Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie
27. Februar 2015
Ein Protokoll zur kovalenten Kopplung einer Vielzahl von Einzelmolekülen an eine AFM-Spitze wird vorgestellt. Es werden Verfahren und Beispiele zur Bestimmung der Adhäsionskraft und freien Energie dieser Moleküle auf festen Trägern und Bio-Grenzflächen vorgestellt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein einzelnes Polymer an eine AFM-Kantileverspitze zu koppeln, um vier spektroskopische Oberflächen-Desorptions-Experimente mit ein und denselben Molekülen mehrfach durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Oberfläche der Spitze durch ein Plasma aktiviert wird, um Hydroxylgruppen zu bilden, was der zweite Schritt ist. Die Kantileverspitze wird durch eine Aminosilane-Lösung nach oben getaucht, wodurch Aminogruppen auf der Oberfläche der Spitze entstehen.
Der dritte Schritt besteht darin, Polyethylenglykol-Moleküle an die Aminogruppen zu koppeln. Diese verhindern unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und dem Substrat und dienen als Vernetzermoleküle für die Polymere. Schließlich werden Polymere an die Polyethylenglykol-Moleküle konjugiert, um eine Sonde zu bilden.
Die Messungen deuten darauf hin, dass es mit dieser Methode tatsächlich möglich ist, eine einzige Polymerkraftsonde für einen kompletten experimentellen Datensatz oder entsprechend für mehrere hundert Kraft-Abstands-Kurven zu verwenden. Der Hauptvorteil von Einzelmolekül-Experimenten gegenüber Ensemble-Methoden liegt darin, dass seltene Konformationen und selten auftretende Zustände untersucht werden können, die andernfalls in der Ensemble-Mittelung verborgen blieben. Aufgrund ihrer geringen Größe können diese Experimente direkt mit Molekulardynamik-Simulationen verglichen werden.
Der erste Schritt besteht darin, Sondemoleküle kovalent an der Cantilever-Spitze anzubringen. Beginnen Sie mit frischem Siliziumnitrid. Verwenden Sie Cantilever-Chips mit einer Federkonstante von 10 bis 100 Pikonewton pro Nanometer.
Verwenden Sie eine Pinzette, um sie auf einen sauberen Objektträger oder eine Petrischale zu legen. Danach bringen Sie den Objektträger mit den Chips in eine 100-Watt-Plasmakammer, nachdem die Kammer evakuiert und mit Sauerstoff bei 0,25 Millibar und 20 Watt für 15 Minuten gespült wurde. Verwenden Sie in den nächsten Schritten eine Absaughaube, um die Einatmung organischer Dämpfe während der Plasma-Behandlung zu vermeiden.
Bereiten Sie die Aminosilanisierung der Konsolen in einer Glaspetrischale vor, indem Sie 2,5 Milliliter der Testlösung hinzufügen. Stellen Sie außerdem ein Gefäß mit Aceton bereit. Entnehmen Sie die Konsolen unmittelbar nach Beendigung der Plasma-Behandlung.
Tauchen Sie jeden Cantilever für eine Sekunde in Aceton ein und legen Sie ihn dann in die Optus-Lösung. Inkubieren Sie die Cantilever 15 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie fortfahren. Während die Cantilever inkubieren, beginnen Sie mit der Vorbereitung der Pegylierung, um die Auswirkungen von Wasser und Luft auf die Komponenten zu minimieren.
Beginnen Sie mit zuvor vorbereiteten Eppendorf-Röhrchen, von denen eines mPEG, NHS und das andere Farbstoff enthält. NHS-PEG. Bestimmen Sie das Gewicht des Inhalts jedes Röhrchens.
Als Nächstes arbeiten Sie mit dem Röhrchen, das EG NHS enthält, und bereiten Sie die Zugabe von Chloroform vor. Geben Sie so viel Chloroform hinzu, dass eine Endkonzentration von 25 Millimolar erreicht wird und die Lösung in den nachfolgenden Schritten ausreicht, um die Cantilever zu bedecken. Stellen Sie das Röhrchen auf einen Vortex-Mischer, um sicherzustellen, dass das Pulver sich auflöst.
Stellen Sie das Röhrchen mit dem EG NHS beiseite, um mit der Nahrung zu arbeiten. NHS-Peg. Geben Sie ein Chloroform hinzu, um eine Endkonzentration von 0,25 Millimolar zu erreichen.
Verwenden Sie einen Vortex-Mixer, um sicherzustellen, dass das Pulver gelöst ist. Mischen Sie anschließend die Lösungen, um das Verhältnis zwischen den Diet-NHS-PEG- und den Methyl-PEG-NHS-Molekülen einzustellen. Dieses Verhältnis beträgt typischerweise eins zu 500.
Beschaffen Sie eine kleine Glas-Petri-Schale mit Deckel, um Verdunstung zu vermindern, und füllen Sie sie mit der Mischung als Konsolen. Beenden Sie die Inkubation. Stellen Sie für die APT-Testlösung zwei Behälter mit jeweils etwa 10 Milliliter Aceton und einen mit Chloroform zum Spülen bereit.
Tauchen Sie jede Probe zweimal in Aceton und einmal in Chloroform ein und legen Sie sie in die Polyethylenglykol-Lösung. Decken Sie die Schale ab und lassen Sie die Cantilever in der Lösung. Bereiten Sie eine Stunde lang die kovalente Kopplung eines Sondenmoleküls vor, in diesem Fall eines polyamino sauren Poly-D-Tyrosins.
Beginnen Sie mit dem Volumen einer molaren Natriumhydroxidlösung, in die das Sondenmolekül auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter gelöst wird. Für poly D-Tyrosin ersetzen Sie die Natriumhydroxidlösung durch einen Puffer mit einem pH-Wert von 8 bis 8,5. Den Puffer unmittelbar vor der Funktionalisierung frisch zubereiten.
Während die Konsolen ihre Inkubation in Polyethylenglykol-Lösung abschließen, bereiten Sie drei Behälter zum Spülen und einen Behälter mit dem Polytyrosin-Bohrpuffer vor. Acht Pufferlösung zum Spülen besteht aus fünf Millilitern Chloroform, fünf Millilitern Ethanol und fünf Millilitern des Bohrpuffers. Verwenden Sie etwa 300 Mikroliter der Polytyrosin-Bohrpufferlösung.
Holen Sie die Cantilever und tauchen Sie diese nacheinander zuerst in Chloroform, dann in Ethanol und anschließend in Puffer Bore Acht. Vor dem Einbringen in die Polytyrosin-Bore-Acht-Pufferlösung. Lassen Sie die Cantilever-Chips eine Stunde lang inkubieren; nach einer Stunde sind sie fertig. Bereiten Sie etwa fünf Milliliter Bate-Puffer in einem Behälter und fünf Milliliter ultrareines Wasser in einem anderen Behälter zum Spülen der Cantilever vor. Stellen Sie außerdem 20 Milliliter ultrareines Wasser bereit, um die Cantilever darin aufzubewahren.
Nehmen Sie die Cantilever und tauchen Sie jeden nacheinander in Boite-Puffer, gefolgt von ultrareinem Wasser zur Spülung. Anschließend lagern Sie ihn in ultrareinem Wasser. Die Cantilever können nun für die Datenaufnahme verwendet werden.
Nachdem die A FM-Spitze funktionalisiert und eine Oberfläche vorbereitet und montiert wurde, beginnen Sie mit den Schritten zur Erfassung von FM-Daten. Bringen Sie zunächst den funktionalisierten Cantilever in einem für Messungen in Flüssigkeiten geeigneten A FM-Cantilever-Halter an. Verbinden Sie danach den Cantilever-Halter mit dem A FM-Kopf.
Fahren Sie fort, indem Sie Wasser in die Flüssigkeitszelle gießen, um den Cantilever und die Oberfläche zu bedecken. Senken Sie dann den AFM-Kopf auf die Flüssigkeitszelle ab. Lassen Sie das System mindestens eine halbe Stunde lang equilibrieren.
Nach der Equilibrierung. Positionieren Sie den Cantilever weit entfernt von der Oberfläche und nehmen Sie dann thermische Rauschspektren auf; es sind 10 oder mehr Spektren erforderlich, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen, um Oberflächen-Dämpfungseffekte auszuschließen. Danach nähern Sie sich vorsichtig der Oberfläche, um eine Messung der inversen optischen Hebel-Sensitivität durchzuführen.
Dabei wird die Cantilever-Spitze gegen eine harte Oberfläche gedrückt, um die Kraft in Abhängigkeit von der Piezo-Wegstrecke aufzuzeichnen. Messen Sie die Steigung während des Kontakts und bilden Sie deren Kehrwert, um die inverse optische Hebel-Sensitivität zu bestimmen. Anschließend wird mithilfe der inversen optischen Hebel-Sensitivität und der thermischen Rauschspektren die Federkonstante des Cantilevers ermittelt, indem ein harmonischer Oszillator an das thermische Rauschspektrum angepasst wird.
Stellen Sie nun die geeigneten Parameter für die Datenaufnahme ein. Zeichnen Sie am Ende der Datenaufnahme zahlreiche Kraft-Abstands-Kurven für jede experimentelle Bedingung auf. Bestimmen Sie erneut die Empfindlichkeit und die Federkonstante, um die Konsistenz und Stabilität des Systems zu überprüfen.
Dieses Beispiel einer erzwungenen Distanzspur in Rot stammt von der Retraktion von Polytyrosin aus einer methylierten selbstassemblierten Monoschicht in unreinem Wasser. Der einstufige Abfall auf Nullkraft weist auf die Ablösung eines einzelnen Moleküls hin. Die sigmoidale Anpassung ist in Schwarz dargestellt.
Die extrahierte Plateaulänge und die Plateaukraft sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die Auszieh- und Rückzuggeschwindigkeit des Cantilevers betrug 0,5 Mikrometer pro Sekunde, und die Verweilzeit auf der Oberfläche betrug eine Sekunde. Unterschiedliche flüssige Umgebungen für die Messung führten zu Änderungen der extrahierten Plateaukraft.
Diese Histogramme zeigen die extrahierten Plateau-Kräfte für Messungen in reinem Wasser und in Wasser-Ethanol-Gemischen. Für jede Lösung wurden mindestens 300 Kraft-Abstand-Kurven an ein und demselben einzelnen Polymer aufgezeichnet. Hier werden analoge Histogramme für die extrahierten Plateau-Längen in reinem Wasser und in Wasser-Ethanol-Gemischen dargestellt.
Die Zugabe von Ethanol schwächt die hydrophobe Wechselwirkung zwischen Polytyrosin und der Oberfläche, was zu einer niedrigeren Plateaukraft und einer Abnahme der Plateaulänge führt. Dies ist in dieser Darstellung der maximalen Plateaulänge gegenüber der maximalen Plateaukraft zusammengefasst. Sobald der Funktionalisierungsprotokoll beherrscht ist, kann es nach der Entwicklung in etwa vier Stunden durchgeführt werden.
Diese Technik ebnete Forschern auf den Gebieten der Physik und Chemie den Weg, um die Adhäsion von Polymerschichten an Grenzflächen zu untersuchen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Kopplung einzelner Polymere an eine AFM-Kantileverspitze für spektroskopische Oberflächen-Desorptions-Experimente. Es erläutert die notwendigen Schritte zur Vorbereitung der Spitze und zur Anheftung von Polyethylenglykol-Molekülen, die als Linker für die Polymere dienen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biophysik
- Oberflächenchemie
- Nanotechnologie
Hintergrund
- Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) wird zur Oberflächenanalyse verwendet.
- Die kovalente Kopplung von Molekülen erhöht die Spezifität von Messungen.
- Polyethylenglykol (PEG) wird häufig verwendet, um unspezifische Wechselwirkungen zu verringern.
- Das Verständnis von Adhäsionskräften ist entscheidend für zahlreiche Anwendungen in der Materialwissenschaft und Biologie.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Anbindung einzelner Moleküle an AFM-Spitzen.
- Erleichterung wiederholter spektroskopischer Experimente mit denselben Molekülen.
- Verbesserung der Genauigkeit von Adhäsionskraftmessungen auf festen Trägern.
Verwendete Methoden
- Plasmaaktivierung der AFM-Spitzenoberfläche zur Einführung von Hydroxylgruppen.
- Aminosilanisierung der Spitze zur Erzeugung von Aminogruppen.
- Kopplung von Polyethylenglykol-Molekülen an die Aminogruppen.
- Konjugation von Polymeren an die PEG-Moleküle zur Bildung einer funktionalen Sonde.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Anbindung von Polymeren an AFM-Spitzen wurde nachgewiesen.
- Die Verringerung unspezifischer Wechselwirkungen wurde mithilfe von PEG-Linkern erreicht.
- Adhäsionskräfte und Freie-Energie-Messungen wurden effektiv durchgeführt.
- Die Methode ermöglicht mehrere Experimente mit demselben molekularen Aufbau.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen vielseitigen Ansatz für die molekulare Kopplung an AFM-Spitzen.
- Es verbessert die Zuverlässigkeit von Untersuchungen zu Oberflächenwechselwirkungen.
- Diese Methode kann auf verschiedene Molekül- und Oberflächentypen angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Einzelmolekül-Atomkraftspektroskopie ermöglicht die direkte Quantifizierung molekularer Adhäsionskräfte an Bio-Grenzflächen und unterstützt die mechanistische Risikominimierung in der frühen Entdeckungsphase. Dieser Ansatz liefert hochauflösende, quantitative Daten zu molekularen Wechselwirkungen und trägt so zur Zielvalidierung sowie zur Verbesserung der Vorhersagesicherheit für Biopharma-F&E-Portfolios bei. Die Fähigkeit, einzelne molekulare Ereignisse zu isolieren und wiederholt zu messen, verbessert die Zuverlässigkeit von Entscheidungen in frühen Entwicklungsstadien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Messung molekularer Adhäsion und klärt die Interaktionsmechanismen auf einzelnen Molekülebene.
- Unterstützt die funktionelle Zielstrukturvalidierung, indem spezifische von unspezifischen Bindungsereignissen unterschieden werden.
- Liefert quantitative Kraft- und Energie-Daten, um vorhersagende Modelle zu erstellen und Zielstrukturen zu priorisieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung passivierter, funktionalisierter Sonden für reproduzierbare Einzelmolekül-Analysen.
- Ermöglicht die Aufnahme von Hunderten von Kraft-Distanz-Kurven pro Sonde und unterstützt dadurch eine robuste Standardisierung der Analysen.
- Liefert quantitative Ergebnisse (Adhäsionskraft, Länge, freie Energie) zur zuverlässigen Bewertung von Verbindungen oder Oberflächen.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft molekulare Interaktionsdaten mit krankheitsrelevanten bio-interfacen, um die translationale Kontinuität sicherzustellen.
- Ermöglicht risikoadjustierte Fortschritte, indem mechanistische Einblicke in die molekulare Adhäsion unter physiologisch relevanten Bedingungen bereitgestellt werden.
- Ermöglicht den Vergleich des molekularen Verhaltens in unterschiedlichen Lösungsmittelumgebungen und an verschiedenen Oberflächen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode ist in den Entdeckungsprozess integriert, der sich von der frühen Hypothesenprüfung über die Assay-Entwicklung bis hin zur Auswahl präklinischer Modelle erstreckt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung spezifischer molekularer Wechselwirkungen und Adhäsionsmechanismen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte zur Beurteilung der Assaytauglichkeit und Verbindungsevaluation.
- Analytik: Erzeugt Kraft-Abstands-Kurven und statistische Verteilungen für eine robuste Vergleichbarkeit experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Adhäsionsdaten mit der Relevanz für biochemische Grenzflächen und unterstützt gegebenenfalls die Biomarker-Korrelation.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen standardisierten Protokollablauf, der an verschiedene Moleküle und Oberflächen angepasst werden kann, um einen breiten Einsatz in Forschung und Entwicklung zu ermöglichen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Target-Validierung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und skalierbare Einzelmolekül-Messungen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem hochauflösende molekulare Daten frühzeitig in der Pipeline bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Kandidaten basierend auf quantitativen Adhäsionsmetriken.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Bedienung von AFM und der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie.
- Setzt Zugang zu spezialisierten Messgeräten und analytischer Infrastruktur für Datenaufnahme und -analyse voraus.
- Erfordert eine strenge, übergreifende Standardisierung der Sondenausfunktionalisierung und Messprotokolle.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für unterschiedliche molekulare Systeme oder Oberflächenchemien erforderlich.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Durchsatzkapazität und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Kontrolle unspezifischer Wechselwirkungen.
