Name: Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress In-vitro- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur präzisen Lichttherapie mit variablen Wellenlängen und Intensitäten zur Untersuchung oxidativen Stresses in Zellkulturen. Diese Technik ermöglicht kontrollierte Experimente für biomedizinische Forschung.

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Diese Arbeit wurde vom Neurotrauma Research Program (Western Australia) unterstützt. Dieses Projekt wird über das Road Trauma Trust Account finanziert, spiegelt aber nicht die Ansichten oder Empfehlungen des Road Safety Council wider.

1. Optische Kalibrierung: Messlichtleistung <ol><li> Um die Lichtabgabevorrichtung vorzubereiten, schließen Sie eine Breitbandlichtquelle (zB Xenon oder Wolframlampe) an eine geeignete Stromversorgung. Positionieren einer kollimierenden Linse vor der Lichtquelle, um einen kollimierten Lichtstrahl zu erzeugen. Passieren die Licht durch ein flüssiges Wärmefilter den größten Teil der Wärme aus dem Lichtstrahl zu entfernen. Abhängig von der Anwendung, den Schwerpunkt des kollimierten Strahls auf die Eintrittsöffnung eines Flüssigkeitslichtleiters, der für eine flexiblere Abgabe des Lichts (z. B. in einen Inkubator) liefert. </li><li> Am anderen Ende des Flüssigkeitslichtleiter einsetzen, eine zweite Kollimatorlinse und eine Halterung für die Interferenz und Neutralfilter. Überprüfen Sie, ob diese Anordnung erzeugt eine gleichmäßig ausgeleuchtet Lichtpunkt des gewünschten Wellenbereich und Intensität. Hinweis: Der Abstand zwischen dem Ende des Lichtleiters und der Objektebene muss je nach zu variierendie Fläche, die beleuchtet werden muss, sondern daran, dass, wenn der Abstand von dem Ende der Lichtführung zunimmt, werden die Lichtintensität zu verringern. In der vorliegenden Studie ist dieser Abstand 14cm und erzeugt einen Strahlquerschnitt, die gleichmäßig beleuchtet eine 3x3-Muldenbereich auf einem 96-Well-Platte. </li><li> Darauf achten, dass Streulicht von der Lampe und die damit verbundenen optischen Komponenten nicht in der Lage, um die Probe zu erreichen. </li><li> Schalten Sie den Wasserkühler für das flüssige Wärmefilter und sicherzustellen, dass es den Austausch von Wasser durch den Filtermantel. Schalten die Lampe Stromquelle und eine Wartezeit von mindestens 5 min für die Breitband-Lichtquelle zu stabilisieren. Anmerkung: Die Verwendung des Wasserkühlers ist erforderlich, um ein Überhitzen der Vorrichtung zu verhindern. </li><li> Wählen eines Schmalbandinterferenzfilter (in der Regel durch ihre Mittenwellenlänge, Spitzendurchlässigkeit und die Halbwertsbreite (FWHM) Bandbreite beschrieben), um den gewünschten Wellenbereich der Beleuchtung zu erzeugen. Anmerkung: Die in der vorliegenden Studie verwendete schmalbandige Interferenzfilter sind 442 nm, 550 nm, 671 nm und 810 nm. </li><li> Messen Sie die von der Lampe auf der Ebene, in der die Probe während der Behandlung positioniert werden erzeugte Licht. Gemessen unter Verwendung eines kalibrierten Lichtstrahlungssonde (Kosinus Kollektor) mit einem geeigneten Spektroradiometer verbunden, mit Anstand Software entsprechend den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verwenden Neutralfilter, um die Intensität des Lichts einzustellen, bis die gewünschte Ausgabe erhalten wird. Anmerkung: In der vorliegenden Arbeit wird die Intensität des von jedem Interferenzfilter geleitet eingestellt, um eine gleiche Quantenausgang an jedem der vier Behandlungswellenbänder zu ergeben. Es ist wichtig, um die Kalibrierung regelmäßig zu überprüfen, da die Lampenleistung kann sich ändern. Anmerkung: Nach dem Aufbau der Vorrichtung, sind die Zellen bereit, beleuchtet werden: Figur 1 eine Darstellung der Lichtabgabevorrichtung in der vorliegenden Studie verwendet.. </li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52221/52221fig1.jpg" files ftp_upload> Abbildung 1. Bild des Lichtabgabevorrichtung. Dargestellt sind die Lichtenergiequelle, Xenon-Lampe mit Gehäuse, Sammellinse, Wasserfilter, Eingangsöffnung, Flüssigkeitslichtleiter, der zweite Kollimationslinse, Filterhalter, Behandlung Rahmen und mattschwarz Karte. Man beachte, dass das schmalbandige Wellenlänge und Intensität Filter sind nicht dargestellt. 2. Zellpräparation <ol><li> Die beschriebene R / NIR-LT Liefermethode kann zu jedem Zelltyp oder in vitro Modellsystem verwendet werden; als solche die folgenden Beschreibungen der Zellkultur allgemeinen unter Verwendung wohlbekannter Techniken zur Kultur Phäochromocytom (PC12), Müller (RMC1) und primären gemischten Retinazellen. </li><li> Vor der Zellaussaat zur Lichtbehandlung und oxidativer Stress Assay immortalisierten Kulturzellen in der jeweiligen Wachstumsmedien, die geeignete Ergänzungsmittel (z. B. FBS, Antibiotika) in T75 flasks, bis 70-80% konfluent. </li><li> Lösen immortalisierten Zellen aus T75-Kolben unter Verwendung des Verfahrens für den Zelltyp geeignet z getestet werden. Trypsin. Falls erforderlich, bevor mit der Aussaat der Zellen in 96-well-Assayplatten fortfällt Vertiefungen der Assayplatte mit 10 ug / ml Poly-L-Lysin für 1 h (z. B. für PC12-Zellen) oder 10 ug / ml Poly-L-Lysin 1h mit einem O / N-Inkubation mit 10 ug gefolgt / ml Laminin (z. B. für Mischnetzhautzellen). </li><li> Zentrifugenzellen entsprechend zu sammeln (z. B. 3 min bei 405 · g für PC12-Zellen oder 10 min bei 218 × g für RMC1 Zellen), Entfernen des Überstandes und Resuspension in 8 ml der geeigneten Zellkulturmedien. </li><li> Wenn gemischt Netzhautzellen zu verwenden sind, bereiten von P0-5 neonatalen Rattenjungen durch enzymatischen Abbau (Papain) nach festgelegten Verfahren 19 </li><li> Die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Ausnahme von 0,4% (w / v) Trypanblau unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Passen Zelldichte such, die Zellen werden etwa 70 bis 80% konfluent nach 24 oder 48 Stunden in Kultur. (Für PC12-Zellen die Aussaatdichte von 4,0 x 10 5 lebensfähigen Zellen / ml, für RMC1 Zellen ist es 2,5 x 10 5 lebensfähige Zellen / ml und bei Zusammenretinazellen ist 8 x 10 5 lebensfähige Zellen / ml). Nach der Zugabe von Zellen, entweder klar oder schwarze 96-Well-Platten (für die H 2 O 2 oder DCFH-DA Assay jeweils verwendet werden), in 100 ul des geeigneten Wachstumsmedien, lassen Sie die Platte auf eine flache Oberfläche bei 37 ° C, 5 sitzen % CO 2 (oder welche Bedingungen angemessen sind für den spezifischen Zelltyp) für mindestens 24 h auf die Zellhaftung zu ermöglichen. </li><li> Kulturzellen in einem Wachstumsmedium in das entsprechende 96-Well-Schalen, bis sie 70-80% konfluent (24h für PC12 und RMC1 Zellen 48h für Mischnetzhautzellen). </li></ol> 3. Hinzufügen Glutamat Stressor zu Zellen <ol><li> Bereiten L-Glutaminsäure Mononatriumsalz-Hydrat Stressor Konzentrationen von 0-10mm in entsprechenden Voll wachsenth Kulturmedien. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und vorsichtig waschen Zellen 3 mal mit PBS (PC12) oder HBSS (RMC1 und gemischte Netzhautzellen). Nach Wäschen hinzuzufügen Glutamat enthaltenden Medien auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung. </li></ol> 4. Erste-Dosierungen von Lichtbehandlung <ol><li> Unmittelbar nach der Zugabe von Glutamat oder Stressor der Wahl, aussetzen Zellen Lichtbehandlung bei den gewünschten Wellenlängen und Intensitäten, indem Sie unter der vorbereiteten Lichtabgabevorrichtung. Achten Sie darauf, die Quanten Ausgang des Lichtstrahls mit den etablierten Kombinationen von Graufilter in Abhängigkeit von der Wellenlänge verabreicht ändern. Hinweis: In den aktuellen Experimenten ausgesetzt Zellen Lichtbehandlung für 3 Minuten die Temperatur zu halten, indem die 96-Well-Platten auf einer 37 ° C Wärmepolster ruht. Behandlungszeit kann je nach Bedarf variiert werden. <ol><li> Legen Sie eine matte schwarze Karte unter den Zellen, um Licht zu verhindern reflektieren in benachbarten Vertiefungen in der 96-well Fach für andere Behandlungsparameter bezeichnet. </li></ol></li><li> Wird die Behandlung über längere Zeiträume gewünscht, fügen 25 mM Hepes-Puffer, um den pH der Zellkulturmedien erhalten oder im Idealfall stellen die Vorrichtung und das Behandlungs Platten in einem Inkubator mit CO &amp; sub2; -Konzentration von 5% CO 2 reguliert wird, oder Bedingungen, die optimal sind, für den spezifischen Zelltyp. </li><li> Nach Abschluss der Lichtbehandlung, legen Sie die Zellen auf einer ebenen Fläche und bei 37 ° C und 5% CO 2 (oder was auch immer Bedingungen sind optimal für den Zelltyp) für 24 Stunden. Anmerkung: Zusätzliche Dosierungen von R / NIR-LT kann wie oben beschrieben nach Wunsch verabreicht werden. </li></ol> 5. Schluss Dosierung des Lichts Behandlung und Erkennung von ROS <ol><li> Vor der Durchführung der Endrunde der Lichtbehandlung, bereiten die Reagenzien für ROS Erkennung verwendet werden. Vorbereitung 50 mM Citratpuffer (pH 6,0), Triton X100, und H 2 O 2 Nachweisreagenz ArbeitsLösung (1: 2: 97-Verhältnis von 10 mM H 2 O 2 Nachweisreagenz Stammlösung; 10 U / ml Meerrettichperoxidase; 50 mM Natriumcitrat (pH 6,0)). Bereiten DCFH-DA bei einer Endkonzentration von 100 uM in geeigneten Medien. Hinweis: DCFH-DA-Reagenz für PC12-Zellen in RPMI-Medium, DCFH-DA-Reagenz für RMC1 Zellen in DMEM-Medium. Beachten Sie, dass im Handel erhältliche Nachweisreagenzien sind Differenz Empfindlichkeiten auf bestimmte ROS und Reagenzien sollte sorgfältig ausgewählt werden, um die für eine einzelne Anwendung gewünschten Informationen zu liefern. </li><li> Verabreichen Lichtbehandlung zu den Zellen, wie in Schritt 4.1-4.1.2 beschrieben. Achten Sie darauf, die Zellen werden mit den gewünschten Einflüsse / Wellenlängen von Licht behandelt. </li><li> Unmittelbar nach der Lichtbehandlung, entfernen Sie die glutamathaltigen Medien und waschen zweimal mit geeigneten Pufferlösung (bei PC12-Zellen, PBS verwendet wird und für RMC1 Zellen, HBSS verwendet wird). Führen Sie die ROS-Assays auf die Zellen wie folgt: <ol><li> H 2 O 2 2 für 15 min. In 50 ul H 2 O 2 Erkennung Arbeitslösung und Inkubation für 30 min bei RT. Messen Fluoreszenz unter Verwendung eines Plattenlesegeräts mit einer Anregungswellenlänge von 530 nm und einer Emissionswellenlänge von 480 nm. </li><li> DCF-Assay: 100 l der 100 &amp; mgr; M Lösung von DCFH-DA, um jede der Vertiefungen und Inkubieren für 30 Minuten bei 37 ° C und 5% CO 2. Druckmaterial, das 100 uM DCFH-DA und wasche mit geeigneten Pufferlösung (wie oben beschrieben) zweimal. Hinzufügen von 90 ul Pufferlösung und 10 ul Triton X100 zu jeder der Vertiefungen und vorsichtig Schütteln auf einem Orbitalschüttler für 30 Sekunden vor dem 15-minütigen Inkubation bei 37 ° C. Messen DCF ableiten Fluoreszenz unter Verwendung eines Plattenlesegeräts mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissions wavelength von 530 nm. </li><li> Express ROS Werte bezogen auf die Proteinkonzentration der Zellen in den Wells verbleibende, unter Verwendung eines kolorimetrischen Kits zur Proteinkonzentration quantifiziert gemäß den Anweisungen des Herstellers, unter Bezugnahme auf eine Standardkurve auf mg Protein berechnet. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir haben erfolgreich eine genaue und kalibrierte Lichtabgabesystem geeignet ist, einen Mechanismus für die Studie zur Optimierung der R / NIR-LT in vitro bereitzustellen. Wellenlängen- und Intensitätsparameter R / NIR-LT der Lage sind, mit diesem System genau und effektiv bearbeitet werden. Wir haben festgestellt, dass das Licht die Behandlung der Zellen nicht zum Zelltod führen, wenn auch ROS nicht bei den Wellenlängen und Dosierungen geliefert reduziert, in den getesteten Zelltypen. Höchstintensitäten nach d...

Für eine Reihe von Signalwegen und normale Reaktionen des Zellstoffwechsels, einschließlich der Neuroprotektion 1 sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erforderlich. Wenn jedoch endogenen antioxidativen Mechanismus nicht in der Lage, die Produktion von ROS zu steuern, Zellen gegenüber oxidativem Stress 2,3 erliegen. Nach Verletzung des ZNS, werden die damit verbundenen Anstieg in Gegenwart von ROS und oxidativer Stress vermutlich eine wesentliche Rolle bei der Progression der Schädigung 4,5 spielen. Trotz der umfangreichen Reihe von Strategien zur Abschwächung oxidativen Stress, die beurteilt wurden, gibt es noch keine vollständig wirksam, klinisch relevante antioxidativen Strategien zur Dämpfung von ROS-Produktion und die damit verbundenen oxidativen Stress in der klinischen Anwendung folgende Neurotrauma 6. Deshalb ist die Abschwächung des oxidativen Stress bleibt ein wichtiges Ziel für die therapeutische Intervention 7. Verbesserungen folgening R / NIR-LT sind in einer Vielzahl von Verletzungen und Erkrankungen einschließlich Senkung der kardialen Infarktgröße, renale und hepatische Komplikationen bei Diabetes, Netzhautdegeneration, ZNS-Verletzung und Schlaganfall 8, vielleicht durch die Reduzierung von oxidativem Stress berichtet. Insbesondere im Hinblick auf ZNS-Verletzung, haben präklinische Studien der Wirksamkeit von 670 nm Licht gute Effekte in Modellen der Netzhautdegeneration 9-11, Verletzungen des Rückenmarks 12, neuronalen Tod 13 gezeigt. Klinische Studien haben für trockene altersbedingte Makuladegeneration durchgeführt worden und werden derzeit für einen Schlaganfall 14, aber die Ergebnisse dieser Studien nicht vielversprechend erscheinen, möglicherweise aufgrund eines Fehlers zu einer wirksamen Behandlung beschäftigen Parameter 15. Als solche R / NIR-LT, nicht sehr stark im Rahmen der normalen klinischen Praxis bei Neurotrauma angenommen, obwohl sie eine leicht zu verwalten, nicht-invasive und relativ kostengünstige Behandlung. Hindernisse für klinische Umsetzung gehören der Mangel an einem clAnfang verstanden Wirkmechanismus und das Fehlen eines standardisierten effektiven Behandlungsprotokoll 16,17. Aktuelle Literatur in Bezug auf die Lichttherapie zeigt eine Fülle von Variationen in der Behandlungsparameter in Bezug auf Strahlungsquellen (LED oder Laser), Wellenlänge (zB 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm) Gesamtdosis (Joule-Bestrahlung / Flächeneinheit), Dauer (Belichtungszeit), Zeitpunkt (vor oder nach dem Insult), Behandlungshäufigkeit und Art der Lieferung (Puls oder kontinuierlich) 8. Die Variabilität der Behandlungsparameter zwischen den Studien einen Vergleich schwierig und hat zu Skepsis gegenüber der Wirksamkeit 16 beigetragen. Daher wird die Optimierung der R / NIR-LT eindeutig erforderlich, mit Zellkultursystemen, die zur High-Throughput-Screening-Mechanismus notwendig, um die mehreren Variablen zu vergleichen ist. Allerdings gibt es nur wenige handelsübliche Beleuchtungssysteme, die eine ausreichende Flexibilität und Kontrolle über wa bieten kannvelength und Intensität, solche Optimierungsversuche durchzuführen. Kommerziell erhältliche LED-Vorrichtungen sind im Allgemeinen nicht in der Lage, mehrere Wellenlängen oder Intensitäten, was Forscher die mehrere LED-Vorrichtungen von unterschiedlichen Herstellern, die nicht nur in der Intensität variieren kann, zu liefern, sondern auch das Spektrum der Wellenlänge des emittierten Lichts. Wir haben dieses Problem durch Verwendung eines Breitband-Xenon-Lichtquelle durch schmalbandige Interferenzfilter gefiltert, wodurch eine Reihe von Wellenlängen und Energiedichten von Licht, so dass in der Nähe, eine genaue Kontrolle der Parameter des R / NIR-LT gerichtet. Es ist wichtig zu beachten, dass die therapeutische Dosis der Behandlung wird durch die Anzahl der Photonen, die Interaktion mit dem photoacceptor (Chromophor), die im Fall von R / NIR-LT wird postuliert, Cytochrom c Oxidase (COX) 18 werden definiert. Photonenenergie geliefert mit der Wellenlänge variiert; dh gleiche Dosen von Energie bei verschiedenen Wellenlängen werden comvon unterschiedlichen Anzahlen von Photonen geschätzt. Daher wurde das Licht von der Vorrichtung emittiert wird kalibriert, um eine gleiche Anzahl von Photonen für jede der gewählten Wellenlängen zu prüfenden emittieren. Wir haben ein System, das verwendet werden kann, um R / NIR-LT in einem Bereich von Wellenlängen und Intensitäten zu Zellen in vitro zu liefern entwickelt und demonstriert die Fähigkeit, die Wirkungen des gelieferten R / NIR-LT auf ROS-Produktion in Zellen unterworfen zu messen Glutamat Stress.

<table><tbody><tr><td>OxiSelect Intrazelluläres ROS Assay Kit (grüne Fluoreszenz)</td><td>Cell Biolabs</td><td>STA-342</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed Reagenz-Molekularsonden</td><td></td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>300 Watt Xenon-Bogenlampe</td><td>Newport Corporation</td><td>6258</td><td>Sehr intensive Lichtquelle, nicht direkt in die Lampe schauen. Stellen Sie sicher, dass die Lampe während des Einschaltens ausreichend gekühlt wird</td></tr><tr><td>USB4000-FL Fluoreszenzspektrometer</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CC-3-UV Kosinuskorrektor für die Emissionserfassung</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200&mu; m Durchmesser Quarzfaseroptik</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Spektroskopie-Plattform</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2300 EnSpire Multimode Plate Reader</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Akute Toxizität, bei der Handhabung Handschuhe tragen.</td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure-Mononatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>142-47-2 (wasserfrei)</td><td></td></tr><tr><td>Phäochromozytom Ratten-Nebennierenmark (PC12)-Zellen</td> American <td>Type Culture Collection</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Medien</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert, hitzeinaktiviert, US-Herkunft</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Warm auf 37 °; C im Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Pferdeserum, neuseeländischen Ursprungs</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Warm auf 37 °; C im Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Warm auf 37 > C im Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>100 mM Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Warm auf 37 °; C im Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Warm auf 37 μg; C im Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>100X MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Warm auf 37 &Grad; C im Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Retinale Müller (rMC1)-Zellen</td><td>University of California, San Diego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Warm auf 37 °; C im Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>75 cm2 Kolben</td><td>BD Biosciences</td><td>B4-BE-353136</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25988-63-0</td><td>Aliquot und lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-134</td><td>Warm auf 37 Grad; C im Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td>Warm auf 37 °; C im Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein, Natural</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>Aliquot und bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>1X Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Warm auf 37 Grad; C im Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Trypanblaue Lösung, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>165U Papain</td><td>Worthington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Well Platten, klarer Boden, schwarz</td><td>Corning</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Costar Klare Polystyrol 96-Well Platten unbehandelt; Brunnenform: Rund; Keimfrei.</td><td>Costar</td><td>07-200-103</td><td></td></tr><tr><td>Wippe Wippe</td><td>Standard Laborfilter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Standard Lab Epuipment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutral Density Filter Papier (0.3)</td><td>THORLABS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>442 nm Bandpassfilter</td><td>THORLABS</td><td>FL441.6-10</td><td></td></tr><tr><td>550 nm</td><td>Bandpassfilter THORLABS</td><td>FB550-10</td><td></td></tr><tr><td>670 nm Bandpassfilter</td><td>THORLABS</td><td>FB670-10</td><td></td></tr><tr><td>810 nm Bandpassfilter</td><td>THORLABS</td><td>FB810-10e</td><td></td></tr><tr><td>Ungefasst &Oslash; 25 mm absorbierende Neutraldichtefilter (0,1)</td><td>THORLABS</td><td>NE01B</td><td></td></tr><tr><td>ungefasst &Oslash; 25 mm absorbierende Neutraldichtefilter (0,2)</td><td>THORLABS</td><td>NE02B</td><td></td></tr><tr><td>ungefasst &Oslash; 25 mm absorbierende Graufilter (0,3)</td><td>THORLABS</td><td>NE03B</td><td></td></tr><tr><td>ungefasst & Oslash; 25 mm absorbierende Neutraldichtefilter (0,5)</td><td>THORLABS</td><td>NE05B</td><td></td></tr><tr><td>ungefasst &Oslash; 25 mm absorbierende Graufilter (0,6)</td><td>THORLABS</td><td>NE06B</td><td></td></tr><tr><td>ungefasst & Oslash; 25 mm Absorptionsfilter (1,0)</td><td>THORLABS</td><td>NE10B</td><td></td></tr></tbody></table>

verfahren zur beurteilung der auswirkungen einer reihe von wellenlängen und intensitäten von rot / nah-infrarot-licht-therapie auf oxidativen stress in-vitro-

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Rot / Nahinfrarotlicht Therapie (R / NIR-LT) durch Laser- oder Leuchtdiode (LED) geliefert werden, verbessert funktionellen und morphologischen Ergebnisse in einem Bereich des zentralen Nervensystems Verletzungen in vivo, ggf. durch Reduzierung von oxidativem Stress. Jedoch Wirkungen von R / NIR-LT auf oxidativen Stress wurde gezeigt abhängig von der Wellenlänge oder der Intensität der Bestrahlung ab. Studien zum Vergleich der Behandlungsparameter fehlen, aufgrund der Abwesenheit von im Handel erhältlichen Geräten, die mehrere Wellenlängen und Intensitäten, geeignet für Hochdurchsatz-in-vitro-Optimierungsstudien liefern. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Abgabe von Licht in einem Bereich von Wellenlängen und Intensitäten der therapeutischen Dosis für eine gegebene Verletzungsmodell erforderlich optimieren. Wir nahmen an, dass eine Methode der Bereitstellung von Licht, in dem Wellenlängen- und Intensitätsparameter könnte leicht geändert werden könnten Bestimmung einer optimalen Dosis von R / NIR-LT zur Reduzierung reaktiver Sauerstoffspezies zu erleichtern(ROS) in vitro. Nichtkohärenten Xenon-Licht wurde mit Schmalband-Interferenz-Filter filtriert, um unterschiedlicher Wellenlänge (Mittenwellenlängen von 440, 550, 670 und 810 nm) und Fluenzen liefern (8,5 x 10 -3 bis 3,8 x 10 -1 J / cm 2) der Licht auf kultivierte Zellen. Lichtausbeute aus der Vorrichtung wurde kalibriert, um therapeutisch relevante, gleich Quanten Dosen von Licht bei jeder Wellenlänge emittieren. Reaktive Spezies nachgewiesen in Glutamat gestreßten Zellen mit Licht behandelt, mit DCFH-DA und H 2 O 2 sensitive Fluoreszenzfarbstoffe. Wir haben erfolgreich geliefert Licht bei einer Reihe von physiologisch und therapeutisch relevanten Wellenlängen und Intensitäten, um kultivierte Zellen zu Glutamat als Modell der ZNS-Verletzung ausgesetzt. Während die Einflüsse von R / NIR-LT in der vorliegenden Studie verwendet nicht eine Wirkung auf ROS durch die kultivierten Zellen erzeugten ausübt, ist das Verfahren der Lichtabgabe auf andere systems einschließlich Einzel Mitochondrien oder mehrere physiologisch relevanten organotypischen Kulturmodellen und könnte verwendet werden, um Auswirkungen auf eine Reihe von Zielkriterien des oxidativen Stoffwechsels zu bewerten.

Der Ausgang von Licht bei einer Wellenlänge von 670 nm abgegeben wurde mit Neutraldichtefiltern, um Zellen mit einer Reihe von Fluenzen umfassend eine Dosis eines zuvor gezeigt vorteilhaft in vivo (0,3 J / cm 2) 20 bis 670 nm sein, Licht zu bestrahlen kalibriert. Da die Zahl der Neutralfilter vor der Lichtquelle erhöht wird, die Intensität (W / m 2) verringert, so dass weniger Licht auf den Zielbereich passieren. In Tabelle 1 sind die Kalibrierungsdaten von 670nm Licht von der Lichtquelle ...

Nichtkohärentes Xenonlicht wurde durch schmalbandige Interferenz- und Neutraldichtefilter geleitet, um kultivierten Zellen Licht unterschiedlicher Wellenlänge und Intensität zuzuführen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Auswirkungen der Rot-/Nahinfrarotlichttherapie auf die Produktion reaktiver Spezies in vitro zu bewerten: Unter Verwendung der getesteten Parameter wurden keine Effekte beobachtet.

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress In-vitro-

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten der Therapie mit rotem Nahinfrarotlicht auf oxidativen Stress in vitro zu bewerten. Um dies zu erreichen, haben wir eine neuartige Methode zur Abgabe des Lichts entwickelt, bei der wir die Wellenlänge und Intensität manipulieren können. Wir montieren eine Xenon- oder Breitbandlichtquelle in einem Gehäuse auf einem Metallsockel und platzieren dann eine Beschichtungslinse, einen Wasserfilter und eine Eintrittsblende vor dem Licht.Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, das von der Breitbandlichtquelle erzeugte Licht durch den Eingang, die Apertur und den Flüssiglichtleiter sowie durch eine zweite Beschichtungslinse zu leiten. Dann werden Bandbreiten- und Neutraldichtefilter angebracht, um die gewünschte Wellenlänge und Intensität des Lichts zu erhalten. Beachten Sie, dass die Filter den Durchgang eines engen Wellenlängenbereichs ermöglichen, der als Wellenbereich bezeichnet wird.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der Therapie mit rotem Nahinfrarotlicht, wie z. B. LEDs oder Lasern, besteht darin, dass sie eine präzise und kalibrie

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Biologie

Dieses Video beschreibt die Technik zur Visualisierung von oxidativem Stress in kultivierten Organoiden. Diese Arbeit hilft dabei, das Ausmaß des oxidativen Stresses aufgrund der ROS-Akkumulation in den verschiedenen Zelltypen zu verstehen, die in einem Organoid nach der Behandlung mit verschiedenen ROS-Modulatoren vorhanden sind.

Fluoreszenzsonden-Imaging-Assay: Eine Technik zur Visualisierung von oxidativem Stress in kultivierten Darmorganoidzellen von reaktiven Sauerstoffspezies, die mit Induktoren behandelt wurden

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Dieses Video zeigt einen Spot-Plate-Assay, der auf die Bewertung der oxidativen Stressreaktionen von Bakterienstämmen zugeschnitten ist. Einige Stämme produzieren Pyomelanin, ein antioxidatives Pigment. Umgekehrt weisen Stämme, die mit einem Testmittel behandelt wurden, was zu einer verminderten Pyomelaninproduktion führte, eine erhöhte Anfälligkeit für oxidativen Stress auf, was zu einer verminderten Zellviabilität im Vergleich zu Pyomelanin-produzierenden Stämmen führte.

Ein Spot-Plate-Assay zur Bewertung oxidativer Stressreaktionen in Bakterienstämmen

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Diffuse Optische Spektroskopie zur quantitativen Beurteilung Akute ionisierender Strahlung induzierte Hauttoxizität Mit einem Maus-Modell

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Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

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Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der gesamten ulzellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit 2',7'--Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (DCFH-DA) vor. Diese Methode kann die zelluläre ROS-Lokalisierung in anhaftenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren und die ROS-Intensität mit einem Fluoreszenzplattenleser quantifizieren. Dieses Protokoll ist einfach, effizient und kostengünstig.

Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies insgesamt in anhaftenden Zellen durch 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat-Färbung

Dieses Protokoll beschreibt die Bewertung des subzellulären Kompartiment-spezifischen Redoxstatus innerhalb der Zelle. Eine redoxempfindliche Fluoreszenzsonde ermöglicht eine komfortable ratiometrische Analyse in intakten Zellen.

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Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE) als Fluoreszenzfarbstoffsonde unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screening-Ansatzes. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur quantitativen Beurteilung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den drei verschiedenen hepatozellulären Karzinomzelllinien.

Hochdurchsatz-Screening-Bewertung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff

Die Quantifizierung sowohl oxidierter als auch reduzierter Formen von Glutathion (GSSG bzw. GSH) wurde durch die Verwendung von Ortho-Phthalaldehyd (OPA) erreicht. OPA wird stark fluoreszierend, sobald es an GSH konjugiert wird, ist aber nicht in der Lage, GSSG zu konjugieren, bis es reduziert wird. Hier beschreiben wir einen multiparametrischen Assay, um beides mittels Proteinquantifizierung zur Normalisierung zu quantifizieren.

Schnelle Quantifizierung von oxidierten und reduzierten Formen von Glutathion unter Verwendung von ortho-Phthalaldehyd in kultivierten Säugetierzellen in vitro

Lernen Sie eine Methode zur präzisen Lichttherapie mit variablen Wellenlängen und Intensitäten zur Untersuchung oxidativen Stresses in Zellkulturen. Diese Technik ermöglicht kontrollierte Experimente für biomedizinische Forschung.

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress In-vitro- (Video) | JoVE Journal

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress In-vitro-

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