilli gefüllt ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die vollständige Ultrastruktur eines bestimmten Darms dokumentieren können. Die sensorische Zelle wird zwischen anderen Epithelzellen im nativen Darmgewebe verstreut, indem die Fluoreszenz als Leitfaden verwendet wird, um die Zelle oder die Zellen von Interesse zu identifizieren und das Gewebe für die serielle Blockphasen-Rasterelektronenmikroskopie zu verarbeiten.