Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress In-vitro-

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten der Therapie mit rotem Nahinfrarotlicht auf oxidativen Stress in vitro zu bewerten. Um dies zu erreichen, haben wir eine neuartige Methode zur Abgabe des Lichts entwickelt, bei der wir die Wellenlänge und Intensität manipulieren können. Wir montieren eine Xenon- oder Breitbandlichtquelle in einem Gehäuse auf einem Metallsockel und platzieren dann eine Beschichtungslinse, einen Wasserfilter und eine Eintrittsblende vor dem Licht.

Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, das von der Breitbandlichtquelle erzeugte Licht durch den Eingang, die Apertur und den Flüssiglichtleiter sowie durch eine zweite Beschichtungslinse zu leiten. Dann werden Bandbreiten- und Neutraldichtefilter angebracht, um die gewünschte Wellenlänge und Intensität des Lichts zu erhalten. Beachten Sie, dass die Filter den Durchgang eines engen Wellenlängenbereichs ermöglichen, der als Wellenbereich bezeichnet wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der Therapie mit rotem Nahinfrarotlicht, wie z. B. LEDs oder Lasern, besteht darin, dass sie eine präzise und kalibrierte Manipulation über Wellenlängen- und Intensitätsparameter ermöglicht. Dies ermöglicht es uns dann, die Abgabe des Lichts für die besten biologischen Ergebnisse zu optimieren, die die aktuelle Studie z. B. an dissoziierte Zellen liefert. Darüber hinaus kann es auch auf andere Systeme wie organotypische Modelle des Neurotraumas angewendet werden.

Wenn Sie mit einer hellen Breitbandlichtquelle arbeiten, stellen Sie sicher, dass Sie nicht direkt in die Lichtquelle blicken, da dies zu dauerhaften Sehschäden führen kann. Um die Lichtabgabevorrichtung vorzubereiten, schließen Sie eine Breitbandlichtquelle, wie z. B. eine Xenon- oder Wolframlampe, an eine geeignete Stromversorgung an. Positionieren Sie eine Sammellinse vor der Lichtquelle, um einen sortierten Lichtstrahl zu erzeugen.

Lassen Sie das Licht durch einen flüssigen Wärmefilter, um den größten Teil der Wärme aus dem Lichtstrahl zu entfernen. Positionieren Sie eine Sammellinse vor der Lichtquelle, um einen sortierten Lichtstrahl zu erzeugen. Lassen Sie das Licht durch einen flüssigen Wärmefilter, um den größten Teil der Wärme aus dem Lichtstrahl zu entfernen.

Je nach Anwendung können Sie den magazinierten Strahl auf den Eintrittsbereich eines flüssigen Lichtleiters fokussieren, um eine flexiblere Abgabe des Lichts zu ermöglichen. Am anderen Ende des Flüssiglichtleiters positionieren Sie eine zweite Beschichtungslinse und dann eine Halterung für den Interferenz- und Neutraldichtefilter. Diese Anordnung sollte einen gleichmäßig ausgeleuchteten Lichtfleck mit dem gewünschten Wellenbereich und der gewünschten Intensität erzeugen.

Der Abstand zwischen dem Ende des Lichtleiters und der Probenebene muss je nach dem Bereich, der beleuchtet werden soll, variieren. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass in Übereinstimmung mit dem Gesetz des umgekehrten Quadrats die Lichtintensität in der vorliegenden Studie abnimmt, wenn der Abstand vom Ende des Lichtleiters zunimmt. Dieser Abstand beträgt 14 Zentimeter, was zur Herstellung eines Strahlquerschnitts führt, der einen drei mal drei Well-Bereich auf einer 96-Well-Gewebekulturplatte gleichmäßig ausleuchtet.

Stellen Sie sicher, dass das Streulicht der Lampe und der zugehörigen optischen Komponenten keine anderen Proben erreichen kann, z. B. mit schwarzer Pappe. Sobald das Gerät gebaut ist, schalten Sie den Wasserkühler für den Flüssigkeitswärmefilter ein und stellen Sie sicher, dass ein Wasseraustausch durch die Filterhülle stattfindet. Schalten Sie die Stromquelle der Lampe ein und warten Sie mindestens fünf Minuten, bis die Breitbandlichtquelle vorhanden ist.

Wählen Sie zum Stabilisieren einen Schmalband-Interferenzfilter aus, um den gewünschten Wellenbereich der Beleuchtung zu erzeugen. Das von der Lampe erzeugte Licht wird in der Ebene gemessen, in der das Exemplar positioniert werden soll. Während der Behandlung.

Die Lichtmessung erfolgt mit einer kalibrierten Bestrahlungsstärkesonde, die mit einem geeigneten Spektrum verbunden ist. Strahlungsmesser. Verwenden Sie Neutraldichtefilter, um die Lichtintensität einzustellen, bis die gewünschte Leistung erreicht ist. In der vorliegenden Studie wird die Intensität des Lichts, das von jedem Interferenzfilter durchgelassen wird, so eingestellt, dass bei jedem der vier Behandlungswellenbänder eine gleiche Qualitätsausgabe erzielt wird.

Die beschriebene Verabreichungsmethode des roten Nahinfrarotlichts kann auf jeden Zelltyp oder jedes in vitro Modellsystem angewendet werden. Hier zeigen wir unsere Technik der Abgabe von Licht an Zellen mit Hilfe von Phäochromozytom oder PC-12-Zellen. Als Beispiel kultivieren Sie Zellen in Wachstumsmedien.

In 96 werden die Trays mit Polyol-Lysin beschichtet, bis sie zu 70 bis 80 % konfluent sind. Bereiten Sie die gewünschte Konzentration von Glutamat oder alternativem Stressor in Vollwachstumskulturmedien vor. Hier verwenden wir 10 millimolares Glutamat.

Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und waschen Sie sie vorsichtig dreimal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung. Geben Sie nach dem Waschen glutamathaltige Medien mit einem Gesamtvolumen von hundert Mikrolitern pro Vertiefung hinzu. Unmittelbar nach Zugabe von Glutamat oder dem Stressor der Wahl werden die Zellen einer Lichtbehandlung bei den gewünschten Wellenlängen und Intensitäten ausgesetzt, indem die Kulturplatte unter die vorbereitete Lichtabgabevorrichtung gelegt wird.

Achten Sie darauf, die Qualitätsausgabe des Lichtstrahls mit den etablierten Kombinationen von Neutraldichtefiltern zu ändern. Abhängig von der zu verabreichenden Wellenlänge. Nach Abschluss der Lichtbehandlung legen Sie die Zellen auf eine ebene Fläche und inkubieren bei 37 Grad Celsius unter Kohlendioxid-regulierten Bedingungen für 24 Stunden.

Zusätzliche Dosen der Therapie des roten Nahinfrarotlichts können ebenfalls verabreicht werden. Bevor Sie die letzte Runde der Lichtbehandlung durchführen, bereiten Sie die Reagenzien vor, die für den Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies als Indikator für oxidativen Stress verwendet werden sollen. Hier verwenden wir indizierte Diäten, die fluoreszieren, wenn sie mit einer Reihe von reaktiven Spezies reagieren, einschließlich Dilu, Fluorescein-D-Acetat, verabreichen den Zellen eine Lichtbehandlung, wie in Schritt vier beschrieben, und stellen sicher, dass die Zellen mit den gewünschten Grippen und Wellenlängen des Lichts behandelt werden.

Entfernen Sie unmittelbar nach der Lichtbehandlung das glutamathaltige Medium und waschen Sie es zweimal mit PBS. Fahren Sie mit den Assays fort, indem Sie Indikatorfarbstoffe verwenden, die fluoreszieren, wenn sie mit reaktiven Spezies gemäß den Anweisungen des Herstellers reagieren. Messen Sie die von den Indikatorfarbstoffen erzeugte Fluoreszenz mit einem Plattenleser, der auf die entsprechenden Anregungs- und Emissionseinstellungen eingestellt ist.

Verwenden Sie die Farbe des metrischen Kits, um die Proteinkonzentration in den Wells gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren. Expressen Sie die Fluoreszenzausgaben relativ zur Proteinkonzentration für jede einzelne Vertiefung und analysieren Sie die Ergebnisse dann mit Hilfe der Statistiksoftware. Die Entwicklung dieser Technik ebnet den Weg für Forscher, die die Auswirkungen mehrerer Wellenlängen und Intensitäten der Therapie mit rotem Nahinfrarotlicht auf oxidativen Stress untersuchen.

Diese Technik kann in einer Reihe von Modellsystemen verwendet werden, einschließlich dissoziierter Zellen oder organotypischer Kulturen.