Name: Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine mit eine Handy-basierte ELISA-Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Erfahren Sie die zellbasierte ELISA-Methode zur Analyse von HIV-1-Env-Konformationen und Antikörperbindung. Diese Technik ermöglicht hochdurchsatzfähige Untersuchungen mit geringen Antikörpermengen für die Impfstoffentwicklung.

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Wir danken Herrn Dr. James Robinson für seine großzügige Geschenk der A32, 17b, 48d und C11 mAb. PGT 121 wurde durch die NIH AIDS Reagenz-Programm, Abteilung für AIDS, NIAID, NIH (Cat # 12343) erhalten. Diese Arbeit wurde von einer Kanada-Stiftung für Innovation Programmleiter # 29866, die von einem Betriebs CIHR # 257792, von einem FRQS Gründung der Young Scientist gewähren # 24639 auf AF und von einem Kontinuum CRCHUM Zuschuss sowie durch einen Katalysator CIHR Grant # 126630 AF und MR. AF ist der Empfänger einer FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 Stipendium # 24639. MV wurde von einer CIHR Doctoral Research Award # 291485 unterstützt.

1. Tag 1 - Cell Culture <ol><li> Platte 2 × 10 4 menschliche Osteosarkom (HOS)-Zellen pro Vertiefung in einer lichtundurchlässigen, 96-Well-Zellkulturplatte für Lumineszenz Lesen. Verwenden Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin ergänzt. Inkubieren bis zum nächsten Tag bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2. Tag 2 - Polyethylenimin (PEI) Transfektion <ol><li> Vorbereitung Transfektionsgemisch nach den nachfolgenden Schritten. Einzustellen Reagenzien und DNA-Mengen entsprechend der Anzahl von Vertiefungen, die mit dem gleichen Env transfiziert werden. </li><li> Rohr A: In 10 ng Tat-kodierenden Plasmid (wie PTAT--III 27) und 150 ng Env-kodierenden Plasmid bis 5 ul DMEM mit 25 mM HEPES. </li><li> Die Tat-kodierenden Plasmid ist nur bei Verwendung Tat-abhängigen Env-kodierenden Plasmide wie pSVIII erforderlich. </li><li> Rohr B: In 450 ng PEI (von A 1ug / ul-Lösung) und 5 ul DMEM. </li><li> Inhalte hinzufügen von Rohr zu Rohr B A. Mix gründlich durch Vortexen für 10 sec und Inkubation Transfektionsmischung 10 min bei Raumtemperatur (22 ° C). </li><li> Werden 10 ul der Transfektionsgemisch pro Well der 96-Well-Platte. Inkubation für 48 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 3. Tag 4 - ELISA <ol><li> Führen Sie alle Experimente bei Raumtemperatur, um mögliche Endozytose von Env / Antikörper-Komplexe zu minimieren. </li><li> Bereiten Sie 250 ml Waschpuffer pro Platte zur gleichen Zeit eingesetzt. Waschpuffer ist 1x Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) mit 1 mM MgCl 2 und 1,8 mM CaCl 2 ergänzt. </li><li> Bereiten Sie 125 ml Blockierungspuffer pro Platte durch Zugabe von 1% fettfreie Trockenmilch und 5 mM Tris pH 8,0 bis Waschpuffer. </li><li> Entfernen von Zellkulturmedien und Transfektionsgemisch (Überstand) von 96-Well-Platte. </li><li> Mit 100 μ; L Blockierungspuffer pro Well und Inkubation 20 min bei RT. </li><li> Überstand entfernen und 50 ul Antikörper (oder Serum) pro Vertiefung, auf eine geeignete Konzentration in Blocking-Puffer verdünnt. Typischerweise verwenden eine Konzentration von 1 pg / ml. Inkubiere 1 h bei RT. </li><li> Wasch 3x mit 100 ul Blocking Buffer und wiederholen Waschprozess 3x mit 100 ul Waschpuffer. </li><li> Überstand entfernen, 100 l Blocking Buffer, und Inkubation 5 min bei RT. </li><li> Überstand entfernen und 50 ul sekundären Antikörper, verdünnt 1/3000 in Blocking-Puffer. Variieren optimale Antikörper Verdünnung nach Hersteller Unterschiede. Inkubieren 40 min bei RT. </li><li> Wasch 3x mit 100 ul Blocking Buffer und wiederholen Waschprozess 3x mit 100 ul Waschpuffer. </li></ol> 4. Datenerfassung <ol><li> Überstand entfernen von der Platte, und fügen Sie 30 ul 1x verstärkte Chemilumineszenz (ECL)-Substrat pro Vertiefung. </li><li> Chem erwerbeniluminescence Signal für 1 sec / gut auf eine geeignete Platte-Leser nach den Anweisungen des Herstellers. Lesezeit kann je nach Hardware-Unterschiede abweichen. </li></ol>

<ol><li>Bures, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+recombinant+canarypox+vectors+expressing+membrane-anchored+glycoprotein+120+followed+by+glycoprotein+160+boosting+fails+to+generate+antibodies+that+neutralize+R5+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).</li>
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<li>Mascola, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+envelope+subunit+vaccine+products+elicits+neutralizing+antibodies+against+laboratory-adapted+but+not+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+AIDS+Vaccine+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).</li>
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<li>Leonard, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+intrachain+disulfide+bonds+and+characterization+of+potential+glycosylation+sites+of+the+type+1+recombinant+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+%28gp120%29+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).</li>
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<li>Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein+regions+important+for+association+with+the+gp41+transmembrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein.</a> J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).</li>
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<li>Kwong, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evades+antibody-mediated+neutralization+through+conformational+masking+of+receptor-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites.</a> Nature. 420, 678-682 (2002).</li>
<li>Sakai, K., Takiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+effective+AIDS+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toward an effective AIDS vaccine development.</a> Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).</li>
<li>Veillette, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Cellular+CD4+Exposes+HIV-1+Envelope+Epitopes+Targeted+by+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).</li>
<li>Wibmer, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+escape+from+HIV-1+neutralizing+antibodies+drives+increased+plasma+neutralization+breadth+through+sequential+recognition+of+multiple+epitopes+and+immunotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).</li>
<li>Kovacs, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+trimer+elicits+more+potent+neutralizing+antibody+responses+than+monomeric+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).</li>
<li>Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+multiple+conformational+States+of+free+monomeric+and+trimeric+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoproteins+after+fixation+by+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker.</a> J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).</li>
<li>Guttman, M., Lee, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+interaction+between+gp41+and+gp120+is+observed+for+monomeric+but+not+oligomeric%2C+uncleaved+HIV-1+Env+gp140%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140.</a> J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).</li>
<li>Ringe, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+strongly+influences+whether+soluble+HIV-1+envelope+glycoprotein+trimers+adopt+a+native-like+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).</li>
<li>Desormeaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+conserved+layer-3+component+of+the+HIV-1+gp120+inner+domain+is+critical+for+CD4-required+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions.</a> J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+CD4+and+CD4-mimetic+compounds+inhibit+HIV-1+infection+by+induction+of+a+short-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state.</a> PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+intrinsic+reactivity+of+the+HIV-1+envelope+glycoproteins+to+CD4-independent+infection+and+global+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity.</a> PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).</li>
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<li>Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+major+variable+regions+modulate+cold+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation.</a> J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+conserved+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+neutralization+epitopes+exposed+upon+gp120-CD4+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding.</a> J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).</li>
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<li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+to+and+from+the+CD4-bound+conformation+are+modulated+by+a+single-residue+change+in+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+inner+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain.</a> J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).</li>
<li>Xiang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+stabilization+and%2For+disruption+of+a+CD4-bound+state+reveals+distinct+conformations+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein.</a> J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).</li>
<li>Mouquet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-type+N-glycan+recognition+by+potent+broadly+neutralizing+HIV+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).</li>
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<li>Walker, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+neutralization+coverage+of+HIV+by+multiple+highly+potent+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies.</a> Nature. 477, 466-470 (2011).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte.

Dieser Assay ist optimiert, um die Wechselwirkung von spezifischen mAbs mit HIV-1 Env trimere exprimiert auf der Zelloberfläche erkennen. Sobald das Protokoll festgelegt wurde, kann es bei mittleren bis hohen Durchsatz bei geringen Gesamtmaterialkosten und geringe Mengen von Antikörpern verwendet werden. Da dieser Test ist Transfektion basiert, kann es leicht zur Koexpression der zellulären Proteine ​​wie CD4, um ihre Auswirkungen auf die Konformation Env studieren angepasst werden. Jedoch d...

Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1)-Eintrag, der trimeren viralen Hüll-Glykoproteine ​​(env) vermittelten ist der erste Schritt des Infektionszyklus. Die einzige Virusantigen exponiert an der Oberfläche des Virions präsentiert, löst das Env-Trimer neutralisierende und nichtneutralisierenden Antikörpern. Als solches stellt es einen interessanten Kandidaten für Impfstoff-Immunogen-Design. Allerdings Impfung Studien mit Env in löslicher oder rekombinanten Formen hervorgerufen Antworten mit nur minimaler Wirkung gegen die meisten primären HIV-1-Isolate 1-3. Dennoch Teil Wirksamkeit bei der RV144-Impfstoff-Studie 4 erneutes Interesse an HIV-1 Env als Immunogen Kandidaten beobachtet. Dies wurde durch eine neuere Studie beschreibt die Impfung ausgelöste Anti Env-Antikörpern waren ausreichend, um einen gewissen Schutz gegen SIV und HIV erzeugen Herausforderungen 5 bestätigt. Nachdem sie im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert, das Env glycoprotein Vorläufers gp160, läuft verschiedene post-translationale Modifikationen, die entscheidend für seine Fähigkeit, das virale Fusionsprozess Brennstoff. Die Env-Vorläufer muss ordnungsgemäß und Associate in Trimeren falten, bevor er in seine extra-zytoplasmatische gp120 und gp41 Transmembranuntereinheiten 6-10 gespalten, mit nicht-kovalente Wechselwirkungen Aufrechterhaltung des gp120-gp41 Liaison. Die infizierten Zellmaschinerie ist auch für stark Glykosylierung Env, umfassend etwa 50% seiner Gesamtmasse 11,12 verantwortlich. Die daraus resultierende komplexe Struktur ermöglicht Env zu konformativ flexible 13,14 sein, während eine Metastabilität, die gedacht wird, damit Env, sich anzupassen und bestimmte hoch immunogene Epitope, die sonst ausgesetzt wäre 15-19 verstecken, was die Bedeutung, die verschiedenen Konformationen besser zu verstehen von der einheimischen Env Trimer abgetastet. Bisher wurden verschiedene Techniken entwickelt und erfolgreich eingesetzt, um Env Konformationsänderung CH studierenanges. Allerdings unterscheiden sie sich in ihren Grenzen, wobei oft auf spezifische Kontexte Env beschränkt. Zum Beispiel, Oberflächenplasmonresonanz oder Immunpräzipitationstests Verwendung Konformation spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb), beruhen entweder auf monomeren löslichen oder gelösten Moleküle Env, die bekannt sind immungene anders als ihre trimeren Formen 20,21 sein. Neuere Studien legen nahe, dass die Spaltung auch beeinflusst Env Konformationen was die Exposition von Epitopen hauptsächlich von nichtneutralisierenden Antikörpern erkannt 14,22,23. Hier beschreiben wir ausführlich eine Methode, die für schnelle und einfache Bestimmung der Konformation von zellulär-Env-Trimere 18,24-26 ausgedrückt ermöglicht. Nach transienter Transfektion von Env in einem menschlichen adhärenten Zelllinie die Bindung von Env-spezifische Antikörper wird mit einem einfachen Chemilumineszenzreaktion nachgewiesen. Diese Technik kann auch verwendet werden, um die bevorzugte Konformation des charakterisieren konformationsabhängiger DEPENdent Antikörper. Somit stellt dieser Test ein robustes und hoch flexibel Nachweisverfahren.

<table><tbody><tr><td>HOS-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>Weiße undurchsichtige Gewebekulturplatte, 96-Well, flacher Boden</td><td>BD</td><td>353296</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin, linear, 25.000 MW</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Hergestellt in 1 mg/ml Lösung</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Human-IgG, Peroxidase konjugiert</td><td>Pierce</td><td>31413</td><td></td></tr><tr><td>Erweitertes Chemilumineszenz-Substrat</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL105001EA</td><td></td></tr><tr><td>TriStar LB 941, Plattenleser</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

konformationsänderungen auswertung der hiv-1-trimeric hüllglycoproteine ​​mit eine handy-basierte elisa-test

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1-Hüllglykoproteine (Env) vermitteln den Eintritt von Viren in Zielzellen und sind essentiell für den infektiösen Zyklus. Das Verständnis, wie diese Glykoproteine in der Lage sind, den Fusionsprozess durch ihre Konformationsänderungen anzukurbeln, könnte zur Entwicklung besserer, wirksamerer Immunogene für Impfstoffstrategien führen. In dieser Arbeit wird ein zellbasierter ELISA-Assay beschrieben, der es ermöglicht, die Erkennung von trimerischem HIV-1 Env durch monoklonale Antikörper zu untersuchen. Nach der Expression von HIV-1-trimerem Env an der Oberfläche der transfizierten Zellen werden konformationsspezifische Anti-Env-Antikörper mit den Zellen inkubiert. Ein Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Sekundärantikörper und eine einfache Chemilumineszenzreaktion werden dann verwendet, um gebundene Antikörper nachzuweisen. Dieses System ist hochflexibel und kann Env-Konformationsänderungen nachweisen, die durch lösliches CD4 oder zelluläre Proteine induziert werden. Es erfordert nur eine minimale Menge an Material und keine hochspezialisierte Ausrüstung oder Know-how. Somit kann diese Technik für das Screening von Antigenen und Antikörpern mit mittlerem bis hohem Durchsatz, wie z. B. neu isolierten Antikörpern, etabliert werden.

Unter Verwendung der oben beschriebenen allgemeinen Verfahren, passen wir das Protokoll, um die Auswirkungen von löslichen CD4 (sCD4) und coexprimierten zellulären CD4 über die Exposition der CD4i Epitope auf entweder Wildtyp (wt) oder mutierten Env zu testen, wie zuvor beschrieben, 18,24, 25,28. Abbildung 1 Die allgemeine Verfahren und die Exposition von CD4i Epitope nach der Behandlung mit sCD4 oder durch Co-Expression von zellulären CD4 18 schematisch. In 2 sCD4...

Das Verständnis der Konformationen von viralen Oberflächenantigenen ist erforderlich, um die Antikörperneutralisierung zu bewerten und das Design wirksamer Impfstoffimmunogene zu leiten. In dieser Arbeit beschreiben wir einen zellbasierten ELISA-Assay, der es ermöglicht, die Erkennung von trimerem HIV-1-Env, das an der Oberfläche transfizierter Zellen exprimiert wird, durch spezifische Anti-Env-Antikörper zu untersuchen.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, RIC, HIV, Ein-Hüll-Glykoproteine oder ENV-Bestätigung mit monoklonalen Antikörpern zu befragen. Dies wird erreicht, indem Adhärenzzellen zunächst durchtrennt werden, um chimäre HIV-One-E-NV-Proteine an der Zelloberfläche zu exprimieren. In einem zweiten Schritt werden die Zellen mit monoklonalen Anti-ENV-Antikörpern inkubiert, die je nach Epitopexposition ENV binden.Als nächstes wird ein HRP-konjugierter Sekundärantikörper hinzugefügt, um die Antikörperinteraktion durch einen Chemilumineszenz-Assay zu quantifizieren. Es werden Ergebnisse erhalten, die die relativen Spiegel der VNV-gebundenen Antikörper basierend auf den jeweils erworbenen relativen Lichteinheiten zeigen. Nun, der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der faktenbasierten Kopplung, besteht darin, dass diese Technik mit einer geringen Menge an Antikörpern und bei hohem Durchsatz durchgeführt werden kann, ein Postdoc im Labor wird diese Technik durchführen.Humane Osteosarkomzellen werden in diesem Experiment einen Tag vor der Transfektionsplatte verwendet, zweimal 10 bis vier Zellen pro Well. In einer undurchsichtigen 96-Well-Zellku

conformational-evaluation-hiv-1-trimeric-envelope-glycoproteins-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Krone Region unterschiedliche V3-Loop-Sequenzen von der Oberfläche Hüllglycoprotein (gp120) des HIV-1 kann strukturell in vielen Fällen gekennzeichnet durch in silico Faltung von Positionen 10 bis 22 der Schleife mit einer...

Bewertung von immunologisch relevanten dynamischen tertiären strukturellen Merkmale der HIV-1 V3-Loop Crown R2 Sequence durch Ab initio Folding

Wir haben einen lentiviralen Vektor, besitzt neben dem Tat-responsive LTR entwickelt, das Rev-Response-Element (RRE), dass die Expression des Reportergens in einer HIV-1 Tat-und Rev-abhängigen Weise regulieren können. Der Vektor erlaubt den spezifischen Nachweis von HIV Replikation in lebenden Zellen über die Expression von GFP.

Spezielle Kennzeichnung von HIV-1 positiven Zellen mit Hilfe eines Rev-abhängigen Lentivirale Vector mit dem Ausdruck des Green Fluorescent Protein

Das Protokoll beschreibt eine High-Throughput-Ansatz zur Bestimmung Strukturen von Membranproteinen mittels Kryo-Elektronen-Tomographie und 3D-Bildverarbeitung. Es deckt die Einzelheiten der Probenvorbereitung, Datenerfassung, Datenverarbeitung und-interpretation, und schließt mit der Produktion von einer repräsentativen Ziel für den Ansatz, die HIV-1 Envelope Glykoproteins. Diese Berechnungsverfahren sind in einer Weise, Forscher und Studenten ermöglicht, remote arbeiten und einen Beitrag zur...

Bestimmung von Molekülstrukturen von HIV Hüllglycoproteine ​​mit Cryo-Elektronen-Tomographie und automatisierte Sub-Tomogramm Averaging

Mehrere 2'-Fluoro RNA-Aptamere gegen HIV-1Ba-L gp120 mit Nanomol Affinität von einer RNA-Bibliothek isoliert...

Entwicklung von Zell-spezifischen Anti-HIV-gp120-Aptamere für siRNA

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bildung einer HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsen auf Glas unterstützt planare Doppelschichten durch Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie sichtbar zu machen. Das Verfahren kann auch mit Immunfluoreszenzfärbung kombiniert werden, um die Aktivierung und Umverteilung von Signalmolekülen, die während der HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsenbildung auftreten zu erkennen.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Wir veranschaulichen hier einen in vitro Membranbindungsassay, in dem Wechselwirkungen zwischen HIV-1 Gag und Lipidmembranen visuell analysiert werden, unter Verwendung von YFP-tagged Gag, synthetisiert in einem weizenkeimbasierten in vitro Translationssystem und GUVs, die durch eine Elektroformationstechnik hergestellt wurden.

Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes

Beschrieben ist eine Methodik, die Expression von Genen 96 quantitate und 18 Oberflächenproteine von einzelnen Zellen Ex Vivo, ermöglicht die Identifizierung von differenziell ausgedrückt, Genen und Proteinen in Virus-infizierten Zellen im Verhältnis zu nicht infizierten Zellen. Wir wenden das Konzept Studie SIV-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken.

Einzellige Quantifizierung der mRNA und Oberfläche Protein-Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken

Wir beschreiben eine zellbasierte Assays auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck von grün fluoreszierendes Protein nachweisbar durch Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie melden. Es kann verwendet werden, Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen.

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Neutralisationsepitopen auf antigenanzeigenden virusähnlichen Partikeln (VLPs) vor. Die Immunpräzipitation der aus dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) abgeleiteten VLPs erfolgt unter Verwendung von Hüllglykoproteinen-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die an Protein G-konjugierte magnetische Kügelchen gekoppelt sind. Gefangene VLPs werden anschließend einer SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse unter Verwendung viraler...

Nachweis neutralisationsempfindlicher Epitope in Antigenen, die auf VLP-basierten Impfstoffen (Virus Like Particle) mit einem Capture-Assay angezeigt werden

Hier beschreiben wir einen neu entwickelten Multiplex-Fluoreszenz-Immunoassay, der ein durchflusszytometrisches System mit zwei Reportern verwendet, um gleichzeitig zwei einzigartige Spike-Protein-Epitope auf intakten Viruspartikeln des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu detektieren, die von Angiotensin-konvertierenden Enzym-2-gekoppelten magnetischen Mikrosphären eingefangen wurden.

Profilierung von Oberflächenprotein-Epitopen auf viralen Partikeln mittels Multiplex-Dual-Reporter-Strategie

In diesem Artikel beschreiben wir einige etablierte Methoden zur Bestimmung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der Aktivierung der ungefalteten Proteinantwort (UPR), mit besonderem Schwerpunkt auf HIV-1-Infektionen. In diesem Artikel wird auch eine Reihe von Protokollen beschrieben, um die Auswirkungen von ER-Stress/UPR auf die HIV-1-Replikation und die Infektiosität der Virionen zu untersuchen.

Messung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums und der entfalteten Proteinantwort in HIV-1-infizierten T-Zellen und Analyse seiner Rolle bei der HIV-1-Replikation

Erfahren Sie die zellbasierte ELISA-Methode zur Analyse von HIV-1-Env-Konformationen und Antikörperbindung. Diese Technik ermöglicht hochdurchsatzfähige Untersuchungen mit geringen Antikörpermengen für die Impfstoffentwicklung.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

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