Name: Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Lernen Sie die Rasterkraftspektroskopie zur Untersuchung von Einzelmolekül-Haftung an AFM-Spitzen. Diese Methode ermöglicht präzise Adhäsionsmessungen mit Polyethylenglykol-Verbindern.

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Die Autoren danken der DFG (Hu 997/2-2) für die finanzielle Unterstützung. Die FS bekennt sich zur Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr wurde gefördert durch das Elitenetzwerk Bayern im Rahmen des Promotionsprogramms Material Science of Complex Interfaces. Das SKi bedankt sich beim SFB 863 für die finanzielle Unterstützung.

HINWEIS: Siehe Abbildung 2 für einen Überblick über den Prozessablauf, das die Herstellung, die Datenerfassung und Datenanalyseschritte. 1. Setup-Reagenz HINWEIS: Alle Chemikalien müssen mit Vorsicht behandelt werden, und damit eine Laborkittel, Schutzhandschuhe und Augenschutz zu verwenden. Alle Arbeiten müssen in einem Laborabzug durchgeführt werden. Insbesondere sollten spezielle Handschuhe bei Chloroform Gebrauch abgenutzt werden. <ol><li> Verwenden Sie Chemikalien mit geringem Wassergehalt, wie trockenem Chloroform schnell und trocken lagern, aber nicht länger als eine Woche. Speichern sowohl Chemikalien als bei -20 ° C und unter Stickstoff- oder Argongas, weil APTES ((3-Aminopropyl) triethoxysilan) (siehe Tabelle 1) und PEG (Polyethylenglykol) sind hygroskopisch und PEG unterliegt Oxidation in Luft. </li><li> Um häufige Exposition der Aktie gegenüber Luftsauerstoff und Feuchtigkeit zu vermeiden, bereiten kleinere Teilmengen, im Idealfall in einem Handschuhfach-System mit einem Stickstoff Atmospre. </li></ol> 2. Geräte-Setup HINWEIS: Um mögliche Kreuzkontamination zu vermeiden, verwenden Sie frische und saubere Gefäße für jeden Schritt. <ol><li> Gesäuberte Glas und Pinzette in Waschmittellösung für 30 min in einem Ultraschallbad bei 60 ° C. </li><li> Spülen und beschallen Geräte aus Schritt 2.1 zweimal gründlich mit hochreinem Wasser. </li><li> Wärmegeräte aus Schritt 2.1 in RCA-Lösung (Reinstwasser, Wasserstoffperoxid und Ammoniak (5: 1: 1)) bis 75 ° C in einem Ofen für 45 Minuten und anschließend Spülen sie mit Reinstwasser. </li><li> Zum Schluß wird der Glaswaren und Pinzette unter einem Strom von trockenem Stickstoff oder in einem Ofen (100 ° C, 3 h). </li></ol> 3. Tipp Funktionalisierung HINWEIS: Verwenden einer Pinzette, Behälter, usw. aus Edelstahl, PTFE, Glas oder anderen Materialien, die in organischen Lösungen ggf. chemisch stabil ist. Wenn nicht anders angegeben, die Durchführung aller Schritte bei RT. Die Höhe der Inkubationslösung benötigt wird, hängt von der Anzahl der Cantilever-Chips. Stellen Sie sicher, dass die Ausleger sind in den jeweiligen Lösungen zu jeder Zeit eingetaucht. HINWEIS: Verwenden Sie eine Kapuze, um das Einatmen von organischen Dämpfen zu vermeiden. <ol><li> Bildung von OH-Gruppen auf Auslegeroberfläche (&quot;Aktivierung&quot;) (ca. 0,5 h): <ol><li> Verwenden einer Pinzette, an die frische Cantilever-Chips zu platzieren (Material: SiN, Federkonstante: 10-100 pN / nm) auf einer sauberen Glasobjektträger und legte sie in eine Plasmakammer (100 W). </li><li> Evakuieren Kammer (~ 0,1 mbar). </li><li> Flutkammer mit Sauerstoffgas und evakuieren Sie es erneut. </li><li> Aktivieren Sie das Plasmaverfahren (Leistung: 20%, Dauer: 15 min, Prozessdruck: 0,25 mbar). </li></ol></li><li> Amino-Silanisierung von Auslegern (ca. 1 h): <ol><li> Bereiten Sie die 2,5 ml APTES-Lösung (siehe Tabelle 1) in einer Glaspetrischale - tun dies im Idealfall während des Plasmaprozesses. </li><li> Immediately nach dem Plasmaverfahren, tauchen jeden Cantilever 1 Sekunde lang in Aceton und sie unmittelbar danach in der APTES Lösung. </li><li> Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Die Cantilever-Chips vorsichtig zweimal in 10 ml Aceton und einmal in 10 ml Chloroform zu spülen. </li><li> Optional letzte Schritt: Platzieren Cantilever-Chips aus dem vorhergehenden Schritt auf eine saubere Glasplatte und bäckt sie für 30 min bei 70 ° C. Beachte, dass es auch alternative Strategien zur Oberflächenaktivierung, beispielsweise UV-Behandlung 12. </li></ol></li><li> PEGylierung (ca. 2 h): HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3.3.1-3.3.4 während Amino-Silanisierung. NHS und Maleimid Gruppen unterliegen einer Hydrolyse in wässrigen Umgebungen und PEG selbst wird einer Oxidation in Luft. Daher Timing (insbesondere zwischen den Stufen) ist ein kritischer Parameter. Siehe 13 für weitere Informationen. <ol><li> Bereiten Sie die Chloroform-Lösung (siehe Tabelle 1). </li><li> Zur Vermeidung von Kondensation, Pulver warmen PEG bis zu RT vor dem Öffnen des aliquoten und einem Gewicht von den entsprechenden Betrag. </li><li> Für die Kopplung von Polymeren oder Lipiden mit Aminogruppen, separat zu lösen NHS-PEG-NHS (6 kDa) und Methyl-PEG-NHS (5 kDa) in der Chloroformlösung durch Vortexen, bis sie vollständig gelöst sind. Siehe Tabelle 1 für die Konzentration. <ol><li> Alternativ. für die Kupplung von Polymeren mit Thiolgruppen getrennt lösen Mal-NHS- PEG und Methyl-PEG-NHS in der Chloroformlösung. </li></ol></li><li> Mischen der Lösungen, wie erforderlich, um eine bestimmte Anzahl Verhältnis zwischen der NHS- oder maleimide- und methyltermini PEG Moleküle (typischerweise 1: 500) einzustellen. Man beachte, dass das ideale Verhältnis ist iterativ in einer Reihe von Vorbereitungsexperiment Zyklen bestimmt werden. </li><li> Inkubieren Ausleger Chips in der PEG-Lösung für 1 h in einem Chloroform gesättigte Atmosphäre um ein Verdampfen des Chloroforms zu verhindern. </li></ol></li><li> Sondenmolekül Konjugation(&gt; 1 h): HINWEIS: In der folgenden 3.4.1-3.4.3, sind drei Beispiele für die kovalente Kopplung von unterschiedlichen Sondenmolekülen auf die AFM-Spitze beschrieben. Für jedes Molekül das Protokoll angepasst werden muss. Ferner ist zu beachten, daß in Beispiel 1 und 3 NHS-Chemie, während in Beispiel 2 die Thiol funktionalisierten Polymers PI- g -PS an das PEG über Maleimid- Chemie gekoppelt verwendet. Details siehe 14. <ol><li> Für Poly (aminosäure) Poly-D-Tyrosin (40-100 kDa) <ol><li> Lösen Sie die Polytyrosin konjugiert Sondenmolekül in 1 M NaOH. Die Konzentration ist anzupassen, um 1 mg / ml. </li><li> Tauschen das NaOH für Natriumboratpuffer (pH 8,1) unter Verwendung von Spin-Entsalzungssäulen (7 kDa MWCO) unmittelbar vor der Funktionalisierung </li><li> Zuerst mit 5 ml Chloroform und dann mit 5 ml Ethanol und schließlich mit 5 ml Boratpuffer spülen Auslegern. </li><li> Inkubieren Sie die Cantilever-Chips für 1 Stunde in der Polytyrosin Boratpufferlösung und dann mit Boratpuffer spülenund Reinstwasser. Bewahren Sie in ultrareinem Wasser bis zur Messung. </li></ol></li><li> Für Polymere mit einem linearen Backbone (Polyisopren, 119 kDa) mit gepfropften Seitenketten (Polystyrol, 88 kDa) 14 <ol><li> Lösen Sie die PI- g -PS in trockenem Chloroform. Einzustellen, die Konzentration des konjugierten Lösung auf 4 mg / ml. </li><li> Spülen Sie die Ausleger mit 5 ml Chloroform und Inkubation für mindestens 1 Stunde in der Konjugation Lösung. </li><li> Wieder spülen in 5 ml Chloroform und speichern in Chloroform in einer Chloroform-gesättigten Umgebung bis zur Messung (Chloroform Verdampfung zu verhindern). </li></ol></li><li> Für die Lipid PAPST <ol><li> Lösen Sie PAPST in trockenem Chloroform. Die Konzentration ist anzupassen, um 20 mM. </li><li> Spüle die Cantilevern mit 5 ml Ethanol und 5 ml hochreinem Wasser vor der Inkubation der Ausleger für 1 h in der Lipidlösung. </li><li> Nach Inkubation spülen Cantilever mit 5 ml Chloroform, 5 ml Ethanol und 5 ml warmem, Reinstwasser (in dieser Reihenfolge), um nicht gebundenen Sondenmoleküle zu entfernen und loszuwerden, Chloroform Rückstände zu bekommen. Verwenden funktionalisierten Spitzen sofort. Alternativ speichern sie in Chloroform, bis sie benötigt. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung der Spitze Funktionalisierung am Beispiel der NHS-Chemie. (B) Die chemische Bindung verwendet, um ein Sondenmolekül an der Spitze über eine Aminogruppe zu befestigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> 4. Oberflächenvorbereitung <ol><li> Selbstorganisierten Monoschicht (SAM) HINWEIS: Wie Oberfläche zum ersten Beispiel eine selbstorganisierte Monoschicht gewählt. Siehe Literatur 15 </sup&gt; für Details. <ol><li> Saubere Glasobjektträger mit Reinigungslösung und dann zweimal in ultrareinem Wasser in einem Ultraschallbad für 30 Minuten jeweils. Dann, als zusätzliche Reinigungsstufe, legen Sie sie in der RCA-Lösung (siehe Punkt 2.3) bei 75 ° C für 15 min. </li><li> Bestreichen Sie die Objektträger mit 10 nm Chrom-Nickel und 100 nm Gold in einer Vakuumbeschichtungsvorrichtung. Dann lagern im Kühlschrank und sauber wieder in der RCA-Lösung unmittelbar vor dem nächsten Schritt. </li><li> Die Folien von dem vorherigen Schritt Inkubieren in 2 mM 1-Dodecanthiol / Ethanollösung für 12 h. Die Thiolgruppen an der Goldoberfläche zu binden, und eine hydrophobe Monoschicht selbst montiert. Spülen Sie die Folien mit Ethanol und Reinstwasser und dann trocken mit einem Strom von Stickstoffgas. Bestätigen die Hydrophobizität der vorbereiteten Oberfläche mit statischen Kontaktwinkelmessungen in einem Goniometer mit einer CCD-Kamera 10. </li></ol></li><li> Wasserstoff terminiert Diamant HINWEIS: In der Fläche für das zweite Beispiel ein Wasserstoff terminiert Diamant gewählt. Die Vorbereitung der Oberfläche wurde wie zuvor 16 beschrieben durchgeführt. </li><li> Unterstützte Lipiddoppelschicht Hinweis: Im letzten Beispiel wurde eine Oberflächengestützten Lipiddoppelschicht (SLB) als Fläche verwendet. Um eine solche Oberfläche zu erhalten, wurde eine Lösung (0,1 mg / ml) von großen unilamellaren Vesikeln (LUVs), bestehend aus Phospholipid POPC durch das Extrusionsverfahren gebildet. Dann wurden 50 ul der Lösung auf ein LUV frisch gespaltene Glimmerfolie (A = 1 cm²) gegeben und für 30 min inkubiert. Schließlich wurde die Lösung mit 20 ml ultrareinem Wasser gespült. Siehe 17,18 für eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von SLBs. </li></ol> 5. Datenerfassung HINWEIS: Für die Versuche, verwenden Sie ein AFM, die in der Lage, in Flüssigkeiten zu messen bietet. Die Datenerfassung und Datenanalyseverfahren gelten, unabhängig von der verwendeten AFM-Modell. Weiterhin kann in einigen Experimenten ist es vorteilhaft, die Möglichkeit, die Temperatursteuerung aufweisene in der Flüssigzelle. Cantileverauslenkung wurde über die Laserstrahlablenkung Verfahren 19 erkannt. Federkonstanten wurden mit dem thermischen Rauschen Methode 20 bestimmt. <ol><li> Legen Sie die funktionalisierten Cantilever in eine AFM-Cantilever-Halter, der für die Messung in Flüssigkeiten ist. </li><li> Setzen Sie die Oberfläche (Vorbereitung siehe oben), um in die AFM abgetastet werden und decken Sie es mit Flüssigkeit. Sowohl Cantilever und Oberfläche sollte nun in der Flüssigkeit mit dem Auslegerspitzen auf die Fläche eingetaucht werden. Man beachte, dass in vielen Fällen ein Flüssigkeitstropfen genügt. In jedem Fall der Verdampfung des Fluids vermieden werden sollte, beispielsweise durch die Verwendung eines geschlossenen Fluidzelle. </li><li> Gegebenenfalls einstellen gewünschte Temperatur auf der Steuerung. </li><li> Lassen Sie das System ins Gleichgewicht kommen für mindestens eine halbe Stunde. </li><li> Aufnehmen eines thermischen Rauschspektrum des Auslegers mit dem Ausleger weit weg von der Oberfläche, um jegliche Oberflächendämpfungseffekte auszuschließen. Beachten Sie, dass in der Regel 10 oder mehr Spektren müssen akkumuliert werden, um ein ausreichendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten. </li><li> Nähern Sie sich dem Oberfläche. Beachten Sie, dass, um die Geometrie der Spitze und Spitze sparen Funktionalisierung der Ansatz Prozess muss sorgfältig durchgeführt werden. Dies kann erreicht werden, zum Beispiel, nähert im intermittierenden Kontaktmodus. </li><li> Bestimmen Sie die inverse optische Hebelempfindlichkeit (InvOLS) in nm / Volt gemessen. Tun Sie dies, indem Sie die Cantileverspitze gegen eine harte Oberfläche. <ol><li> Bestimmen die InvOLS durch Messen der Steigung der piezo Wegstrecke gegen die Änderung der Photodiodenspannung. Setzen Sie eine Linie zum Teil der Kraft-Weg-Kurve, wo die Blattfederspitze ist in Kontakt mit der Oberfläche. In Experimenten mit einer weichen Oberfläche wie Lipid-Doppelschichten, führen Sie diesen Schritt auf Bereiche, die nicht mit einer Lipid-Doppelschicht (&quot;Mangel spots &#39;) abgedeckt sind. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Federkonstante (pN / nm) durch den Einbau eines harmonischen Oszillators der thermischen Rauschspektrum. Verwendungautomatisierte Software-Funktion für Federkonstante Bestimmung; sonst Rücksprache Literatur 20. </li><li> Starten Sie das Experiment. <ol><li> Nehmen Sie zahlreiche Kraft-Weg-Kurven an jeder Versuchsbedingung. In der Regel verwenden Sie die folgenden Werte für die Versuchsparameter: Abtastrate von 5 kHz, Spitzengeschwindigkeit von 1 &amp; mgr; m / sec, zurückzuziehen Abstand von 1 um. HINWEIS: manchmal, abhängig von der Dynamik der untersuchten Experiment könnte es notwendig sein, eine gewisse Zeit mit der Spitze in Kontakt mit der Oberfläche zu warten (&quot;Verweilzeit&quot;). HINWEIS: Das Experiment spezifische Parameter können erheblich von den oben angegebenen Werten abweichen. </li><li> Während einer Langzeitmessungen auf Null der Laserposition auf die Fotodiode von Zeit zu Zeit durch Umpositionieren der Photodiode. </li><li> Optional: Nach jedem Kraftkurve, den Standort der AFM-Spitze auf eine andere XY-Position. </li><li> Am Ende des Experiments bestimmen die Empfindlichkeit und die Feder constant wieder auf Konsistenz und Stabilität des Systems zu überprüfen. HINWEIS: Der Vergleich der Federkonstante und der Empfindlichkeit vor und nach dem Experiment ist auch ein Mittel, um sicherzustellen, dass die Eigenschaften des Systems, und die Eigenschaften der Spitze blieb über den Verlauf des Experiments unverändert. Wenn die Differenz der Federkonstanten nicht zu groß ist (&lt;= 15%), können sie gemittelt werden, da die Eigenunsicherheit von Federkonstanten-Bestimmungs ebenfalls etwa 15%. Für größere Unterschiede, ist es ratsam, zuerst finden und die Ursache für die Veränderung offensichtlich Federkonstante zu beseitigen, bevor Sie mit weiteren Experimenten. </li></ol></li></ol> 6. Datenaufbereitung HINWEIS: In diesem Abschnitt werden allgemeine Daten Vorbereitungsschritte, die üblicherweise unabhängig von der spezifischen Art von Experiment durchgeführt, um Einheiten umzurechnen, um Newton und Nanometerbereich sowie zur Korrektur werden die Daten beschrieben werden. Die Versuchsspezifischen Daten Analysen briefly wie weiter unten beschrieben in die jeweiligen repräsentativen Beispielteil. <ol><li> Typischerweise führen alle Datenaufbereitung und Analyse die Schritte automatisch von einem haus geschrieben Algorithmus, zum Beispiel auf der Basis der Software IGOR Pro 6. </li><li> Konvertieren Sie die rohen Ablenksignal (Defl) [V] in Kraft, durch Multiplikation mit den InvOLS [nm / V] und die Federkonstante [nN / nm]. </li><li> Versetzt die Kraft in einer Weise, dass die Kraft auf den Ausleger in ausreichendem Abstand von der Oberfläche (entladen Cantilever) zu 0 nN. </li><li> Berechnen der tatsächlichen Position der Spitze (auch genannt Trenn wenn es relativ zu der Oberfläche gemessen) z *, die die Verbiegung des Cantilevers berücksichtigt: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> Offset z * in der Weise, dass z * = 0 entspricht der z-Position der Oberfläche. Anmerkung: Dabei ist F die Kraft, die an der Spitze und somit Biegung wirkts der Ausleger (im Schritt 6.2 bestimmt.), z die gemessene Z-Position des Sensors (vom Gerät direkt angegeben) und k die Federkonstante (im Schritt 5.8 bestimmt). </li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> Abbildung 2: Prozessflussdiagramm, das die Probenvorbereitung, die Datenerfassung und der Datenanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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<li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization+of+probe+tips+and+supports+for+single-molecule+recognition+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+current+chemistry%22%5BJournal%5D)">Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy.</a> Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In den letzten Jahrzehnten haben die Einzelmolekül-Experimente beispiellose Einblicke in die molekularen Mechanismen, die zur Verfügung gestellt und erwies sich als ein wertvolles Vorgehen im Bereich Life Science und darüber hinaus. Um eine gute und sinn Statistiken EMKS Experimenten idealer ein und dasselbe Molekül wird über den gesamten Verlauf des Experiments verwendet erzielen. Im Gegensatz zu den Experimenten mit Ensembles von Molekülen sind SMFS Experimente in der Lage, seltene Ereignisse und versteckt Molekülzust...

In den letzten 30 Jahren ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) sich als ein wertvolles Abbildungstechnik zur biologischen 1,2 und synthetische 3 Materialien und Oberflächen zu untersuchen, da sie Informationen über die Molekular räumliche Auflösung in allen drei Dimensionen und in verschiedenen Lösungsmittel betrieben werden kann Umgebungen. Außerdem AFM-Einzelmolekülkraftspektroskopie (SMFS) ermöglicht, Kräfte, die von der pN-Regime uN messen und hat beispiellose Einblicke beispielsweise in der Proteinfaltung 4,5, Polymerphysik 6 angegeben - 8 und Einzelmolekül-Oberflächen-Wechselwirkung 9 - 12 .Die Gründe für einzelne Moleküle anstatt ein Ensemble von Molekülen ist die Vermeidung von durchschnittlich Effekte, die oft zu maskieren seltene Ereignisse oder versteckte Molekülzustände. Ferner kann eine Vielzahl von molekularen Parameter wie die Konturlänge, die Kuhn Länge der Haft freien Energie, etc.erhalten. Dies wird in den folgenden Beispielen beschrieben. In einem typischen AFM-SMFS-Experiment wird das Sondenmolekül zu einer sehr scharfen Spitze über ein Linkermolekül gekoppelt. Die Spitze selbst ist am Ende eines biegbaren Ausleger angeordnet. Wenn die Spitze in Berührung mit der Oberfläche gebracht wird das Sondenmolekül wird mit dieser Oberfläche in Wechselwirkung treten. Durch die Beobachtung der Auslenkung des Auslegers beim Zurückziehen der Spitze, die Kraft und damit die freie Energie, um das Molekül von der Oberfläche ablösen kann bestimmt werden. Um aussagekräftige Statistiken zu erhalten, wurde eine Vielzahl von so genannten Kraft-Weg-Kurven aufgenommen werden. Ferner sind echte Einzelmolekülexperimente (dh, mit ein und derselben Sonde Moleküls über die Dauer des gesamten Experiments) das Sondenmolekül sollte kovalent an die AFM-Spitze gekoppelt werden müssen. Hier wird ein Versuchsprotokoll für Cantilever Funktionalisierung mit einem einzelnen Molekül über eine kovalente Bindung dargestellt. Die einzigen Molekül kann entweder über eine Amino- oder eine Thio gekoppelt werdenl-Gruppe an die AFM-Spitze. Die Konjugation Verfahren kann in einer Vielzahl von Lösungsmitteln (organisch und wässrig), um für die Lösungseigenschaften der verwendeten Polymere Konto erfolgen. Im ersten Teil, ein allgemeines Protokoll, um kovalent an ein einzelnes Molekül (&quot;Sondenmolekül&quot;) über ein Linkermolekül an eine AFM-Spitze beschrieben. Zu diesem Zweck wird organischen NHS- oder Maleimid-Chemie verwendet 13. Zusammen mit dem Protokoll für die drei beispielhaften Molekülen, werden die Datenerfassung und Datenanalyseverfahren beschrieben, und Literaturhinweise sind. Die Beispiel-Moleküle sind: die (lineare) Polymer Tyrosin, das Pfropfpolymerisat PI- g -PS und die Lipid PAPST. Dies beinhaltet leichte Variationen des Protokolls, zum Beispiel kovalente Anbindung Cysteine. Zusätzlich ist ein Abschnitt, um die Herstellung von verschiedenen Oberflächen wie einer Diamantoberfläche, einer CH 3 -tafeln organisierte Monoschicht und Lipiddoppelschichten gewidmet. Diese Schnittstellen müssen proven, um gute Referenzen und Beispiele können.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Hellmanex III alkalisches Flüssigkonzentrat (Waschmittellösung)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (Reinstwasser, Wasserstoffperoxid (35%), Ammoniak (32%); 5:1:1(v/v/v))</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectabond Reagenz / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilan</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trockenaceton (< 50 ppm H2O)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trockenchloroform (> 99,9%)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Biochrom, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumtetraborat (>&nbsp; 99,5%)</td><td>Biochrom, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Biochrom, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monofunktionelle &alpha;-Methoxy-&omega;-NHS PEG, 5 kDa, " methyl-PEG-NHS"</td><td>Rapp, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunktional &alpha;,&omega;-bis-NHS PEG, 6&nbsp; kDa, " NHS-PEG-NHS"</td><td>Rapp, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunktionell &alpha;-maleimidohexanosäure- &omega;-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS"</td><td>Rapp, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondenmolekül (Polymer, Lipid, etc.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ausrüstung</td></tr><tr><td>Ausreichende Menge an Glaskristallisationsschalen mit Ausguss (10&nbsp; ml), Petrischalen aus Glas (500 & Mikro; l) und Glasdeckel</td><td>VWR International GmbH, Deutschland</td><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Laborofen Modell UF30</td><td>Memmert, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperiertes Ultraschallgerät</td><td>VWR International GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmaanlage "Femto", 100 W</td><td>Diener, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eine separate Glasspritze für jedes organische Lösungsmittel</td><td>VWR International GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mischer</td><td>VWR International GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (0,5 ml oder 1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten: 10-100 &Mikro; L, 50-200 &Mikro; l und 100-1.000&nbsp; &Mikro; l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM mit temperaturgesteuerter Fluidzelle (z.B. MFP-3D mit BioHeater)</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN Canragever Cantilever, typischerweise hergestellt aus Siliziumnitrid (SiN) (Federkonstante kleiner 100 pN/nm, z.B. MLCT)</td><td>Bruker AXS, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung von einzelmolekül haftung durch rasterkraftspektroskopie

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Rasterkraftspektroskopie ist ein ideales Werkzeug, um Moleküle an Oberflächen und Grenzflächen zu untersuchen. Eine experimentelle Protokoll zum Koppeln eine Vielzahl von Einzelmoleküle kovalent an einer AFM-Spitze dargestellt. Gleichzeitig die AFM-Spitze passiviert, um unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und dem Substrat, die eine Voraussetzung für die einzelnen Moleküle an die AFM-Spitze angebracht studieren verhindern. Analysen, um die Haftkraft, die Haftung der Länge, und die freie Energie dieser Moleküle auf festen Oberflächen und Bio-Schnittstellen werden in Kürze vorgestellt und externe Verweise auf weiterführende Literatur werden zur Verfügung gestellt zu bestimmen. Beispiel Moleküle sind die Poly (aminosäure) Polytyrosin das Pfropfpolymer PI- g -PS und das Phospholipid POPE (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamin). Diese Moleküle werden von verschiedenen Oberflächen wie CH 3 -SAMs, Wasserstoff terminiert Diamant desorbiert und unterstützten Lipiddoppelschichten unter verschiedenen Lösungsbedingungen. Schließlich wird dasVorteile der Kraft-spektroskopische Einzelmolekülexperimenten diskutiert Mittel zu entscheiden, ob wirklich ein einzelnes Molekül hat im Experiment untersucht.

Im Folgenden wird beschrieben, die Ergebnisse für das obige Beispiel Moleküle, nämlich die Polymere Poly (Aminosäure), Polytyrosin, das Pfropfpolymer PI- g -PS und das Phospholipid POPE, werden vorgestellt. Zunächst für jedes Beispiel, experimentieren spezifischen Details für die Datenerfassung und Datenaufbereitung zur Verfügung. Dann werden die Ausführungsergebnisse für Versuche, bei denen diese Moleküle wurden aus verschiedenen Oberflächen desorbiert (CH 3 -SAMs, Wasserstoff terminiert Diamant und...

Ein Protokoll zur kovalenten Kopplung einer Vielzahl von Einzelmolekülen an eine AFM-Spitze wird vorgestellt. Es werden Verfahren und Beispiele zur Bestimmung der Adhäsionskraft und freien Energie dieser Moleküle auf festen Trägern und Bio-Grenzflächen vorgestellt.

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein einzelnes Polymer an eine AFM-Kantileverspitze zu koppeln, um vier spektroskopische Oberflächen-Desorptions-Experimente mit ein und denselben Molekülen mehrfach durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Oberfläche der Spitze durch ein Plasma aktiviert wird, um Hydroxylgruppen zu bilden, was der zweite Schritt ist. Die Kantileverspitze wird durch eine Aminosilane-Lösung nach oben getaucht, wodurch Aminogruppen auf der Oberfläche der Spitze entstehen.Der dritte Schritt besteht darin, Polyethylenglykol-Moleküle an die Aminogruppen zu koppeln. Diese verhindern unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und dem Substrat und dienen als Vernetzermoleküle für die Polymere. Schließlich werden Polymere an die Polyethylenglykol-Moleküle konjugiert, um eine Sonde zu bilden.Die Messungen deuten darauf hin, dass es mit dieser Methode tatsächlich möglich ist, eine einzige Polymerkraftsonde für einen kompletten experimentellen Datensatz oder entsprechend für mehrere hundert Kraft-Abstands-Kurven zu verwenden. Der Hauptvorteil von Einzelmolekül-Experimenten gegenüber Ensemble-Methoden liegt darin, dass seltene Konformationen und selten auftretende Zustände untersucht werden können, die andernfalls in der Ensemble-Mittelung verborgen blieben. Aufgrund ihrer geringen Größe können diese Experimente direkt mit Molekulardynamik-Simulationen verglichen werden.Der erste Schritt besteht darin, Sondemoleküle kovalent an der Cantilever-Spitze anzubringen. Beginnen Sie mit frischem Siliziumnitrid. Verwenden Sie Cantilever-Chips mit einer Federkonstante von 10 bis 100 Pikonewton pro Nanometer.Verwenden Sie eine Pinzette, um sie auf einen sauberen Objektträger oder eine Petrischale zu legen. Danach bringen Sie den Objektträger mit den Chips in eine 100-Watt-Plasmakammer, nachdem die Kammer evakuiert und mit Sauerstoff bei 0,25 Millibar und 20 Watt für 15 Minuten gespült wurde. Verwenden Sie in den nächsten Schritten eine Absaughaube, um die Einatmung organischer Dämpfe während der Plasma-Behandlung zu vermeiden.Bereiten Sie die Aminosilanisierung der Konsolen in einer Glaspetrischale vor, indem Sie 2,5 Milliliter der Testlösung hinzufügen. Stellen Sie außerdem ein Gefäß mit Aceton bereit. Entnehmen Sie die Konsolen unmittelbar nach Beendigung der Plasma-Behandlung.Tauchen Sie jeden Cantilever für eine Sekunde in Aceton ein und legen Sie ihn dann in die Optus-Lösung. Inkubieren Sie die Cantilever 15 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie fortfahren. Während die Cantilever inkubieren, beginnen Sie mit der Vorbereitung der Pegylierung, um die Auswirkungen von Wasser und Luft auf die Komponenten zu minimieren.Beginnen Sie mit zuvor vorbereiteten Eppendorf-Röhrchen, von denen eines mPEG, NHS und das andere Farbstoff enthält. NHS-PEG. Bestimmen Sie das Gewicht des Inhalts jedes Röhrchens.Als Nächstes arbeiten Sie mit dem Röhrchen, das EG NHS enthält, und bereiten Sie die Zugabe von Chloroform vor. Geben Sie so viel Chloroform hinzu, dass eine Endkonzentration von 25 Millimolar erreicht wird und die Lösung in den nachfolgenden Schritten ausreicht, um die Cantilever zu bedecken. Stellen Sie das Röhrchen auf einen Vortex-Mischer, um sicherzustellen, dass das Pulver sich auflöst.Stellen Sie das Röhrchen mit dem EG NHS beiseite, um mit der Nahrung zu arbeiten. NHS-Peg. Geben Sie ein Chloroform hinzu, um eine Endkonzentration von 0,25 Millimolar zu erreichen.Verwenden Sie einen Vortex-Mixer, um sicherzustellen, dass das Pulver gelöst ist. Mischen Sie anschließend die Lösungen, um das Verhältnis zwischen den Diet-NHS-PEG- und den Methyl-PEG-NHS-Molekülen einzustellen. Dieses Verhältnis beträgt typischerweise eins zu 500.Beschaffen Sie eine kleine Glas-Petri-Schale mit Deckel, um Verdunstung zu vermindern, und füllen Sie sie mit der Mischung als Konsolen. Beenden Sie die Inkubation. Stellen Sie für die APT-Testlösung zwei Behälter mit jeweils etwa 10 Milliliter Aceton und einen mit Chloroform zum Spülen bereit.Tauchen Sie jede Probe zweimal in Aceton und einmal in Chloroform ein und legen Sie sie in die Polyethylenglykol-Lösung. Decken Sie die Schale ab und lassen Sie die Cantilever in der Lösung. Bereiten Sie eine Stunde lang die kovalente Kopplung eines Sondenmoleküls vor, in diesem Fall eines polyamino sauren Poly-D-Tyrosins.Beginnen Sie mit dem Volumen einer molaren Natriumhydroxidlösung, in die das Sondenmolekül auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter gelöst wird. Für poly D-Tyrosin ersetzen Sie die Natriumhydroxidlösung durch einen Puffer mit einem pH-Wert von 8 bis 8,5. Den Puffer unmittelbar vor der Funktionalisierung frisch zubereiten.Während die Konsolen ihre Inkubation in Polyethylenglykol-Lösung abschließen, bereiten Sie drei Behälter zum Spülen und einen Behälter mit dem Polytyrosin-Bohrpuffer vor. Acht Pufferlösung zum Spülen besteht aus fünf Millilitern Chloroform, fünf Millilitern Ethanol und fünf Millilitern des Bohrpuffers. Verwenden Sie etwa 300 Mikroliter der Polytyrosin-Bohrpufferlösung.Holen Sie die Cantilever und tauchen Sie diese nacheinander zuerst in Chloroform, dann in Ethanol und anschließend in Puffer Bore Acht. Vor dem Einbringen in die Polytyrosin-Bore-Acht-Pufferlösung. Lassen Sie die Cantilever-Chips eine Stunde lang inkubieren; nach einer Stunde sind sie fertig. Bereiten Sie etwa fünf Milliliter Bate-Puffer in einem Behälter und fünf Milliliter ultrareines Wasser in einem anderen Behälter zum Spülen der Cantilever vor. Stellen Sie außerdem 20 Milliliter ultrareines Wasser bereit, um die Cantilever darin aufzubewahren.Nehmen Sie die Cantilever und tauchen Sie jeden nacheinander in Boite-Puffer, gefolgt von ultrareinem Wasser zur Spülung. Anschließend lagern Sie ihn in ultrareinem Wasser. Die Cantilever können nun für die Datenaufnahme verwendet werden.Nachdem die A FM-Spitze funktionalisiert und eine Oberfläche vorbereitet und montiert wurde, beginnen Sie mit den Schritten zur Erfassung von FM-Daten. Bringen Sie zunächst den funktionalisierten Cantilever in einem für Messungen in Flüssigkeiten geeigneten A FM-Cantilever-Halter an. Verbinden Sie danach den Cantilever-Halter mit dem A FM-Kopf.Fahren Sie fort, indem Sie Wasser in die Flüssigkeitszelle gießen, um den Cantilever und die Oberfläche zu bedecken. Senken Sie dann den AFM-Kopf auf die Flüssigkeitszelle ab. Lassen Sie das System mindestens eine halbe Stunde lang equilibrieren.Nach der Equilibrierung. Positionieren Sie den Cantilever weit entfernt von der Oberfläche und nehmen Sie dann thermische Rauschspektren auf; es sind 10 oder mehr Spektren erforderlich, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen, um Oberflächen-Dämpfungseffekte auszuschließen. Danach nähern Sie sich vorsichtig der Oberfläche, um eine Messung der inversen optischen Hebel-Sensitivität durchzuführen.Dabei wird die Cantilever-Spitze gegen eine harte Oberfläche gedrückt, um die Kraft in Abhängigkeit von der Piezo-Wegstrecke aufzuzeichnen. Messen Sie die Steigung während des Kontakts und bilden Sie deren Kehrwert, um die inverse optische Hebel-Sensitivität zu bestimmen. Anschließend wird mithilfe der inversen optischen Hebel-Sensitivität und der thermischen Rauschspektren die Federkonstante des Cantilevers ermittelt, indem ein harmonischer Oszillator an das thermische Rauschspektrum angepasst wird.Stellen Sie nun die geeigneten Parameter für die Datenaufnahme ein. Zeichnen Sie am Ende der Datenaufnahme zahlreiche Kraft-Abstands-Kurven für jede experimentelle Bedingung auf. Bestimmen Sie erneut die Empfindlichkeit und die Federkonstante, um die Konsistenz und Stabilität des Systems zu überprüfen.Dieses Beispiel einer erzwungenen Distanzspur in Rot stammt von der Retraktion von Polytyrosin aus einer methylierten selbstassemblierten Monoschicht in unreinem Wasser. Der einstufige Abfall auf Nullkraft weist auf die Ablösung eines einzelnen Moleküls hin. Die sigmoidale Anpassung ist in Schwarz dargestellt.Die extrahierte Plateaulänge und die Plateaukraft sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die Auszieh- und Rückzuggeschwindigkeit des Cantilevers betrug 0,5 Mikrometer pro Sekunde, und die Verweilzeit auf der Oberfläche betrug eine Sekunde. Unterschiedliche flüssige Umgebungen für die Messung führten zu Änderungen der extrahierten Plateaukraft.Diese Histogramme zeigen die extrahierten Plateau-Kräfte für Messungen in reinem Wasser und in Wasser-Ethanol-Gemischen. Für jede Lösung wurden mindestens 300 Kraft-Abstand-Kurven an ein und demselben einzelnen Polymer aufgezeichnet. Hier werden analoge Histogramme für die extrahierten Plateau-Längen in reinem Wasser und in Wasser-Ethanol-Gemischen dargestellt.Die Zugabe von Ethanol schwächt die hydrophobe Wechselwirkung zwischen Polytyrosin und der Oberfläche, was zu einer niedrigeren Plateaukraft und einer Abnahme der Plateaulänge führt. Dies ist in dieser Darstellung der maximalen Plateaulänge gegenüber der maximalen Plateaukraft zusammengefasst. Sobald der Funktionalisierungsprotokoll beherrscht ist, kann es nach der Entwicklung in etwa vier Stunden durchgeführt werden.Diese Technik ebnete Forschern auf den Gebieten der Physik und Chemie den Weg, um die Adhäsion von Polymerschichten an Grenzflächen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

Cellulosomen sind Multienzymkomplexe, die für die Verdauung von Zellulose entwickelt wurden. AFM-basiertes SMFS wurde verwendet, um die mechanischen Eigenschaften und die Faltungskonfiguration von Cellulosom-assoziierten Proteinanordnungen zu untersuchen. Wir präsentieren einen vollständigen Workflow für die Immobilisierung, Datenerfassung und Datenanalyse von Proteinen, um die Wechselwirkungen einzelner Rezeptor-Liganden-Komplexe zu untersuchen, die an der Assemblierung von Cellulosomen...

Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Die Nanoskopie mit kolloidaler Sonde kann in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt werden, um Einblicke in die physikalische Stabilität und Gerinnungskinetik kolloidaler Systeme zu gewinnen und bei der Wirkstoffforschung und Formulierungswissenschaft unter Verwendung biologischer Systeme zu helfen. Die im Folgenden beschriebene Methode bietet ein quantitatives und qualitatives Mittel, um solche Systeme zu untersuchen.

Quantitative und qualitative Untersuchung der Partikel-Partikel Wechselwirkungen mit Kolloidales Probe Nanoskopie

Wir beschreiben ein Protokoll zur Herstellung von gestützten Lipiddoppelschichten und dessen Charakterisierung mittels Rasterkraftmikroskopie und Kraftspektroskopie.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Hier präsentieren wir ein Protokoll, die Kraft der Wechselwirkungen zwischen einem gut definierten anorganischen Oberfläche und entweder Peptide oder Aminosäuren durch Einzelmolekülkraftspektroskopie-Messungen mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) zu messen. Die Informationen aus der Messung erhalten wird, ist wichtig, um besser auf die Peptid-anorganischem Material Interphase zu verstehen.

Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

Wir beschreiben die detaillierte Verfahren und Strategien zur Messung der mechanischen Eigenschaften und mechanische entfaltenden Wege der einzelnen Protein-Moleküle mit einem Rasterkraftmikroskop. Wir zeigen auch repräsentative Ergebnisse als Referenz für die Auswahl und Begründung der gute einzelne Protein-Molekül-Aufnahmen.

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

Dieses Protokoll beschreibt die kovalente Immobilisierung von Proteinen mit einer Heterobifunctional Silan Haftvermittler auf Siliziumoxid Oberflächen für die atomic Force Mikroskopie basierend Einzelmolekül Kraft Spektroskopie entwickelt die am Beispiel der Interaktion von RrgA (Pilus-1 Tipp adhäsin des Streptococcus Pneumoniae) mit Fibronektin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

Wir präsentieren ein Protokoll zur Funktionalisierung von AFM-Auslegern (Atomic Force Microscope) mit einer einzelnen T-Zelle und einem Perlenteilchen für immunologische Studien. Gezeigt werden Verfahren zur Untersuchung der Einzelpaar-T-Zell-dendritischen Zellbindung durch AFM und zur Überwachung der echtzeitzellulären Reaktion von Makrophagen auf ein einzelnes Feststoffteilchen durch AFM mit Fluoreszenzbildgebung.

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

Wir beschreiben die Anwendung von Infrarot-Nanospektroskopie und hochauflösender Atomkraftmikroskopie, um den Prozess der Protein-Selbstmontage in oligomere Aggregate und Amyloidfibrillen zu visualisieren, die eng mit dem Beginn und der Entwicklung verbunden sind. einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen.

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

Die kovalente Befestigung von Sondenmolekülen an aatomaren Kraftmikroskopie(AFM)-Auslegerspitzen ist eine wesentliche Technik für die Untersuchung ihrer physikalischen Eigenschaften. So können wir die Dehnkraft, Desorptionskraft und Länge von Polymeren über die AFM-basierte Einzelmolekülkraftspektroskopie mit hoher Reproduzierbarkeit bestimmen.

Kovalente Befestigung einzelner Moleküle für die AFM-basierte Kraftspektroskopie

Die Quantifizierung der Kontaktfläche und der Kraft, die von einer Rasterkraftmikroskop-Sondenspitze (AFM) auf eine Probenoberfläche ausgeübt wird, ermöglicht die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften im Nanobereich. Best Practices zur Implementierung von AFM-Cantilever-basierter Nanoindentation in Luft oder Flüssigkeit an weichen und harten Proben zur Messung des Elastizitätsmoduls oder anderer nanomechanischer Eigenschaften werden diskutiert.

Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

Lernen Sie die Rasterkraftspektroskopie zur Untersuchung von Einzelmolekül-Haftung an AFM-Spitzen. Diese Methode ermöglicht präzise Adhäsionsmessungen mit Polyethylenglykol-Verbindern.

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

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