Name: Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Erfahren Sie, wie Protein-Mikroarrays zur hochdurchsatzanalyse von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht die parallele Untersuchung tausender Wechselwirkungen für bioinformatische Analysen.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des NIH unterstützt. Die in Abbildung 1 gezeigten Untersuchungsergebnisse wurden von Dr. Joseph Fasolo durchgeführt. Wir danken Dr. Rui Chen für hilfreiche Kommentare.

1. Probe Vorbereitung <ol><li> Kultur und Reinigung der V5-Fusionskinase-Sonden verwendet werden, um Wechselwirkungen mit anderen Proteinen zu untersuchen, wie folgt: <ol><li> Verwenden Sie frisch ausgestrichenen Hefestamm Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112), die V5-Fusionsprotein (von GATEWAY Vektor pYES-DEST52 ausgedrückt). Verwenden Sie das isolierte Protein als Sonde für die Mikroarrays. Platte die Hefe auf synthetischem Komplett-Uracil (SC-Ura) / 2% Dextrose / Agar und wachsen bei 30 ° C für 3 Tage aus gefrorenen Kultur (-80 ° C Glycerolstammlösung). </li><li> Impfen Starterkulturen (5-20 ml) aus einer Einzelkolonie und über Nacht wachsen in Sc-Ura / 2% Dextrose auf Schüttelplattform (220-250 rpm) oder Rad bei 30 ° C. </li><li> Am folgenden Morgen inokulieren 400 ml des Sc-Ura / 2% Raffinose Kultur mit ausreichend Starterkultur auf eine endgültige OD 600 von 0,1. </li><li> Wachsen die Impfkulturen bis zu einer OD 600 von 0,6, gefolgt von Galactose-Induktion des V5-Kinase-fusion Konstrukt-Expression durch Zugabe einer Lösung von 3x Hefeextrakt / Pepton (YEP) mit 6% Galactose ergänzt durch Zugabe von genug, um das Induktionsmittel durch einen Faktor von 3 zu verdünnen, so dass die endgültige Konzentration der Galactose beträgt 2%. </li><li> Induzieren Zellen bei 30 ° C für 6 Stunden auf eine schwankende Plattform. Verwenden Sie einen 2 l-Erlenmeyerkolben, angemessene Belüftung sicherzustellen. </li><li> Ernten der Zellen unter Verwendung eines JA-10 (oder vergleichbaren) Rotors durch Drehen mit 400 ml Zellsuspension bei 1.000 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Mit 50 ml eiskaltem PBS-Puffer und in einen 50-ml konischen Röhrchen Waschen der Zellen einmal. Dann wird noch einmal das Pellet in eiskaltem PBS-Puffer (ohne Reinigungsmittel oder andere Additive) für die Lyse und Transfer zum 2 verwendet ml Röhrchen für die Lyse-Kappe einrasten. </li><li> Drehen Sie die Zellen bei 20.000 · g für 1 min bei 4 ° C zu einem Pellet und Pipette entfernt Puffer. </li><li> Zeigen Röhrchen auf Eis und füllen Lyseschritt. </li><li> Lyse der Zellen (250-350 ul Pellet) mit 00,5 mm Zirkoniumoxidkügelchen in einer 1: 1: 1 Volumen des Zellpellets, Perlen und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) Lysepuffer und Wirbel das Gemisch unter Verwendung eines Bewegungsplattform 3 mal in 2 min Intervallen bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie das Lysat bei 20.000 × g in einer Tischmikrozentrifuge für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Pipette Stand in Polycarbonat Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen und Klärung durch ulracentrufugation für 30 Minuten bei 150.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Übertragen die geklärte Lysat in ein Röhrchen vorgewaschen Ni 2+ Affinitätsharz (~ 100 &amp; mgr; l) und Inkubieren auf einem Nutator für 2 h bei 4 ° C zu erfassen Histidin (His) 6X markierten V5-Fusionsprotein ist. </li><li> Dreimal Waschen des Harzes für 10 Minuten bei 4 ° C mit Waschpuffer. Pelletierung des Harzes unter Verwendung einer Tisch-Zentrifuge 5 min bei 1000 × g bei 4 ° C und saugt den Überstand. In frischem Waschpuffer für jeden Wasch und senden Sie das Rohr Nutatorwinkel für Agitation während der Wäsche. </li><li> Nach dem Wasch steps abgeschlossen sind, wenden die gewaschene Harz in ein frisches G-25-Säule für die Elution. </li><li> Gelten 25 ul Elutionspuffer in einer schrittartigen Weise, beginnend mit 100 mM Imidazol und 500 mM Imidazol in 50 mM Inkremente für insgesamt 9 Fraktionen. </li><li> Assay Die gesammelten Fraktionen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Coomassie-Färbung, um die am stärksten angereicherten Fraktion (en) zur Verwendung in dem Assay zu identifizieren und fügen Glycerin zu 30% und bei -80 ° C bis in den verwendeten Assay. </li></ol></li></ol> 2. Beobachtung der Arrays HINWEIS: Bitte beachten Sie Schritt 2.6 dieses Abschnitts, um die Antikörperlösung vor dem Test vorzubereiten. <ol><li> Um Wechselwirkungen zu erfassen, verdünnen das V5-Fluorophor konjugierten Antikörper (dh AlexaFluor 647) bis 260 ng / ml in Sondenpuffer und mischen durch Schütteln. HINWEIS: Bereiten Sie dieses Antikörperlösung 30 Minuten vor der Anwendung und legen Sie den Schlauch auf einem nutatoder oder ein Rad vollständige Vermischung und eine homogene Suspension von Antikörper zu gewährleisten. </li><li> Verdünne die V5-Fusionsprotein Sonde über einen Konzentrationsbereich von 5-500 &amp; mgr; g / ml. HINWEIS: Optimiert für jedes Protein-Protein-Interaktionsassays, mit Sondenpuffer. Optimierung beinhaltet das Hinzufügen von mehr Sonden an Puffer zu sondieren. Typischerweise 10 &amp; mgr; g / ml wird als Ausgangspunkt verwendet und angepasst basierend auf der Signalstärke. </li><li> Entfernen der Proteinarrays aus dem Tiefkühler (-20 ° C) und bringen auf 4 ° C im Kühlraum unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> In Blocking-Puffer direkt auf die Objektträgerhalter, die die Protein micorarrays und decken den Spitzen mit Parafilm, um ein Auslaufen zu verhindern. Blockieren die Arrays in Blockierungspuffer für 1 Stunde unter Schütteln bei 50 UpM auf einer Stufe bei 4 ° C. </li><li> Nach dem Blockieren übertragen die Arrays einer befeuchteten Kammer auf 4 ° C gekühlt, und geben 90 ul der verdünnten Probe direkt auf der Array-Oberfläche. Überlagern die arrays mit einem erhöhten Schlupf Heber und Inkubation statisch (ohne Schütteln) in der feuchten Kammer bei 4 ° C für 1,5 Std. </li><li> 3 mal in drei 50 ml konische Röhrchen waschen die Arrays für jeweils 1 min in Puffer Sonde. Fügen Sie die Folie, um konische Röhrchen, die genug vorgekühlte Sondenpuffer, um die Folie vollständig umhüllen. Lassen Sie den Lifter Schlupf sanft abrutschen des Proteinmikroarray (keine Gewalt aus, da dies zu Schäden an der Array-Oberfläche zur Folge haben). </li><li> Übernehmen Sie die Antikörper-Lösung direkt auf Array sofort nach Abschluss des Wasch (Schritt 2.5) und Überlagerung mit einem erhöhten Heber Schlupf wie zuvor. Die Arrays 30 min Inkubation bei 4 ° C in der feuchten Kammer. </li><li> Führen die gleiche Waschschritt wie zuvor (3 mal 1 min in Puffer Sonde) und Spin in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 800 x g in einer Tischzentrifuge 5 min bei Raumtemperatur. Der Luft trocknen die Arrays in einem Objektträgerhalter in der Dunkelheit für 30 Minuten vor der Anordnung bei 647 nm gescannt. </li></ol>

<ol><li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProCAT%3A+a+data+analysis+approach+for+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays.</a> Genome biology. 7, R110(2006).</li>
<li>Breitkreutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+protein+kinase+and+phosphatase+interaction+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast.</a> Science. 328, 1043-1046 (2010).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li>
<li>Jeong, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+monospecific+monoclonal+antibodies+using+a+human+proteome+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293, 2101-2105 (2001).</li>
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<li>Haab, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays+in+cancer+research.+Molecular+%26+cellular+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).</li>
<li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).</li>
<li>Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%3A+novel+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays: novel developments and applications.</a> Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).</li>
<li>Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microarray+surfaces+and+arraying+parameters+for+autoantibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling.</a> Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).</li>
<li>Gelperin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Fasolo, J., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).</li>
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<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das Protokoll vorgestellt wurde ursprünglich unter Verwendung von 85 einzigartigen Hefe-Proteinkinase-V5-Fusionsproteinen die Bindungsaktivität gegenüber verschiedenen und verwandte Familien von Hefe-Proteinkinasen, was zur Identifizierung von neuen Kinase-Interaktionsnetz in vivo 1 zu vergleichen. Als aufstrebender Proteom-Profiling-Technologie, die Entwicklung von High Throughput (HTP) Screening der Proteome mit Protein-Microarrays auf Peptidbibliotheken und eukaryotischen und prokaryotischen Model...

Die Notwendigkeit, die globale Analysen der Proteinbiochemie und Bindungsaktivität in vivo durchzuführen in der Entwicklung neuer Verfahren zum Profilieren von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) und die post-translationalen Modifikationen von ganzen Proteomen 1,3-8 geführt. Protein-Mikroarrays werden als funktionelle Protein-Microarrays mit voller Länge funktionelle Proteine ​​4-6,8,9 oder analytische Protein-Microarrays 10,11 Antikörper enthält, hergestellt. Sie sind so konstruiert, um eine hohe Dichte von Proteinen auf Mikroskop-Objektträgern mit einer Vielzahl von Oberflächenchemie angeordnet enthalten, um eine Vielzahl von zum Leiten von weitreichenden biochemischen Analysen erforderlichen 12 Versuchsbedingungen zu erleichtern. Nitrocellulose und Aldehyd Oberflächenchemie für die chemische Anbindung durch Lysin oder Affinität Befestigungsmethoden, wie beispielsweise Nickel-Chelat-Objektträger zur Befestigung His-markierte Proteine ​​und Glutathion zur Affinitäts Befestigung unter anderem 13. </p&gt; Die Verwendung von funktionellen Protein-Mikroarrays, um Protein-Protein-Interaktionen zu detektieren erfordert den Zugriff auf einen hochwertigen funktionellen Proteinbibliothek 14. S. cerevisiae ist zugänglich Herstellung einer solchen Bibliothek durch die Paarung von hoher Kopienaffinitätsmarkierten Proteinkonstrukte mit Hochdurchsatz-chromatographischen Reinigung Techniken. Die überwiegende Mehrheit des Hefegenoms sequenziert wurde und fast die gesamte Proteoms kann aus einem high-copy-Plasmid zur Reinigung exprimiert und biochemischen Analysen 12. Sobald die Proteine ​​gewonnen und in 384-Well-Format angeordnet sind, werden sie auf einen Objektträger so dass für eine schnelle parallele multiparametrischer biochemische Analytik und Bioinformatik Abfrage 8,14-16 gedruckt. Protein-Mikroarrays für enzymatische Assays und Wechselwirkungen mit Proteinen, Lipiden, kleine Moleküle und Nukleinsäuren, unter vielen anderen Anwendungen eingesetzt. Die Zugänglichkeit von Proteinen auf der Oberfläche des ProteomsAnordnungen machen, sich auf andere Arten von analytischen Nachweis einschließlich Immunaffinitäts, Oberflächenplasmonresonanz, Fluoreszenz und viele andere Techniken. Außerdem ermöglicht sie die Feinsteuerung der experimentellen Bedingungen ab, wo es schwer, in vivo tun. Ziel dieses Protokolls ist es, die angemessene Verwendung der funktionellen Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen zu demonstrieren. Diese Anwendung ermöglicht die Hochdurchsatz parallel biochemische Analyse von Protein-Bindungsaktivitäten unter Verwendung eines hoch gereinigten Analyten (Protein) von Interesse. Ein C-terminal (carboxyterminalen) Markierte V5-Fusions-Köderprotein von Interesse aus einem high-copy-Plasmid in einem Hefestamm zur Proteinreinigung optimiert produziert. C-terminalen Markierungs sichergestellt, dass das Volllängen-Protein übersetzt worden ist. Das in dieser Studie verwendete Protein ist TDA1-V5-Fusionsprotein-Kinase, die mit gereinigtem Nickel-Affinitätsharz über eine His6X tag. Die TDA1-V5-Fusions Baut wird durch serielle Elution mit einem Imidazol-Gradienten, um die am stärksten angereicherten Fraktion für den Einsatz im Assay Eluieren gereinigt.

<table><tbody><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR</td><td>NC-10747</td><td>oder vergleichbar</td></tr><tr><td>Bacto Hefeextrakt</td><td>Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>Galaktose</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura Ausfallmedien</td><td>MP Bio</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Kulturgefäße</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Große Erlenmeyerkolben</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge JA-10 Rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen (50 ml)</td><td>VWR/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletten</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Röhrchen (2 ml Schraubverschlusstube)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Zirkon Perlen</td><td>BioSpec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol (pH = 7,4)</td><td>Sigma</td><td>I5513&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail 1</td><td>Sigma</td><td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelinkubator (30 Grad; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nickel Affinity Resin</td><td>Life Technologies</td><td>R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25 Säule</td><td>GE life sciences</td><td>27-5325-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gel (NuPage)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler V5-Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 Verschlagwortet mit monoklonaler V5-Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Microarrays Kit</td><td>Life Technologies</td><td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix Scanner</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lifter Slips</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td></tr> <tr><td>Lysepuffer: 0,1 % Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM Imidazol (pH 7,4), vollständiger Proteaseinhibitor-Cocktail &ndash; EDTA-frei, Phosphatase-Hemmer Cocktail 1, 1 mM PMSF&nbsp; (kurz vor Gebrauch hinzufügen)</td><td></td><td></td><td>Geben Sie die Reagenzien zu 1x PBS (0,01 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid, 0,137 M Natriumchlorid; pH 7,4), um das gewünschte Volumen der Lyselösung zu erhalten</td></tr><tr><td>Blockierungspuffer: 1 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,1 % Tween-20</td><td></td><td></td><td>Fügen Sie die Reagenzien zu 1x PBS hinzu, um das gewünschte Volumen des Blockierungspuffers</td></tr> <tr><td>zu erhaltenSondenpuffer: 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05 % Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μm; M ATP (für Kinasen), 1 % BSA</td><td></td><td></td><td>Geben Sie das Reagenz zu 1x PBS, um das gewünschte Volumen des Sondenpuffers zu erhalten</td></tr><tr><td>. Waschpuffer: 0,1 % Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM Imidazol (pH 7,4),2 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td>Geben Sie das Reagenz zu 1x PBS, um das gewünschte Volumen des Sondenpuffers</td></tr> <tr><td>zu erhaltenElutionspuffer: 0,1 % Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 μm; 500 mM Imidazol (pH 7,4), Vollständiger Proteasehemmer-Cocktail &ndash; EDTA-frei, Phosphatasehemmer Cocktail 1, 1 mM PMSF (kurz vor Gebrauch hinzufügen)</td><td></td><td></td><td>Bevor Sie beginnen, ist es wichtig, den Konzentrationsgradienten von Imidazol (50 &ndash; 500 mM) zu beachten und für jede Konzentration separate Röhrchen zu erstellen (es ist ratsam, das Intervall in Schritten von 50 mM zu erstellen). Geben Sie das Reagenz zu 1x PBS, um das gewünschte Volumen des Sondenpuffers zu erhalten</td></tr><tr><td>3x YEP +6% Galactose: 30 g Hefeextrakt und&nbsp; 60 g Pepton in 700 ml H2O auflösen und autoklavieren. Fügen Sie 300 ml Filter sterilisiert 20% Galaktose (wt/vol)</td><td></td><td></td> hinzu <td>&nbsp; Galaktose sollte nicht autoklaviert werden</td></tr></tbody></table>

probing hoher dichte funktionale protein-microarrays, um protein-protein wechselwirkungen erkennen

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Hochdichte funktionelle Protein-Microarrays ~ 4.200 rekombinanten Hefe Proteine ​​enthalten, werden für Kinase-Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines affinitätsgereinigten Hefe Kinase-Fusionsproteins, enthaltend ein V5-Epitop-Tag zum Auslesen sucht. Gereinigte Kinase wird durch die Kultur eines Hefestammes für eine hohe Kopienproteinproduktion, der ein Plasmid enthält eine Kinase-V5-Fusionskonstrukt unter einem GAL induzierbarer Promotor optimiert erhalten. Die Hefe wird in restriktiven Medien mit einem neutralen Kohlenstoffquelle für 6 Stunden, gefolgt von der Induktion mit 2% Galactose gezüchtet. Anschließend wird die Kultur geerntet und Kinase unter Verwendung von Standard affinitätschromatographischen Methoden, eine hoch gereinigte Protein-Kinase für die Verwendung in Assays zu erhalten, gereinigt. Die gereinigte Kinase wird mit Kinase-Puffer auf einen geeigneten Bereich für den Test verdünnt, und die Protein-Mikroarrays werden vor der Hybridisierung mit dem Protein-Mikroarray blockiert. Nach der Hybridisierung werden die Arrays mit monoklonalen V5 ANTIB sondiertody um Proteine ​​durch die Kinase-V5-Protein gebunden zu identifizieren. Schließlich werden die Arrays mit einem Standard-Microarray-Scanner abgetastet und Daten für nachgelagerte Informatik Analyse 1,2 extrahiert, um ein hohes Vertrauen Reihe von Protein-Interaktionen für Downstream-Validierung in vivo zu bestimmen.

Das Protein-Protein-Wechselwirkung-Aktivität wurde mit einem Standard-Chip-Leser zu beurteilen, die TDA1-V5 Protein-Kinase-Fusionskonstrukt als Köderprotein gegen eine Hefe funktionelle Protein-Microarray, das etwa 4.200 einzigartige S. beobachtet cerevisiae GST-Fusionsproteinen. Weitere Abfrage mit der Genepix Software ergab eine Vielzahl von Bindungsereignissen unterschiedlicher Intensität. Die Affinität wurde aus dem abgestuften Intensität des von einem monoklonalen V5-Fluorophor-konjugierten Antikö...

Verwendung von Protein-Mikroarrays enthält fast die gesamte S. cerevisiae Proteom ist für schnelle unvoreingenommene Abfragetausende von Protein-Protein-Wechselwirkungen in parallel sondiert. Dieses Verfahren kann für die Protein-Kleinmolekül, posttranslationale Modifikation und andere Assays mit hohem Durchsatz verwendet werden.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb eines gegebenen Proteoms parallel und unvoreingenommen zu identifizieren, was mit anderen Technologien nicht möglich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst ein epitopmarkiertes Protein von Interesse mit einer hochgereinigten, funktionellen Proteinbibliothek in voller Länge hybridisiert wird, die in einer Koordinatenebene auf der Oberfläche eines Objektträgers abgeschieden wird. Sobald das Protein ein Gleichgewicht mit jedem seiner jeweiligen Zielproteine auf dem Array erreicht hat, wird die ungebundene Fraktion weggespült und die Proteinwechselwirkungen werden mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Epitop nachgewiesen, der an eine fluoreszierende Einheit konjugiert ist, wobei ein Standard-Microarray-Scanner verwendet wird.Die resultierenden Bilder sind mit Informationen über die Intensität jedes Merkmals in Bezug auf das gebundene Protein und das Fluoreszenzsignal verschachtelt. Diese Informationen werden mit Hilfe der Microarray-Analysesoftware extrapoliert, um eine Liste von Intensitätswerten für jedes Merkmal auf dem Array zu erstellen. Die Informationen über das Protein-Protein-Int

probing-high-density-functional-protein-microarrays-to-detect-protein

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt Experimente mit anschließender Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch den Einsatz von Mikro-gemusterten Oberflächen. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erkennen und verbindet hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren.

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

In dieser Studie beschreiben wir ein verbessertes Protokoll für eine Multiplex-Hochdurchsatz-Antikörper Mikroarray mit Lektin Detektionsverfahren, das in der Glykosylierung Profilierung spezifischer Proteine ​​verwendet werden können. Dieses Protokoll bietet zuverlässige neue Reagenzien und reduziert den Zeitaufwand, Kosten und Laborgeräte Anforderungen an das vorherige Verfahren verglichen.

Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

Dieses Video zeigt eine Technik, die biotinylierte zellpenetrierende Peptide verwendet, um intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen. Die zellpenetrierenden Peptide erleichtern es dem konjugierten Peptid, in eine Zelle einzudringen und spezifisch an seine interagierenden Proteine zu binden. Das Biotin ermöglicht nach der Bindung an Avidin die Reinigung des Komplexes der interagierenden Proteine aus einem Zelllysat.

Biotinylierte zellpenetrierende Peptidsonde zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

SILAC Immunpräzipitationsexperimenten stellt ein wirksames Mittel zur Entdeckung neuer Protein-Protein-Interaktionen. Dadurch, dass die genaue relative Quantifizierung von Protein Hülle und Fülle in den Kontroll-und Testproben, true Wechselwirkungen können leicht von experimentellen Verunreinigungen unterschieden werden, und niedriger Affinität Wechselwirkungen durch die Verwendung von weniger strengen Pufferbedingungen erhalten.

Identifizierung von Protein-Interaktionspartner in Säugetierzellen mit SILAC-Immunpräzipitation Quantitative Proteomics

Peptid-Array-Screening ist ein Hochdurchsatz-Assay zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionsstellen. Dies ermöglicht die Kartierung mehrerer Wechselwirkungen eines Zielproteins und kann als Methode zur Identifizierung von Stellen für Inhibitoren dienen, die auf ein Protein abzielen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Screening und zur Analyse von Peptidarrays.

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Proteine interagieren miteinander und diese Wechselwirkungen bestimmen zu einem großen Teil ihre Funktionen. Protein-Interaktionspartner können bei hohem Durchsatz in vivo mit einem Hefe-Fitness-Assay identifiziert werden, der auf dem Dihydrofolat-Reduktase-Protein-Fragment-Komplementationsassay (DHFR-PCA) basiert.

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Cognate J-Domain-Proteine arbeiten mit dem Hsp70-Chaperon zusammen, um eine Vielzahl biologischer Prozesse zu unterstützen, die von der Proteinfaltung bis zum Abbau reichen. Hier beschreiben wir einen in situ-Näheligationstest, der die Überwachung dieser vorübergehend gebildeten Chaperon-Maschinen in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Zellen ermöglicht.

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung und Identifizierung krankheitsspezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen aus nativen Zellen und Geweben mit Hilfe chemischer Sonden und Massenspektrometrie ermöglicht. Die resultierenden Interaktionsdatensätze werden über eine spezielle webbasierte Plattform analysiert, um dynamische Netzwerkdysfunktionen und Veränderungen des Signalwegs im Zusammenhang mit Krankheiten aufzudecken.

Kartierung dysfunktionaler Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Krankheiten

Erfahren Sie, wie Protein-Mikroarrays zur hochdurchsatzanalyse von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht die parallele Untersuchung tausender Wechselwirkungen für bioinformatische Analysen.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

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