Name: Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Lernen Sie die Messung der glatten Muskelfunktion im isolierten Gewebebadsystem. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Rezeptorsignalwegen und Muskelreaktivität in der Pharmakologieforschung.

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Das Watts Laboratory im Laufe der Jahre und Dr. Marlene Cohen und Kathy Schenck dafür, dass sie uns diesen Assay vor über zwei Jahrzehnten beigebracht haben. NIGMS R25GM074119 die Entwicklung dieses Lehrmoduls für einen Kurzkurs in Integrativer und Systemischer Pharmakologie unterstützt, der von 2005 bis 2013 auf dem Campus der MSU stattfand.

HINWEIS: Alle in diesem Dokument beschriebenen Verfahren werden nach den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der Michigan State University gegründet geführt. 1. Systemvorbereitungs und Setup <ol><li> Achten 5 l physiologischer Kochsalzlösung (PSS), die die für eine Gewebebad Kontraktion Experiment, das bis zu 50 ml Gewebebäder verwendet benötigte Menge ist; siehe Tabelle 2 PSS Rezept. Berechnen insgesamt erforderliche Volumen durch die Anzahl der Gewebebädern Badumwälzungen und anschließende Multiplikation mit der Anzahl der erforderlichen Gewebe Wäschen. <ol><li> Verwenden Sie Tabelle 2 als Leitfaden für die Herstellung von PSS. Auflösen der Salze in etwa 4 l Wasser. HINWEIS: HPLC - Typ I Wasser wird empfohlen </li><li> 8 ml 1 M CaCl 2 -Lösung (147 g / l Bei Verwendung des Dihydrat-Salz) zu der Lösung, so dass die Gesamtlösung ist 1,6 mM Calcium. </li><li> Quanten sufficit PSS Lösung auf 5 L. </li></ol&gt; </li><li> Vorheizen Gewebebad System auf 37 ° C durch Einschalten der rezirkulierenden erhitztes Wasserbad. Critical Schritt: Jede Komponente des Systems ist mit Wassermantel, sicherzustellen, dass sie in Serien miteinander verbunden sind. Die Durchflussrichtung ist von entscheidender Bedeutung - dafür sorgen, dass Wasser fließt in jede Komponente auf dem niedrigsten Stacheldraht-Anschluss und bei der höchsten Stacheldraht Verbindung. </li><li> Schalten Sie Datenerfassungssystem. Macht auf den Kraftaufnehmer mindestens 15 min vor dem Experiment zu temperieren. HINWEIS: Die meisten Kraftaufnehmer beschäftigen Dehnungsmessstreifen, die empfindlich auf Temperaturschwankungen sind und eine thermische Drift zunächst nach Spannung gesetzt wird. </li><li> Starten Sie Software zur Datenerfassung und gewährleisten Zusammenhang mit Datenerfassungssystem. Bitte folgen Herstellung Anweisungen zur Aktivierung Datenaufzeichnung. </li><li> Achten Sie darauf, die Kraftaufnehmer vor Gewebe im Gewebe Bad und vor Datenaufzeichnung gestartet platziert kalibriert; follow Anweisungen des Herstellers für die Kalibrierung. </li><li> Schließen Sie das Gewebebad System zu einem 95% O 2/5% CO 2 für medizinische Zwecke Gasflasche und auf Gaslecks und dann das System drucklos. </li><li> Füllen Sie die Gewebebad Behälter mit PSS und die Lösung Zeit, um eine optimale Temperatur zu erreichen. Prime das System und entfernen Sie Luftblasen im System und Schläuche. </li><li> Prüfen Gewebebad Belüfter konsistente Lösung Belüftung, die die PSS-Puffer oxygeniert und liefert die Brownsche Bewegung, Medikamente, die im Gewebebad während des Experiments eingeführt wird verteilen gewährleisten. Stellen Sie sicher, Belüftung / Blasen nicht Gewebebewegung, die Datenaufzeichnungen stören verursachen; verringern Gasstrom nach Bedarf. HINWEIS: Die Gewebebad und Datenerfassungssystem sind nun bereit, das Experiment zu starten. </li></ol> 2. Gewebepräparation <ol><li> Idealerweise sezieren Gewebe aus dem Tier unmittelbar vor der Verwendung und kann direkt into PSS. HINWEIS: Einige Gewebe können in PSS über Nacht bei 4 ° C gespeichert werden, aber entsprechende Kontrollen muss getan werden, um Gewebefunktion nach längerer Lagerung zu validieren; siehe Abschnitt 6. </li><li> Verwenden Sie die Aorta als das Gewebe in dieser Übung. </li><li> Anesthetize die Ratte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts und legen Sie die Rattenrückenseite nach unten. Betäubung Bestätigen über eine Zehen Prise und dem Verlust der Reflexantwort auf diesen schmerzhaften Reiz. Hinweis: Dieses Protokoll verwendet 70 mg / kg Pentobarbital durch eine intraperitoneale Injektion verabreicht. Richtlinien des Instituts für Nager Anästhesie können abweichen. </li><li> Erstellen eines Pneumothorax durch Herstellen eines Einschnitts mit einer Schere entlang der Membran an der Unterseite der Rippen. Dann setzen die Inzision von der Unterseite des Brustkorbs zum Sternum und halbieren. </li><li> Präparieren Sie weg oder legen beiseite jene Organe, die an der Spitze der Wirbelsäule sind und suchen Sie die Aorta, die direkt entlang der Wirbelsäule liegt. HINWEIS: Diese step bietet eine klare Arbeitsraum zu sezieren die Aorta. </li><li> Sever alle Verbindungen zu der Aorta; aus der Speiseröhre, der Lunge usw., und schneiden die Aorta senkrecht zur Wirbelsäule in der Ebene der Membran. </li><li> Halten Sie das Aorta mit einer Pinzette und mit einer Schere die Aorta von der Wirbelsäule zu sezieren. Starten Sie die Dissektion in der unteren Membranfläche angrenzend an die Wirbelsäule und die Arbeit zum Herzen hin. Achten Sie darauf, zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um nicht ziehen oder zerren an der Aortagewebe, die das Gewebe schädigen können zu nehmen. </li><li> Unmittelbar danach die Aorta in die vorbereitete Dissektion Schale mit PSS. HINWEIS: Dissektion der Aorta in Ringe am besten in einem Seziertisch Gericht, das einen schwarzen Silastic Stiftung hat getan. Dies ermöglicht die Verwendung von Drähten, die verwendet werden können, um die Aorta kanülieren und an der Schale befestigt werden, wodurch die Stabilität während der Dissektion Schale. Der schwarze Hintergrund bietet dagegen das Sezierung hilft. Es sollte bei Verwendung Kanülieren Drähte Endothels entnommen werdenial Zellschicht kann mit überschüssiger Reibung der Draht gegen das Lumen des Gefäßes entfernt werden können. </li><li> Werfen Sie einen Draht und einen kleinen Winkel von 90 ° an einem Ende und drücken Sie den abgewinkelten Ende in das Silastic Grundlage, um den Führungsdraht zu verankern. Legen Sie die gesamte Aorta in der Dissektion Gericht. </li><li> Halten Sie das Ende des Führungsdrahtes mit einer Pinzette, und dann sanft führen Sie das Kabel in das Lumen der Aorta. </li><li> Verwenden einer Pinzette, und schieben Sie die Aorta auf den Draht. Wenn das freie Ende des Führungsdrahtes zu sehen ist, die Kurve der Draht vorsichtig und legen Sie das freie Ende in die Silastic Gründung der Schale, um das Gewebe zu stabilisieren. </li><li> Mit kleinen Vannas Schere und Pinzette, entfernen Sie die perivaskulären Fettgewebe und alle anderen Fremdgewebe, Blutgerinnsel, usw., bis der thorakalen Aorta erscheint weiß und etwas faserig. </li><li> Entfernen Sie die gereinigt Aorta aus Draht und mit einer Schere die Aorta in Ringe, die etwa 3-5 mm in der Breite sind abgeschnitten. </li><li> Ein Aortaring auf einer von einem Paar von tiUSGABE Haken, indem Sie den Haken und mit einer Pinzette vorsichtig schieben Sie den Ring auf Haken. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem zweiten Haken. Achten Sie darauf, um die Haken zu gewährleisten nicht verheddern; siehe Abbildung 3. </li><li> Überprüfen Sie, dass jeder Haken hat eine andere Seidenfaden befestigt. Überprüfen Sie, ob ein Haken hat einen kleinen verknoteten Schleife aus Seide, die zur Befestigung an einer Glas- oder Edelstahlstange ermöglicht, während die andere ist eine 4.10 cm langes Stück Faden, der von Hand gebunden mit dem Kraftaufnehmer sein wird; siehe Abbildung 3. HINWEIS: Wenn die Aorta an den Haken befestigt ist, ist das Gewebe, bereit, in das Gewebebad angebracht zu werden; siehe Abbildung 3. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 2,14 bis 2,15, um eine zweite Aortenring im zweiten Gewebebad Kammer montieren. </li></ol> 3. Die Gewebe Platzierung in Bath <ol><li> Man beachte, dass in diesem System werden die Gewebebädern selbst stationär sind. Zu dieser Zeit füllen die Gewebebäder mit warmen, belüfteten PSS und lassen Sie die Lösung zu kommen, um Temperature. </li><li> Mit der Seidenfaden, binden eine der Haken an der Gewebepräparation mit dem Stift auf dem Edelstahlstange. Dieses Ende in das Gewebe Badkammer. Schließen Sie den Stab zu einem Ringständer und das andere Ende in der Färbung Gericht mit PSS gefüllt, um Gewebe in Puffer eingetaucht zu halten; siehe Abbildung 3. <ol><li> Setzen Sie den Stab und Gewebe im Gewebebad Kammer und stellen Sie sicher, das Gewebe ist vollständig in PSS eingetaucht und der Stab ist sicher; siehe Abbildung 3. </li><li> Binden Sie die andere Naht auf den Kraftaufnehmer und stellen Sie sicher, um ein Durchhängen in der Naht zwischen dem Gewebe und den Kraftaufnehmer zu verlassen. HINWEIS: Dieser Durchhang wird durch Anpassung des Mikrometer entfernt werden; siehe Abbildung 3. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite Aortenring und Gewebebad Kammer. </li></ol> 4. Einstellen Passive Tension HINWEIS: Jedes Gewebe hat eine Länge (Lo), an der glatten Muskelzellen reagieren optimally. Vorversuche die optimale Streckziehspannung, welche erzielt diese Länge ist für jeden einzelnen Gewebetyp durchgeführt werden, zu prüfen, zu bestimmen. Die Brustaorta von Ratten hat eine optimale passive Dehnungsspannung von 4 g. <ol><li> Verwenden Sie die Mikrometer / Zahnstange und Ritzel, um die Spannung zu erhöhen, 2 g und warten auf das Gewebe zu Plateau zu erreichen. Sobald Plateau erreicht ist, erhöhen Spannung eine weitere 2 g und warten auf das Gewebe zur Stabilisierung. HINWEIS: In den Aortenringe, nachdem die Anfangsspannung von 2 g ist untergegangen und Plateau erreicht, sollte das Gewebe dann auf ~ 1,6 g entspannen. Eine zweite Anwendung von 2 g würde das Gewebe zu bringen ~ 3,6 g, aus dem das Gewebe wieder zu entspannen und die Spannung nimmt ab. Somit nach Zugabe von 4 g Gesamtspannung, sollte die Software angeben etwa 3,2 g Spannung. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite Aortenring und Gewebebad Kammer. </li></ol> 5. Die Gleichgewichtseinstellung und Arzneimittelherstellung <ol><li> Äquilibrieren Sie die Gewebe für60 min nach dem Auftragen passive Spannung auf das Gewebe. </li><li> Während des Gleichgewichtsphase, waschen Sie die Gewebe alle 15-20 min. Lassen Sie das Gewebe Bad und ersetzen Sie die PSS mit PSS aus einem Reservoir erwärmt. HINWEIS: Während dieser Zeit wird das Gewebe zu entspannen, die durch den Verlust der passive Spannung angedeutet ist. </li><li> Während dieser Zeit der Zubereitung von Drogen für den Versuch, die mindestens 1.000 mal konzentrierter als die tatsächliche Konzentration in dem Bad benötigen, so dass nur ein kleines Volumen des Medikaments Lager benötigt wird, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. </li></ol> 6. Erste Herausforderung <ol><li> Am Ende des Äquilibrierungsperiode, waschen das Gewebe ein letztes Mal, Daten speichern und wieder auf Null alle Eingänge. </li><li> Wählen Sie einen Agonisten (Verbindung, die aktive Kontraktion verursachen wird), auf die das Gewebe reagiert. HINWEIS: In der Brustaorta von Ratten, die arteriellen glatten Muskeln aktiv zu einer alpha-adrenergen Rezeptor-Agonisten Vertrag aufgrund der Innervation derGewebe durch das sympathische Nervensystem. Ein adrenergen Agonisten nicht sinnvoll in Darmgewebe sein da adrenergen Agonisten verursachen Entspannung. In diesem Fall könnte ein Rezeptor-Agonisten, wie Acetylcholin (cholinergen Rezeptor) verwendet werden. Eine Alternative zu beiden Phenylephrin und Acetylcholin ist, eine Nicht-Rezeptor-Agonisten, wie hohen Kalium (K) als den ersten Auftrag. In der glatten Muskulatur arbeitet hohen K indirekt offenen Kalziumkanäle und damit als ein allgemeiner Index der glatten Muskulatur Integrität angesehen. <ol><li> Führen Sie die erste Herausforderung oder den Wake-up Herausforderung durch Zugabe von 10 -5 M Phenylephrin dem Gewebebad. Um diese Konzentration in 50 ml Gewebebad zu erreichen, fügen Sie 50 ul einer 10 -2 M Phenylephrin Lösung. HINWEIS: 50 ul in 50 ml PSS ist ein 1/1000-Verdünnung, so dass die Endkonzentration 1,000x weniger als Lager oder 10 -5 M. Die Kenntnis der Menge und konsistente Pflege des Volumens innerhalb Gewebebad chamber ist entscheidend für die Bestimmung der endgültigen Arzneistoffkonzentration. </li></ol></li><li> Zugabe von 10 -5 M Phenylephrin dem Gewebebad und erlauben die Kontraktion zu Spitze und dann Plateau, wenn die Steigung der Daten zu Null wird. Stellen Sie sicher, jeden experimentellen Ereignis post experimentelle Analyse helfen zu erfassen. </li><li> Nach dem Hochplateau, waschen Sie die Agonisten gründlich durch Entleeren und Auffüllen des Gewebebad Kammer mit neuen PSS. Stellen Sie sicher, diese Ereignisse als auch aufzuzeichnen. ANMERKUNG: Eine Faustregel ist, dass die Konzentration des Agonisten in der Wanne verringert 10fach mit jeder Wäsche. Obwohl, kann mehr als 3-4 Wäschen notwendig sein, um das Gewebe wieder auf sein Gleichgewicht Grundlinientonus (Zug) zu bringen. </li><li> Lassen Sie das Gewebe Rest zu Studienbeginn Ton für ~ 10 min, bevor Sie fortfahren. </li></ol> 7. Experiment HINWEIS: Prazosin, ein alpha-adrenergen Rezeptor-Antagonist, wird dem Gewebebad Kammer eingebracht, um die Konzentration bzw. verschiebenonse Kurve auf Phenylephrin (PE); dies ist eine nachweisbare Antagonismus. <ol><li> Einem Bad, fügen dem Fahrzeug (H 2 O) in dem Prazosin wurde aufgelöst. Zum anderen, fügen Sie die entsprechende Konzentration von Prazosin. In diesem Fall werden 25 ul Fahrzeug einem Bad und 25 ul von 10 -5 M Konzentration von Prazosin zu der anderen, um eine 5 x 10 -9 M oder 5 nM Konzentration in dem Bad zu erreichen. Anmerkung: Während der Zugabe des Fahrzeugs unnötig erscheint in diesem Beispiel, ist es zwingend, so zu tun, als mit anderen Fahrzeugen, die eine potentielle vasoaktiven zu sein (beispielsweise DMSO, Ethanol, Acetat) haben. Fügen Sie die entsprechenden Fahrzeugs, auch wenn wenig Beweise gibt es für vasoaktive sein. </li><li> Lassen Fahrzeug / Prazosin in den Bädern und nicht das Gewebe Waschen für 1 Stunde. <ol><li> Während Gewebe im Gleichgewicht, bereiten mehrere Konzentrationen von Agonisten (PE). Umfassen ein breites Spektrum von Konzentrationen von Konzentrationen entlocken keine Antwort (zB &lt;/ Em&gt; 10 -9 M PE) zu Konzentrationen, die die maximale Reaktion (übertreffen zB 10 -4 M PE). Seit Konzentrations-Wirkungs-Kurven sind logarithmisch in der Natur, machen sechs separate Stammlösungen von PE (10 -6 bis 10 -1 M) über Verdünnungsreihen von der 10 -1 M-Stammlösung. Sicherstellen, dass die für jede Konzentration benötigte Volumen etwas größer als das Dreifache des Gesamtvolumens für alle Bäder (dh&gt; 300 ul) benötigt. </li></ol></li><li> Mit Hinzufügen Agonisten, wie in Tabelle 1 beschrieben. HINWEIS: Dieses Experiment wird eine kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurve auf PE zu generieren; jede Iteration berücksichtigt die Menge der Substanz bereits an dem Bad zugesetzt. Zugänge auftreten, bis sie Kontraktion nicht mehr zu erhöhen, oder die gesamte Kurve ein Plateau erreicht hat. <ol><li> Fügen Sie jede Wirkstoffkonzentration einzeln, bis das Gewebe Schwelle erreicht ist. </li><li> Wenn keine Änderung auftritt, fügen Sie den nächsten Konzentration in derSerie; siehe Tabelle 2. Anmerkung: Der Zeitpunkt dieser Zusätze hängt von der Agonist verwendet. Zum Beispiel, Noradrenalin und Phenylephrin Kontraktion entwickelt sich schnell, und sollte innerhalb weniger Minuten ein Plateau. Im Gegensatz dazu entwickelt Endothelin-1 Kontraktion langsam und nicht für fast 45 Minuten ein Plateau. Andere Experimente können auf dem Gewebe nach dem Aufbau einer Kurve, wie dies getan werden kann, solange wie (1) die Substanz auswäscht; und (2) gezeigt werden kann, dass das Gewebe wieder in den normalen Kontraktionsverhalten und wird nicht durch den vorhergehenden Stimulationen beeinflusst. </li></ol></li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Achten Sie darauf, die Daten unmittelbar vor und nach einem Eingriff zu sparen (zB aufwachen oder Voll Kurve). </li><li> Suche und den Gewebegrundlinie für jedes Gewebe Badkammer / Eingangskanal, der in der Datenanalyse helfen werden. </li><li> Sobald die Grundlinie gesetzt wird, suchen Sie die maximale Reaktion für jede Konzentration, und notieren Sie die change von der Grundlinie. Nacheinander durch jede der Konzentrationen bewegen und notieren Sie die Grundlinienverschiebung. </li><li> Graph der resultierenden Daten. Tun Sie dies in jedem Grafik-Programm. HINWEIS: Graph Pad Prism für Pharmakologen gestaltet, und dies ist für die Art des Experiments hier vorgestellt. </li></ol>

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</ol>

Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Messung der isometrischen Kraft als Forschungswerkzeug ist über 150 Jahre alt, aber es die prototypische Technik zur Charakterisierung Rezeptor in kontraktilen Gewebe 2 ist weiterhin. Die Leistungsfähigkeit dieser Technik besteht in ihrer Einfachheit und Vielseitigkeit: durch Aufzeichnen Antworten durch zunehmende Konzentrationen eines Agonisten in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Antagonisten hervorgerufen, kann eine Vielzahl von Informationen über die pharmakologischen Eigenschaften eines jeden Medikaments Rezeptors abgeleitet werden, die bindet es 3-5. Experimente dieser Art sammeln auch Informationen über die Wettbewerbs versus nicht wettbewerbsfähig Natur der verwendeten Antagonisten sowie Rezeptorheterogenität und unspezifische Medikamentenwirkungen 6-8. Somit kann mit einfachen Permutationen dieser isolierten Gewebebad Experiment kann eine relativ vollständige pharmakologische Profil der Rezeptoren, Agonisten induzierten Muskelkontraktion Vermittlung erzeugt werden. In Bezug auf Agonismus, the relative Wirksamkeit (E max) und Wirksamkeit (EC 50) eines Agonisten eines bestimmten Gewebes kann berechnet und verglichen, um Antworten von anderen Agonisten in demselben Gewebe 1 wird. In unserem Versuch wurde die Brustaorta von Ratten entweder Vehikel oder die α 1 -adrenergen Rezeptor-Antagonist Prazosin (5 nM) für eine Stunde vor der Zugabe der α 1 -adrenerge Agonist Phenylephrin dem Gewebebad und Erzeugen Kontraktion inkubiert. 2 stellt modifizierte Ergebnisse von 1. Die grünen Antworten wurden mit der maximalen Kontraktion durch PE erreicht markiert als max markiert, die als solche gekennzeichnet ½ maximale Kontraktion und dann mit dem PE-Konzentration verbunden, dass die Reaktion verursacht. Die Identifizierung dieser Werte ist Identifizierung der wirksamen Konzentration eines Agonisten, die eine Hälfte max (50%) Antwort oder EC50-Wert erreicht. Leider hat die Verwendung Agonist abhängiger Parameters nur um festzustellen, Rezeptorbindungseigenschaften kann kompliziert sein 9. Idealerweise zusätzliche Experimente unter Verwendung von Rezeptor-Antagonisten erlauben die Berechnung von zwei wichtige Parameter, die Schlüssel zu definieren, die Wechselwirkung zwischen einem Wirkstoff und einem Rezeptor sind: -log 10 des Antagonisten Dissoziationskonstante (pK B) und der 10 -log des molaren Antagonist Konzentration notwendig, zwei-fache Rechtsverschiebung in der Konzentrations-Wirkungs-Kurve (pA 2) 10 auslösen. Sowohl K B und 2 pA Verstärkungs ihre Nützlichkeit aus der Tatsache, daß sie Agonisten-unabhängigen Werten, und konstant, selbst zwischen verschiedenen Geweben 11. Aus den Daten in Abbildung 2 kann pK B unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet werden, und basierend auf EC 50 -Werte anderswo berechnet: EC 50 in Abwesenheit von Prazosin = 2 x 10 -8 M EC 50 in der PreSinn von Prazosin = 7 x 10 -6 M Lösen für K B in der folgenden Gleichung: log (dr-1) = log [B] - log K B Wo: [B] = Antagonistenkonzentration, oder 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3 dr = Dosisverhältnis von EC50-Wert in Gegenwart von Antagonisten / EG 50 in Abwesenheit. Wenn es eine Verschiebung nach rechts, so wird dieser Wert größer als eins sein. Somit: dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M oder 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350 Setzt man für [B] und dr: log (350-1) = -8 - log K B 2,54 = -8 - log KB pK B = 10,54 Dieser Wert für Prazosin ist konsistent mit den erhaltenen Werten, wenn Prazosin wirkt mit einem α 1 -adrenergen receptbzw. 12,13, was darauf hindeutet, daß der adrenerge Rezeptor vermitteln Kontraktion auf Phenylephrin ist das α 1 -adrenergen Rezeptor. Mehrere Schritte sind kritisch für den Erfolg dieser Versuche. Gewebe muss in PSS nach der Sektion bleiben, um den Verlust der Lebensfähigkeit des Gewebes zu verhindern. Jede isometrische Muskelvorbereitung hat eine optimale Länge Spannungsbeziehung, die maximale Kraft vor dem Passiv Spannung 14,15 erzeugt. Für die in diesem Protokoll beschriebenen Experiment wurde eine optimale passive Spannung zuvor kurz Zugabe Schritten von 0,5 g passiver Spannung auf das Gewebe bestimmt. Das Gewebe sollte ohne Ton beginnen und dann nach 30 min Äquilibrierungspuffer wurde das Gewebe mit einer maximalen Konzentration von KCl (80 mM), die aktive Ton erzeugt in Frage gestellt. Dann wurde das Gewebe gewaschen und bis zur Grundlinientonus zurückzukehren. Nach 15 Minuten zu Beginn der Studie wurde eine weitere 0,5 g passive Spannung gesetzt und dieser Prozess wiederholt, bis ein Plateau vonaktive Spannung wurde mit zusätzlichen passiven Spannung erreicht. In Vorversuchen wurden 4 g insgesamt passive Spannung bestimmt, um eine maximale aktive Spannung Generation in Aortenringen erreichen, und somit diese Summe der Spannungen an die Ringe vor der Äquilibrierung gegeben. Verfahrenstechnisch ist es am besten vor passive Spannung Anwendung auf Null, sondern kann jederzeit vor dem Versuch erfolgen. Überdehnung Gewebe an jedem Punkt in dem Experiment oder Dissektion wird sich negativ auf die Lebensfähigkeit des Gewebes und experimentellen Ergebnissen. Dies ist besonders dann wichtig, wenn Anordnen Gewebe in der Wanne, wie dieser Schritt hat die höchste Wahrscheinlichkeit übermäßige Dehnung. Ausreichendes Waschen, in Anzahl und Dauer ist für reproduzierbare Effekte erforderlich. Eine zweite Herausforderung zu früh nach einer ersten Herausforderung, vor oder Gewebe wurden zum Ausgangsspannung zurückgesendet werden, in abweichenden Reaktionen führen. Wenn Studium reversible Antagonisten / Inhibitoren sollten Gewebe nicht vor gewaschen, um zusätzlich Agonist, als inhibitor Konzentration verringert. Es gibt bemerkenswerte Vorteile und Nachteile für den isolierten Gewebebad Assays. Nachteile: Die Gewebe können unterschiedliche Grade der Beschädigung während der chirurgischen Entfernung oder der Platzierung der Ringe an den Haken zu erfahren. Da die Endothelzellen der inneren Auskleidung des Aortenrings muss darauf von der Platzierung des Rings an Haken ergriffen, um nicht diese Zellschicht zu beschädigen. Gewebe können auch deutlich unterschiedliche Zeitdauern, in denen sie lebensfähig Gewebebad sind, und dies hat zu ermitteln; nicht alle Gewebe gleich sind. In diesem Sinne kann Gewebe in ihrer Reaktionsfähigkeit im Laufe des Tages ändern, so dass Zeitkontrollen zu einem notwendigen Steuer für jedes Experiment. Ein gutes Beispiel dafür ist die Meerschweinchentrachea, die Kontraktilität maximal um 100% während einer typischen 8 h Experiment verbessert. Medikamente, die in Wasser schlecht löslich sind, kann in dem PSS auszufällen. Schließlich kumulative einnd nicht kumulative Zugaben von einem Medikament, das ein Agonist könnte zu unterschiedlichen Ergebnissen führen, wenn Rezeptordesensibilisierung auf den Agonisten auftritt; Angiotensin-II ist ein solches Medikament, das schnelle Tachyphylaxie zeigt. Vorteile: Einer der Hauptvorteile der Gewebebad-Experimente ist, dass es in Echtzeit; kann man den Versuch sehen, wie es sich entwickelt und kann schnell machen Schlussfolgerungen und nächste Schritte zu planen, sowie Fehlerbehebung während eines Experiments. Ein Experiment dauert einen Tag, um zu tun. Multiple Gewebe kann typischerweise von einem Tier hergestellt werden, so dass ein Tier als seine eigene Kontrolle dienen, und das erhöht die Festigkeit eines Experiments. Man kann auch das Gewebe von anderen Faktoren zu isolieren, so daß eine relativ reine Reaktion des Gewebes auf das Medikament zu testen. In vitro Experimente wie Gewebebad System ermöglichen auch die Verwendung einer kleinen Menge an Arzneimittel im Vergleich zu einem in vivo-Versuch. Die hier beschriebene grundlegende experimentelle Design sein kannextensiv modifiziert, um die Aufnahme von zusätzlichen Parametern oder die Einführung von anderen externen Stimuli ermöglichen. Zum Beispiel Zugabe von Elektroden ermöglichen elektrisches Feld Stimulation der Nerven innervieren 16,17. Mit dem Zusatz von thermischer oder pH-Sonden können die Effekte von Temperatur und pH auf die kontraktilen Reaktionen gemessen 18,19 werden. Auf ähnliche Weise können Sauerstoff ganz oder teilweise mit N 2 auf Hypoxie induzierte Effekte zu bewerten ersetzt werden. Darüber hinaus können die gleichen Grundprinzipien der isometrischen Kontraktionsmessung in diesem Video verwendet, um Systeme, die die gleichzeitige Messung der isometrischen Spannung Entwicklung und Veränderungen der intrazellulären Calcium 20 gestatten zu entwickeln. Signaltransduktion wird auch leicht untersucht, da Systeme existieren, die eine Gewebeprobe während einer Reaktion schnell zu gefrieren, so dass die Aktivität eines Signaltransduktionsweges System kann biochemisch verifiziert werden. Die Variation equipment die verwendet werden können, dies zu tun, ist enorm. Das ganze System, entweder von Hand gebaut oder automatisiert, können aus mehreren verschiedenen Unternehmen erworben werden. Die Gewebebäder und Gewebe-Halter im Sinne dieses Protokolls sind mundgeblasen (Gewebebäder) und von Hand gebaut (Inhaber) durch eine in-house Michigan State University Werkstätten.

Die Disziplin der Pharmakologie ist die isolierte Gewebebad System seit über 150 Jahren verwendet. Die Vielseitigkeit dieses Systems hat Wissenschaftler erlaubt in der ganzen Welt, um Rezeptoren und Rezeptor-Signaltransduktion zu charakterisieren, mit dieser Erkenntnis, die die Grundlage von Therapien, die Millionen von Menschen mit Erkrankungen oder Störungen, wie Bluthochdruck, Herzinsuffizienz, Diabetes, gastrointestinalen Erkrankungen, Blasen behandelt wurden Dysfunktion, Asthma und Schluckstörungen, um nur einige zu nennen. Bis heute bleibt das isolierte Gewebebad eine wichtige Facette der Arzneimittelentwicklung und Grundlagenforschung, da es dem Gewebe als Gewebe funktionieren. In diesem JoVE Lektion wird ein formales Protokoll gemeinsam genutzt, um eine visuelle und virtuelle Experiment unter Verwendung der Daten aus einer isolierten Gewebebad Experiment, das isometrische Kontraktion misst, die Rezeptorcharakterisierung ermöglicht demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass das Gewebe eine lebendend als Ganzes funktioniert Gewebes mit einer physiologischen Ergebnis (Kontraktion oder Relaxation), die für den Körper ist. Es ist eine Synthese von Schritten (drug-Rezeptor-Wechselwirkung, Signaltransduktion, second messenger Erzeugung, Änderung in der glatten Muskulatur Erregbarkeit und Veränderung der Gewebefunktion). Während andere Techniken ermöglichen Studium jedem dieser Schritte (zB Radioligand für die Arzneimittelaffinität, die Messung der zweiten Boten-Bindung), ermöglicht die Integration aller dieser Schritte 1 das isolierte Gewebebad Technik. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Beibehaltung der Gewebefunktion ermöglicht die Berechnung der wichtigsten pharmakologischen Variablen, die in einem Gewebe gegen ein Mobil Einstellung mehr sinnvoll sind; es näher kommt, wie die untersuchten Medikamente würden im Körper als Ganzes zu arbeiten.

<table><tbody><tr><td>LabChart Software</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>7.2</td></tr><tr><td>PowerLab (4 Kanäle)</td><td>ADInstruments</td><td>ML760</td><td></td></tr><tr><td>QuadBridge (4 Kanäle)</td><td>ADInstruments</td><td>ML112</td><td>ML112</td></tr><tr><td>Gras Adapterkabel</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC11</td><td>MLAC11</td></tr><tr><td>Grass Kraft-Weg-Wandler</td><td>Grass Instrument Co</td><td>FT03</td><td>FT03 Gras</td></tr><tr><td>Transmitter Kabel</td><td>Grass Instrument Co</td><td>TAC-7 REV-1</td><td></td></tr><tr><td>BNC auf BNC Kabel</td><td>Instrumente</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 2100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>IC-2100</td></tr><tr><td>Gewebebad</td><td>Mehrere Quellen&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Physiologische Salzlösung</td><td></td><td></td><td>PSS</td></tr><tr><td>Geflochtene Seidennaht</td><td>Harvard Gerät</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>Ringständer</td><td>Humboldt MFG Co</td><td>H-2122 7</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschalen</td><td>Handgefertigt mit Silikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Schlauch</td><td>VWR Scientific</td><td>63010-100</td><td>R-3603</td></tr><tr><td>Schlauchschellen</td><td>Cole-Parmer Instrument Co</td><td>06832-08</td><td>SNP-8</td></tr><tr><td>50 ml Muskelbad</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Wärmekammern</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Gas Dispersion Tube</td><td>Ace Glass</td><td>7202-06</td><td>7202-02</td></tr><tr><td>Mikrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom Stands</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dreipolige Klemmen</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>S-Verbinder</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>Gewebehaken</td><td>Handgefertigt im Haus</td><td>Individuelle</td><td></td></tr><tr><td>Gewebedissektion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereomikroskop MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>Stereomaster Mikroskop Faseroptische Lichtquelle</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td>12562-36</td></tr><tr><td>Kultur Petrischale</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 Glas</td></tr><tr><td>Sylgard Silikon Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 170 Kit</td></tr><tr><td>Vannas Schere</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-150</td><td>160-150</td></tr><tr><td>Splitter & Fixierzange</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-55</td><td>160-55</td></tr></tbody></table>

die messung der smooth muscle function in den isolated tissue bath-anwendungen pharmakologie forschung

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolierte Gewebebad-Assays sind ein klassisches pharmakologisches Werkzeug zur Bewertung von Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen in einer Vielzahl von kontraktilen Geweben. Obwohl diese Technik seit über 100 Jahren angewendet wird, trägt die Vielseitigkeit, Einfachheit und Reproduzierbarkeit dieses Assays dazu bei, dass er ein unverzichtbares Werkzeug für Pharmakologen und Physiologen gleichermaßen bleibt. Gewebebadsysteme sind in einer Vielzahl von Formen und Größen erhältlich, die es einem Wissenschaftler ermöglichen, Proben zu bewerten, die so klein sind wie die mesenterialen Arterien der Maus und so groß wie das Ileum des Schweins – wenn nicht sogar größer. Im Mittelpunkt des isolierten Gewebebad-Assays steht die Möglichkeit, konzentrationsabhängige Änderungen der isometrischen Kontraktion zu messen und zu zeigen, wie die Wirksamkeit und Potenz kontraktiler Agonisten durch Erhöhung der Konzentrationen von Antagonisten oder Inhibitoren manipuliert werden kann. Auch wenn die allgemeinen Prinzipien relativ ähnlich bleiben, ermöglichen die jüngsten technologischen Fortschritte eine noch größere Vielseitigkeit des Gewebebad-Assays, indem sie computergestützte Datenaufzeichnungs- und Analysesoftware integrieren. Dieses Video demonstriert die Funktion des isolierten Gewebebads zur Messung der isometrischen Kontraktion einer isolierten glatten Muskulatur (in diesem Fall Thoraxaortenringe der Ratte) und vermittelt die Arten von Wissen, die mit dieser Technik geschaffen werden können. Enthalten sind detaillierte Beschreibungen der Dissektion und Aufbereitung des Aortengewebes, der Platzierung von Aortenringen im Gewebebad und der korrekten Gewebeäquilibrierung vor dem Versuch, Tests der Lebensfähigkeit des Gewebes, des Versuchsdesigns und der Durchführung sowie der Datenquantifizierung. Die Aorta wird mit isometrischen Kraftaufnehmern verbunden, deren Daten mit einem kommerziell erhältlichen Analog-Digital-Wandler und einem Brückenverstärker erfasst werden, die speziell für den Einsatz in diesen Experimenten entwickelt wurden. Die zu diesem System gehörende Software wird verwendet, um das Experiment zu visualisieren und die erfassten Daten zu analysieren.

In Bezug auf Agonismus, kann die relative Wirksamkeit (E max) und Wirksamkeit (EC 50) eines Agonisten in einem gegebenen Gewebe berechnet und verglichen, um Antworten von anderen Agonisten in demselben Gewebe 1 wird. In unserem Versuch wurde die Brustaorta von Ratten entweder Vehikel oder die α 1 -adrenergen Rezeptor-Antagonist Prazosin (5 nM) für eine Stunde vor der Zugabe der α 1 -adrenerge Agonist Phenylephrin dem Gewebebad und Erzeugen Kontraktion (Abbildung 1) inkubiert. Abbildung 2 präsentiert geändert Ergebnisse von 1. Die grünen Antworten markiert die maximale Kontraktion durch PE erreicht markiert max, der ½ maximalen Kontraktion als solche markiert und dann mit dem PE-Konzentration verbunden, dass die Reaktion verursacht. Die Identifizierung dieser Werte ist Identifizierung der wirksamen Konzentration eines Agonisten, die eine Hälfte max (50%) Antwort oder EG erreicht <sub&gt; 50 Wert. Das war in diesem donegraphically example.Computer Software, die zur Kurvenanpassung und die Berechnung der EC 50 -Werte können logistische Funktionen für sigmoidale Kurven verwendet werden, verwendet. Bei der Erzeugung und Interpretation dieser Ergebnisse ist es wichtig, sowohl niedrige als auch hohe Konzentrationen von Agonisten zu verwenden, um die Konzentration-Antwort-Kurve zu erstellen. Ohne genug Punkte, um eine stabile Basislinie und die maximale Hochebene zeigen, kann EC 50 und E MAX nur geschätzt werden. Dies wurde graphisch in diesem Beispiel gemacht. Computersoftware, die logistischen Funktionen für sigmoidale Kurven verwendet, kann für die Kurvenanpassung und Berechnung von EC 50 Werte verwendet werden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> Abb. 1: Schematische Bad Tissue-Karikatur, die einen Ring von Gewebe in der doppelwandigen platziert, mit Wassermantel Gewebe bath. Puffer und Abfluss werden durch eine 3-Wege-Glashahn in die Basis der Kammer integriert geregelt. O 2 / CO 2 wird über einen Belüfter, der mit einer Dichtung des Lecks der PSS oder Gas zu verhindern abgedichtet eingeblasen wird. Umluft Eingang unter dem Ausgabe, um eine ordnungsgemäße Rückführung zu erhalten und die Bildung von Luftblasen, die Temperatur disregulation führen würde, zu verhindern. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> Abb. 2: Brustaorta von Ratten + Endothel Die Abbildung zeigt vier getrennte Experimente (verschiedene Tiere und von verschiedenen Forschern auf verschiedenen Setups, wie durch unterschiedliche Farben dargestellt getan), die Fähigkeit von Prazosin, um eine PE-induzierten Kontraktion verschieben testen. Prazosin (5 nM) deutlich verschoben PE-induzierte Kontraktionskurve nach rechts in einer parallelen Weise. Abbildung 3: Brustaorta von Ratten + Endothelium Graphical Schätzung der EC 50 Werte für PE in Abwesenheit (Fahrzeug) und Anwesenheit (Prazosin) des Antagonisten.. Grüne Linie (Gruppe C) nur markiert. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Salz </td><td> MW (g / mol) </td><td> 5 Liter </td><td> FINAL mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (Gramm) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,45 </td><td> 37,99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 1,75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136,1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> MgSO4• 7H20 </td><td> 246,5 </td><td> 1,45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,21 </td><td> 6.25 </td><td> 14,9 </td></tr><tr><td> Traubenzucker </td><td> 180,16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0,05 </td><td> 0,03 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: normale physiologische Salzlösung (PSS) Rezept Inhalt des bikarbonatgestützte PSS in diesem Experiment verwendet.. Eingeschlossen sind die Molekulargewichte aller Salze und die Menge an 5 l dH 2 O zugegeben, um die gewünschte Konzentration zu erzielen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Die Konzentration im Bad </td><td> Die Zugabe von Agonist zu Bad gemacht </td></tr><tr><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 50 ml 1 x 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -9 M </td><td> 100 ml 1 x 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -8 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -5 </td></tr><tr><td> 1 x 10 -7 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -7 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -6 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -6 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -5 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -4 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -1 M </td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Tissue Badezusatz Agonist-Konzentrationen Die Menge des Agonisten zu jedem Bad zu Pro hinzugefügt werdenperly konstruieren kumulative Konzentrations-Antwort-Kurven. Die gewünschte Badkonzentration durch Zugabe von sequentiellen Mengen von steigenden Konzentrationen des Agonisten erreicht wird. Jedes hinaus berücksichtigt die Konzentration des Agonisten bereits im Bad vorhanden. Dies wird durchgeführt, um die Zunahme des Volumens im Gewebebad, das von unter Verwendung steigender Mengen von einer einzigen Konzentration des Agonisten führen würde minimieren.

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der isometrischen Kontraktion in einem isolierten glatten Muskelpräparat unter Verwendung eines isolierten Gewebebadsystems und computergestützter Datenerfassung.

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Tonus der glatten Muskulatur zu messen. Dies wird erreicht, indem zuerst Gewebe sezieren und präparieren. Der zweite Schritt besteht darin, das Gewebe in einem isolierten Gewebekanal zu montieren.Anschließend wird die Vitalität des Gewebes überprüft und isometrische Kontraktionsmessungen durchgeführt. Letztendlich dient die isolierte Gewebebad-Präparation zum Testen der Rezeptorfunktion, der Rezeptorsignalübertragung und der glatten Muskelreaktivität. Im Allgemeinen liegen die Hauptvorteile dieser Methode in der Flexibilität des Systems, der Schnelligkeit, mit der Ergebnisse erzielt werden, sowie darin, das gesamte Gewebe intakt zu halten.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in jedem Bereich zu beantworten, der Arzneimittel verwendet, um in die Signalübertragung von Rezeptoren oder die glatte Muskulatur einzugreifen. Es gibt einige Vorbereitungen, die besonders betont werden müssen. Es ist entscheidend, das Gewebekammer-System auf 37 Grad Celsius vorzuwärmen, indem man das umlaufende, beheizte Wasserbad einschaltet. Das Wasser muss in jede Komponente über die tiefste Nippelverbindung eintreten und über die höchste Nippelverbindung austreten.Jede Komponente muss verbunden sein. Die Kraftaufnehmer sollten kalibriert sein und müssen außerdem mindestens 15 Minuten vor dem Experiment eingeschaltet werden, um ihre Temperatur auf ein Gleichgewicht zu bringen. Anschließend, nach dem Anschließen des Gases, auf Lecks prüfen und dann das System unter Druck setzen.Nachdem das System mit Lösung gefüllt wurde, sollte es unbedingt entlüftet und von Luftblasen befreit werden. Es ist außerdem ratsam, die Belüfter des Gewebeküvettenbads zu überprüfen. Eine gute Belüftung verteilt die Wirkstoffe effektiv, destabilisiert das Gewebe jedoch nicht unmittelbar vor dem Experiment.Präparieren Sie das Gewebe. Nach der Anästhesie der Ratte wird mit einer Schere ein Pneumothorax erzeugt. Schneiden Sie entlang des Zwerchfells am unteren Ende des Rippenbogens. Schneiden Sie dann vom unteren Ende des Rippenbogens bis zum Brustbein und halbieren Sie das Gewebe. Entfernen Sie die Organe über der Wirbelsäule, um die Aorta zu finden, die direkt entlang der Wirbelsäule verläuft. Trennen Sie nun alle Verbindungen zur Aorta und durchtrennen Sie die Aorta senkrecht zur Wirbelsäule auf Höhe des Zwerchfells.Halten Sie anschließend vorsichtig die Aorta und dissezieren Sie die Aorta vom Wirbelkörper. Beginnen Sie im unteren Zwerchfellbereich neben der Wirbelsäule und arbeiten Sie sich in Richtung Herz vor. Achten Sie darauf, die Aortengewebe nicht zu ziehen oder zu reißen, da dies unmittelbar Schäden verursachen kann.Legen Sie die Aorta in eine Präparierschale, die PSS enthält. Nehmen Sie nun einen Draht und biegen Sie ihn leicht im 90-Grad-Winkel. Befestigen Sie das abgewinkelte Ende des Drahtes an der Unterseite der Präparierschale.Bringen Sie dann vorsichtig den Führungsdraht in das Lumen der Aorta ein und schieben Sie die Aorta auf den Draht auf. Wenn das freie Ende des Drahtes sichtbar wird, biegen Sie es sanft und drücken es in den Untergrund, um das Gewebe zu stabilisieren. Entfernen Sie nun mit kleinen Venus-Scheren und einer Pinzette das perivaskuläre Fettgewebe und andere überflüssige Gewebeteile, bis die Aorta thoracica weiß und leicht faserig erscheint.Nachdem überschüssige Gewebe entfernt wurden, die saubere Aorta vorsichtig vom Draht lösen. Beenden Sie diesen Abschnitt, indem Sie die Aorta in drei bis fünf Millimeter breite Ringe schneiden. Ein erreichbarer Aortaring.Halten Sie zwei Gewebehaken mit Nahtmaterial bereit, um sie in der Badkammer zu befestigen. Ein Haken sollte eine Naht mit einer kleinen verknoteten Schlaufe zur Befestigung an einer Stange aufweisen. Der andere Haken benötigt ein 10 bis 14 Zentimeter langes Stück Nahtmaterial.Um einen Knoten zu binden, befestigen Sie vorsichtig ein Paar dieser Gewebehaken an jedem Aortaring. Achten Sie darauf, dass sich die Haken nicht verheddern. Überführen Sie anschließend jedes Gewebestück in eine Schale mit PSS von Raumtemperatur, wobei ein Gewebeträger an einem Stativ befestigt ist.Nächster Schritt: Ziehen Sie die verknotete Schlaufe über den Zapfen der Stange und verwenden Sie das lange Stück Nahtmaterial, um das Gewebe oben zu halten. Dann setzen Sie die Stange in die Kammer ein und vergewissern Sie sich, dass die Stange sicher befestigt ist. Nun verbinden Sie die Naht vom verbleibenden Haken mit dem Kraftaufnehmer.Lassen Sie genügend Spiel in der Naht, damit die Spannung zwischen Kraftmesstransducer und Gewebe mit dem Messmikrometer angepasst werden kann. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Ring in jeder Kammer. Stellen Sie nun die passive Spannung ein.Verwenden Sie den Mikrometer, um die Spannung auf zwei Gramm zu erhöhen, und warten Sie, bis die Spannung im Gewebe nicht weiter ansteigt. Erhöhen Sie dann die Spannung um weitere zwei Gramm und warten Sie erneut auf die Änderung der Spannung. Zum Abschluss.Die Spannung sollte nun bei etwa 3,2 Gramm liegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang an jedem Ring in jeder Kammer. Nachdem alle passiven Spannungen eingestellt wurden, lassen Sie die Gewebe eine Stunde lang equilibrieren.Während dieser Zeit das PSS alle 15 Minuten erneuern und andere Vorbereitungen für das Experiment durchführen, beispielsweise die Zubereitung der Wirkstoffe am Ende der Eichphase. Das Gewebe ein letztes Mal spülen, die Daten speichern und alle Eingaben zurücksetzen. Anschließend gemäß den Angaben im textlichen Protokoll die erste Reizung durchführen.Stellen Sie sicher, dass diese Schritte in der Software dokumentiert werden. Nach der initialen Herausforderung wird sich die Spannungsänderung einpendeln. Anschließend spülen Sie das Herausforderungsmedikament aus, sodass der Tonus des Gewebes einen Grundwert erreicht.Lassen Sie das Gewebe nun etwa 10 Minuten bei diesem Grundtonus ruhen, wobei ein Bad das Fahrzeug, in diesem Fall Wasser, und das andere Bad erhält. Geben Sie ausreichend Prazosin für eine Konzentration von fünf Nanomolar im Bad hinzu. Lassen Sie die Gewebebäder eine Stunde lang inkubieren, ohne Spülen.Reparieren Sie inzwischen das Phenol-Rin in einer breiten Konzentrationsreihe entlang einer logarithmischen Kurve. Fügen Sie nach einer Stunde Phenyl-Rin-Agonist in zunehmenden Konzentrationen in das Bad hinzu, um eine kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurve zu erzeugen. Warten Sie nach jeder Zugabe, bis die Gewebereaktion ein Plateau erreicht hat, bevor Sie die nächste Konzentration zugeben.Führen Sie weitere Zugaben so lange durch, bis sich der Tonus des Gewebes nicht mehr ändert oder bis die gesamte Dosis-Wirkungs-Kurve ein Plateau erreicht hat. Stattdessen wurde die Aorta thoracica eine Stunde lang in dem Alpha-1-adrenergen Rezeptorantagonisten POZ sim inkubiert, bevor der Alpha-1-adrenerge Agonist Phenyl rine in das Gewebebad gegeben wurde, um kumulative Kontraktionsdosis-Wirkungs-Kurven aufzuzeichnen. Die maximale und halbmaximale Kontraktion durch Phenyl rine an dem Kontrollgewebe mit dem Fahrzeug allein ist grün markiert.Die halbe maximale Wirkung kennzeichnet die effektive Konzentration des Wirkstoffs. Die gleichen Messungen für das mit Razin behandelte Gewebe sind in Schwarz dargestellt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Funktion der glatten Muskulatur in einem isolierten Gewebekanal messen kann.

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Forschung

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Biologie

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