Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb eines gegebenen Proteoms parallel und unvoreingenommen zu identifizieren, was mit anderen Technologien nicht möglich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst ein epitopmarkiertes Protein von Interesse mit einer hochgereinigten, funktionellen Proteinbibliothek in voller Länge hybridisiert wird, die in einer Koordinatenebene auf der Oberfläche eines Objektträgers abgeschieden wird. Sobald das Protein ein Gleichgewicht mit jedem seiner jeweiligen Zielproteine auf dem Array erreicht hat, wird die ungebundene Fraktion weggespült und die Proteinwechselwirkungen werden mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Epitop nachgewiesen, der an eine fluoreszierende Einheit konjugiert ist, wobei ein Standard-Microarray-Scanner verwendet wird.

Die resultierenden Bilder sind mit Informationen über die Intensität jedes Merkmals in Bezug auf das gebundene Protein und das Fluoreszenzsignal verschachtelt. Diese Informationen werden mit Hilfe der Microarray-Analysesoftware extrapoliert, um eine Liste von Intensitätswerten für jedes Merkmal auf dem Array zu erstellen. Die Informationen über das Protein-Protein-Interaktionspaar können an eine nachgelagerte bioinformatische Analysesoftware exportiert werden, um die merkmalsspezifischen Daten zu bewerten und Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen dem interessierenden Protein und den Proteinen auf dem Microarray zu identifizieren.

Die Rohdaten zur Signalintensität werden über zwei oder mehr Protein-Microarrays zusammengestellt, um die Variation zwischen und innerhalb des Assays zu berücksichtigen, und die Daten werden normalisiert, um jede der Wechselwirkungen zu bewerten. Die resultierende Ausgabe generiert eine Zielliste interagierender Proteine, die zur weiteren Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden kann. Der in vivo Functional Protein Microarray wurde vor über 15 Jahren im Labor von Michael Snyder entwickelt.

Seitdem gab es viele erfolgreiche Anwendungen dieser Technologie aufgrund ihrer Vielseitigkeit und biochemischer Proteom-Assays. Diese Technik erleichtert die Untersuchung von Proteininteraktionen und modularen Signalnetzwerken sowie von alternativer Konnektivität und bisher bekannten Signalkaskaden Um die V fünf Fusionskinase Sonden zu kultivieren und zu reinigen, verwenden Sie frisch gestreifte Hefestämme Y 2 58 mit V fünf Fusionsproteinplatten, die Hefe auf synthetischem vollständigem Uracil, 2%Dextrose-Agar und wachsen drei Tage lang bei 30 Grad Celsius aus gefrorener Kultur. Inokulieren Sie Starterkulturen aus einer einzigen Kolonie und züchten Sie sie über Nacht in synthetischem vollständigem Uracil.

2%Dextrose auf einer schüttelnden Plattform oder einem Rad bei 30 Grad Celsius. Am nächsten Morgen inokulieren Sie 400 Milliliter eines synthetischen vollständigen Uracils. 2%Raffinose-Kultur mit ausreichender Starterkultur, um eine endgültige optische Dichte bei 600 Nanometern oder einen OD 600 von 0,1 zu erreichen.

Wachsen Sie die Inokula auf einen OD 600 von 0,6 und induzieren Sie dann die Expression des V-Fünf-Kinase-Fusionskonstrukts, indem Sie genügend Extrakt aus drei x Hefe hinzufügen. Pep-Tonus, ergänzt mit 6 % Galaktose, um das Induktionsmedium um den Faktor drei zu verdünnen, oder eine endgültige Galaktosekonzentration von 2 %Induzieren Sie die Zellen sechs Stunden lang bei 30 Grad Celsius auf einer Schüttelplattform. Verwenden Sie einen Zwei-Liter-Erlenmeyerkolben, um eine angemessene Belüftung zu gewährleisten.

Ernten Sie die Zellen, indem Sie 400 Milliliter der Zellsuspension fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1000 mal G drehen. Waschen Sie die Zellen einmal mit 50 Millilitern eiskaltem PBS-Puffer und geben Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie das Pellet erneut in eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder A PBS-Puffer und geben Sie es zur Lyse in zwei Milliliter-Schnappverschlussröhrchen.

Nachdem Sie die Zellen eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 20.000 G gedreht haben, entfernen Sie den Puffer mit einer Pipette und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Lycieren Sie die Zellen mit 0,5 Millimeter Zirkonoxidkügelchen in einem Eins-zu-Eins-Volumen von Zellpellets zu Kügelchen zur PBS-Lyse, Puffer. Dann wird die Mischung mit einer Rührplattform dreimal im Abstand von zwei Minuten bei vier Grad Celsius vortext.

Zentrifugieren Sie das Lysat bei 20.000 Mal, G in einer Tisch-Mikrofuge für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Das geklärte Lysat wird in ein Röhrchen mit etwa 100 Mikrolitern vorgewaschenem Nickel-Affinitätsharz überführt und zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Nutat inkubiert. Um das Histamin-Six-x-markierte V-Fünf-Fusionsprotein-Pellet einzufangen, wird das Harz mit einer Tischzentrifuge fünf Minuten lang bei 1000 mal G und vier Grad Celsius nach Entfernung des Überstands eingefangen

Waschen Sie das Harz 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit Waschpuffer auf dem Mutator. Wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal mit frischem Waschpuffer. Eluieren Sie die Proteine mit zwei 100-Mikroliter-Volumina von 200 Millimolaren Ol.

Glycerin wird bis zu einer Endkonzentration von 30 % der Proben zugegeben und bis zur Verwendung im Assay bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Um Wechselwirkungen zu erkennen. Verdünnen Sie den konjugierten V-Fünf-Fluor-Vier-Antikörper in der Sonde auf 260 Nanogramm pro Milliliter, puffern Sie ihn und mischen Sie ihn gründlich durch Schütteln.

Anschließend verdünnen Sie die V fünf Fusionsprotein-Sonde über einen Konzentrationsbereich von fünf bis 500 Mikrogramm pro Milliliter. Nehmen Sie anschließend die Protein-Microarrays aus dem Gefrierschrank und bringen Sie sie kurz vor der Verwendung auf vier Grad Celsius in den Kühlschrank. Geben Sie den Blockierungspuffer direkt in den Objektträgerhalter mit den Protein-Microarrays und bedecken Sie die Oberseite mit Paraform, um ein Auslaufen zu verhindern.

Blockieren Sie die Arrays für eine Stunde im Blocking-Puffer, indem Sie sie bei 50 RP auf einer Bühne bei vier Grad Celsius schütteln. Nach dem Blockieren werden die Arrays in eine befeuchtete Kammer überführt, die auf vier Grad Celsius gekachelt ist, und 90 Mikroliter verdünnte Sonde direkt auf die Array-Oberfläche gegeben. Überlagern Sie die Arrays mit einem erhabenen Lifter-Slip und inkubieren Sie ohne Schütteln in der befeuchteten Kammer bei vier Grad Celsius für eineinhalb Stunden. Nach der Inkubation geben Sie den Objektträger in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das genügend vorgekühlten Sondenpuffer enthält, um den Objektträger vollständig zu umhüllen, so dass der Lifter-Slip sanft vom Protein-Microarray abgleiten kann.

Waschen Sie die Arrays dreimal für jeweils eine Minute in drei konischen Röhrchen. Tragen Sie die Antikörperlösung unmittelbar nach Abschluss des Waschvorgangs direkt auf das Array auf und überlagern Sie sie mit dem gelöschten Lifter-Slip. Inkubieren Sie die Arrays wie bisher 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius in der befeuchteten Kammer.

Führen Sie den gleichen Waschschritt wie zuvor durch und schleudern Sie es in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen bei 800 G in einer Tischzentrifuge für fünf Minuten. Bei Raumtemperatur trocknen Sie die Arrays in einem Objektträgerhalter 30 Minuten lang im Dunkeln an der Luft, bevor Sie das Array bei 647 Nanometern scannen. In diesem Experiment wurde die Bindungsaktivität von TDA eins V fünf untersucht.

Hefeprotein-Microarrays, die in Duplikaten mit etwa 4.200 GST-Fusionsproteinen in voller Länge gesichtet wurden, wurden mit der leeren Vektorkontrolle oder mit TDA one V fünf Sonden inkubiert. In den eingefügten Fenstern wird der identische Bereich in beiden Arrays verglichen. Besonders hervorzuheben ist RIM 11, das interessanterweise in einer zuvor veröffentlichten Studie auch als phosphoryliertes Ziel von TDA one identifiziert wurde.

Sobald die Ziele identifiziert sind, können sie in vivo auf ihre biochemische und funktionelle Aktivität getestet werden. Wenn Sie sich dieses Video ansehen, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie funktionelle Protein-Microarrays als Mittel zur Identifizierung von Proteinwechselwirkungen für die weitere In-vivo-Validierung und -Abfrage verwenden können.