Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, RIC, HIV, Ein-Hüll-Glykoproteine oder ENV-Bestätigung mit monoklonalen Antikörpern zu befragen. Dies wird erreicht, indem Adhärenzzellen zunächst durchtrennt werden, um chimäre HIV-One-E-NV-Proteine an der Zelloberfläche zu exprimieren. In einem zweiten Schritt werden die Zellen mit monoklonalen Anti-ENV-Antikörpern inkubiert, die je nach Epitopexposition ENV binden.

Als nächstes wird ein HRP-konjugierter Sekundärantikörper hinzugefügt, um die Antikörperinteraktion durch einen Chemilumineszenz-Assay zu quantifizieren. Es werden Ergebnisse erhalten, die die relativen Spiegel der VNV-gebundenen Antikörper basierend auf den jeweils erworbenen relativen Lichteinheiten zeigen. Nun, der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der faktenbasierten Kopplung, besteht darin, dass diese Technik mit einer geringen Menge an Antikörpern und bei hohem Durchsatz durchgeführt werden kann, ein Postdoc im Labor wird diese Technik durchführen.

Humane Osteosarkomzellen werden in diesem Experiment einen Tag vor der Transfektionsplatte verwendet, zweimal 10 bis vier Zellen pro Well. In einer undurchsichtigen 96-Well-Zellkulturplatte, die für die Lumineszenzmessung geeignet ist. Verwendete Delcos, modifiziertes Eagle-Medium, ergänzt mit fötalem Rinderserum und Penicillin-Streptomycin, inkubieren die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid am folgenden Tag.

Bereiten Sie die Transfektionsmischung vor. Legen Sie zunächst zwei Röhren, zwei Schächte und zwei B bis zwei Schächte aus. Fügen Sie fünf Mikroliter DMEM hinzu, ergänzt mit 25 Millimolaren Hippies, gefolgt von 10 Nanogramm Tat- und Beschichtungsplasmid und 150 Nanogramm chimärem HIV, einem Hüllglykoprotein, das für Plasmid kodiert.

Beachten Sie, dass das TAT-kodierende Plasmid nur erforderlich ist, wenn tat-abhängiges HIV-Glykoprotein mit einem Hüllglykoprotein, das für Plasmid kodiert, für zwei B bei fünf Mikrolitern DMM und 450 Nanogramm Polyethylen oder PEI verwendet wird. Die Mengen der Reagenzien und der DNA sollten entsprechend der Anzahl der Vertiefungen angepasst werden, die mit demselben HIV-Glykoprotein mit einer Hüllhülle transfiziert werden sollen. Fügen Sie dann den Inhalt von zwei B bis zwei Buchten hinzu und mischen Sie es gründlich, indem Sie es 10 Sekunden lang vortexen.

Inkubieren Sie die Transfektionsmischung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten fügen Sie 10 Mikroliter der Transfektionsmischung pro Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlenoxid. Die Ali SA zur Untersuchung der Erkennung von chimärem HIV-Ein-Hüll-Glykoprotein durch monoklonale Antikörper wird zwei Tage nach der Transfektion der menschlichen Osteosarkomzellen durchgeführt.

Bereiten Sie 250 Milliliter Waschpuffer pro Platte vor, die gleichzeitig verwendet wird. Bereiten Sie 125 Milliliter Blockpuffer pro Platte vor, indem Sie dem Waschpuffer 1 % fettfreie Trockenmilch und fünf Millimolar Tris pH 8,0 hinzufügen. Entfernen Sie das Zellkulturmedium und die Transfektionsmischung von der 96-Well-Platte.

Geben Sie 100 Mikroliter Blockierungspuffer pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang. Bei Raumtemperatur wird der Überstand entfernt und 50 Mikroliter Antikörper pro Vertiefung auf die entsprechende Konzentration in Blockierungspuffer verdünnt. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Dreimal mit 100 Mikrolitern Blocking-Puffer waschen und dann den Waschvorgang dreimal wiederholen. Waschen Sie dreimal mit 100 Mikrolitern Blocking-Puffer und waschen Sie dann nach dem letzten Waschen dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer. Entfernen Sie den Sat.

Fügen Sie 100 Mikroliter Blockierungspuffer hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Bei Raumtemperatur den Überstand entfernen und 50 Mikroliter Sekundärantikörper hinzufügen, verdünnt auf 3000 in Blockierungspuffer. Nach 40 Minuten 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Dreimal mit 100 Mikrolitern Blockierpuffer waschen, gefolgt von drei Wäschen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer. Um die Proben für die Datenerfassung vorzubereiten, entfernen Sie den Überstand von der 96-Well-Platte und fügen Sie 30 Mikroliter eines x verstärkten Chemilumineszenzsubstrats pro Vertiefung hinzu. Erfassen Sie das Chemilumineszenzsignal für eine Sekunde pro Vertiefung auf einem geeigneten Plattenlesegerät.

Gemäß den Anweisungen des Herstellers war der Einfluss von löslichem CD vier oder S CD vier auf die Exposition von CD vier I-Epitopen auf Hüllglykoproteine oder ENV. Die Assay-Interaktion von CD vier mit ENV induziert ENV-bestätigende Veränderungen, die 17 B- und 48 D-Epitope freilegen, die die Co-Rezeptor-Bindungsstelle überlappen, aber die äußere Domäne, die den Antikörper zwei G 12 erkennt, nicht beeinflusst. Um den Einfluss von Punktmutationen auf die NV-Bestätigung zu bewerten, wurden zwei ENV-Mutanten verwendet: H 66 A, das eine verminderte Neigung zur spontanen Abtastung der CD-Vier-gebundenen Bestätigung aufweist, und S3 75 W, das die NV für den CD-Vier-Bindungszustand prädisponiert. Die Normalisierung der Rohdaten nach Expressionsniveaus zeigt, dass H 66 A die Erkennung von CD vier I 17 B verringert, während S3 75 W das 17 B-Signal verstärkt und ausreicht, um den Phänotyp von H 66 wiederherzustellen.

Eine Mutante, die Zellen testet, wurde mit zunehmenden Mengen eines CD-4-Expressors transfiziert. Zusammen mit dem NV zeigten die blauen Balken zunehmende Signale für die monoklonalen CD vier I Antikörper A drei, zwei und C 11, die diskontinuierliche Epitope in der inneren Domäne des ENV-Glykoproteins erkannten. Die Erkennung von GP one 20 ENV durch die beiden G 12-Antikörper wurde nicht beeinflusst.

Schließlich wurden die Rohdaten auf zwei G 12 normiert. Das Fehlen einer 32- und C 11-Modulation bei der Transfizierung von ENV mit einer Zölia-4-Mutante mit verminderter Fähigkeit, mit ENV zu interagieren, deutet darauf hin, dass die erhöhten Signale von der Wechselwirkung zwischen E NV CD vier abhingen. Nach der Beherrschung kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden.