Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie
27. Februar 2015
Ein Protokoll zur kovalenten Kopplung einer Vielzahl von Einzelmolekülen an eine AFM-Spitze wird vorgestellt. Es werden Verfahren und Beispiele zur Bestimmung der Adhäsionskraft und freien Energie dieser Moleküle auf festen Trägern und Bio-Grenzflächen vorgestellt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein einzelnes Polymer an eine A FM Cantilever-Spitze zu koppeln, um vier spektroskopische Oberflächendesorptionsexperimente mit einem in denselben Molekülen mehrmals durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Oberfläche der Spitze durch das Plasma aktiviert wird, um in einem zweiten Schritt Hydroxylgruppen zu bilden. Die Cantilever-Spitze wird durch eine Up-Test-Lösung, die Aminogruppen auf der Spitzenoberfläche bildet, aminosiloisiert.
Der dritte Schritt besteht darin, Polyethylenglykolmoleküle an die Aminogruppen zu koppeln. Sie verhindern unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und dem Substrat und dienen als Linkermoleküle für die Polymere. Schließlich werden Polymere an die Polyethylenglykolmoleküle konjugiert, um eine Sonde zu bilden.
Messungen deuten darauf hin, dass es mit diesem Verfahren tatsächlich möglich ist, ein und dieselbe Polymerkraftsonde für einen kompletten Versuchsaufbau oder ebenso für viele hundert Kraft-Weg-Kurven zu verwenden. Der Hauptvorteil von Einzelmolekülexperimenten gegenüber Ensemble-Methoden besteht darin, dass seltene Bestätigungen und seltene Zustände untersucht werden können, die sonst bei der Ensemble-Mittelung verborgen bleiben würden. Aufgrund ihrer geringen Größe können diese Experimente direkt mit molekulardynamischen Simulationen verglichen werden.
Der erste Schritt besteht darin, Sondenmoleküle kovalent an die Cantilever-Spitze zu binden. Beginnen Sie mit frischem Siliziumnitrid. Cantilever-Chips verwenden Chips mit einer Federkonstante von 10 bis 100 Pico-Newton pro Nanometer.
Lege sie mit einer Pinzette auf einen sauberen Objektträger oder eine Petrischale. Legen Sie dann den Objektträger mit den Chips in eine 100-Watt-Plasmakammer, nachdem Sie die Kammer evakuiert und 15 Minuten lang mit Sauerstoff gespült haben, der bei 0,25 Millibar und 20 Watt betrieben wird. Verwenden Sie in den nächsten Schritten eine Haube, um das Einatmen organischer Dämpfe während der Plasmaverarbeitung zu vermeiden.
Bereiten Sie die Aminosiloisierung der Ausleger in einer Glaspetrischale vor und geben Sie 2,5 Milliliter der Testlösung nach oben. Reparieren Sie außerdem ein Gefäß, das Aceton enthält. Holen Sie die Ausleger sofort nach Abschluss der Plasmabearbeitung zurück.
Tauchen Sie jeden Ausleger eine Sekunde lang in Aceton und legen Sie ihn dann in die Optus-Lösung. Inkubieren Sie die Ausleger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie fortfahren. Während die Ausleger inkubieren, beginnen Sie mit der Vorbereitung für die Pegylierung, um die Auswirkungen von Wasser und Luft auf die Komponenten zu minimieren.
Beginnen Sie mit zuvor vorbereiteten Eph-Röhrchen, von denen eine m peg, NHS und die andere Farbstoff enthält. NHS Peg. Bestimmen Sie das Gewicht des Inhalts jedes Röhrchens.
Arbeiten Sie als Nächstes mit dem Röhrchen, das EG NHS enthält, und bereiten Sie die Zugabe von Chloroform vor. Gießen Sie das Chloroform, um eine Endkonzentration von 25 Millimolar und eine ausreichende Lösung zu erreichen, um die Ausleger in den nachfolgenden Schritten zu bedecken. Stellen Sie das Rohr auf einen Vortex-Mischer, um sicherzustellen, dass sich das Pulver auflöst.
Legen Sie die Sonde mit dem EG NHS beiseite, um mit der Diät zu arbeiten. NHS-Bindung. Fügen Sie ein Chloroform hinzu, damit es eine Endkonzentration von 0,25 Millimolar erreicht.
Verwenden Sie einen Vortex-Mischer, um sicherzustellen, dass sich das Pulver auflöst. Mischen Sie anschließend die Lösungen, um das Verhältnis zwischen dem Diät-NHS-Peg und den Methyl-Peg-NHS-Molekülen anzupassen. Dieses Verhältnis liegt in der Regel bei eins zu 500.
Besorgen Sie sich eine kleine Petrischale aus Glas mit Deckel, um die Verdunstung zu begrenzen, und füllen Sie sie mit der Mischung als Ausleger. Beenden Sie die Inkubation. Halten Sie in der APT-Testlösung zwei Behälter mit etwa 10 Millilitern Aceton und einen mit Chloroform zum Spülen bereit.
Tauchen Sie sie jeweils zweimal und einmal in Chloroform in das Aceton und legen Sie sie in die Polyethylenglykollösung. Decken Sie die Schale ab und bewahren Sie die Ausleger in der Lösung auf. Bereiten Sie sich eine Stunde lang auf die kovalente Kopplung eines Sondenmoleküls vor, in diesem Fall der Polyaminosäure Poly de Tyrosin.
Beginnend mit dem Volumen eines molaren Natriumhydroxids löst man sich in diesem Sondenmolekül auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter auf. Bei Poly-D-Tyrosin ist Natriumhydroxid gegen Natriumbor mit acht bis 8,5 pH auszutauschen. Acht Puffer unmittelbar vor der Funktionalisierung.
Wenn die Ausleger ihre Inkubation in Polyethylenglykollösung abgeschlossen haben, bereiten Sie drei Behälter zum Spülen und einen Behälter mit der Polytyrosinbohrung vor. Die Acht-Puffer-Lösung zum Spülen besteht aus fünf Millilitern Chloroform, fünf Millilitern Ethanol und fünf Millilitern des Bohrungspuffers. Verwenden Sie etwa 300 Mikroliter der Polytyrosin-Bohrungspufferlösung.
Nehmen Sie die Ausleger und tauchen Sie sie zuerst in Chloroform, dann in Ethanol und dann in den Achterpuffer. Bevor Sie sie in das Polytyrosin geben, bohren Sie acht Pufferlösung. Lassen Sie die Cantilever-Chips eine Stunde lang inkubieren, nachdem Sie eine Stunde fertig waren, etwa fünf Milliliter Bate-Puffer in einem Behälter und fünf Milliliter Reinstwasser in einem anderen zum Spülen der Ausleger haben ebenfalls 20 Milliliter Reinstwasser, um sie zu lagern.
Nehmen Sie die Ausleger und tauchen Sie sie jeweils in Boite-Puffer, gefolgt von Reinstwasser zum Spülen. Tauchen Sie es dann zur Lagerung in Reinstwasser. Die Ausleger können nun für die Datenerfassung verwendet werden.
Sobald die A-FM-Spitze funktionalisiert und eine Oberfläche vorbereitet und montiert wurde, beginnen Sie mit den Schritten für eine FM-Datenerfassung. Legen Sie zunächst den funktionalisierten Ausleger in einen A-FM-Auslegerhalter, der für die Messung in Flüssigkeiten geeignet ist. Verbinden Sie als Nächstes den Auslegerhalter mit dem A FM-Kopf.
Gießen Sie Wasser in die Flüssigkeitszelle, um den Ausleger und die Oberfläche einzutauchen. Senken Sie dann den A-FM-Kopf auf die Flüssigkeitszelle. Lassen Sie das System mindestens eine halbe Stunde lang äquilibrieren.
Nach e Äquilibrierung. Positionieren Sie den Cantilever, positionieren Sie ihn weit von der Oberfläche entfernt, und zeichnen Sie dann thermische Rauschspektren auf, die 10 oder mehr Spektren erfordern, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zum Ausschluss von Oberflächendämpfungseffekten zu erhalten. Nähern Sie sich anschließend vorsichtig der Oberfläche, um die Empfindlichkeit des inversen optischen Hebels zu messen.
Dabei wird die Cantilever-Spitze gegen eine harte Oberfläche gedrückt, um die Kraft im Vergleich zum Pizo-Verfahrweg aufzuzeichnen. Messen Sie die Steigung während des Kontakts und kehren Sie sie um, um die inverse Empfindlichkeit des optischen Hebels zu bestimmen. Die nächste Arbeit, die inverse optische Hebelempfindlichkeit und die thermischen Rauschspektren Bestimmen Sie die Federkonstante des Cantilevers, indem Sie einen harmonischen Oszillator an das thermische Rauschspektrum anpassen.
Stellen Sie nun die entsprechenden Parameter für die Datenerfassung ein. Zeichnen Sie am Ende der Datenerfassung zahlreiche erzwungene Abstandskurven für jede Versuchsbedingung auf. Bestimmen Sie erneut die Empfindlichkeit und die Federkonstante, um die Konsistenz und Stabilität des Systems zu überprüfen.
Dieses Beispiel für eine erzwungene Abstandsspur in Rot stammt von der Retraktion von Polytyrosin aus einer Methyl-Monoschicht, die verunreinigtes Wasser ist. Der einstufige Abfall auf die Kraft Null zeigt die Ablösung eines einzelnen Moleküls an. Die sigmoidale Passung ist schwarz dargestellt.
Die extrahierte Plateaulänge und die Plateaukraft werden mit Pfeilen angezeigt. Die Ausdehnungsrückzugsgeschwindigkeit des Cantilevers betrug 0,5 Mikrometer pro Sekunde und die Verweilzeit auf der Oberfläche eine Sekunde. Unterschiedliche flüssige Umgebungen für die Messung führten zu Änderungen der extrahierten Plateaukraft.
Diese Histogramme spiegeln die extrahierte Plateaukraft für Messungen in reinem Wasser und Messungen in Wasser wider. Bei Ethanolgemischen wurden mindestens 300 Kraft-Weg-Spuren für jede Lösung mit einer im selben einzelnen Polymer aufgezeichnet. Hier werden analoge Histogramme für die extrahierte Plateaulänge für Reinwasser und in Wasser Ethanolgemische gezeigt.
Die Zugabe von Ethanol schwächt die hydrophobe Wechselwirkung zwischen Polytyrosin und der Oberfläche, was zu einer geringeren Plateaukraft und einer Abnahme der Plateaulänge führt. Dies wird in dieser Tafel der Länge des Peak-Plateaus im Vergleich zur Peak-Plateau-Kraft zusammengefasst. Sobald das Funktionalisierungsprotokoll beherrscht ist, kann es in etwa vier Stunden nach der Entwicklung durchgeführt werden.
Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Physik und Chemie den Weg, um die Adhäsion von Polymeren an Grenzflächen zu erforschen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Kopplung einzelner Polymere an eine AFM-Kantilever-Spitze für spektroskopische Oberflächendesorptionsexperimente. Es umreißt die notwendigen Schritte zur Vorbereitung der Spitze und dem Anbringen von Polyethylenglykol-Molekülen, die als Verbinder für die Polymere dienen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biophysik
- Oberflächenchemie
- Nanotechnologie
Hintergrund
- Atomkraftmikroskopie (AFM) wird für Oberflächenanalysen verwendet.
- Kovalente Kopplung von Molekülen erhöht die Spezifität bei Messungen.
- Polyethylenglykol (PEG) wird häufig verwendet, um unspezifische Wechselwirkungen zu reduzieren.
- Das Verständnis von Adhäsionskräften ist entscheidend für verschiedene Anwendungen in Materialwissenschaft und Biologie.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Anbringung einzelner Moleküle an AFM-Spitzen zu entwickeln.
- Wiederholte spektroskopische Experimente mit denselben Molekülen zu ermöglichen.
- Die Genauigkeit der Adhäsionskraftmessungen auf festen Untergründen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Plasmaaktivierung der AFM-Spitze zur Einführung von Hydroxylgruppen.
- Amino-Silanisierung der Spitze zur Erzeugung von Aminogruppen.
- Kopplung von Polyethylenglykol-Molekülen an die Aminogruppen.
- Konjugation von Polymeren an die PEG-Moleküle zur Bildung einer funktionellen Sonde.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Anbringung von Polymeren an AFM-Spitzen wurde demonstriert.
- Eine Reduzierung unspezifischer Wechselwirkungen wurde mit PEG-Verbindern erreicht.
- Adhäsionskraft- und freie Energiemessungen wurden effektiv durchgeführt.
- Die Methode ermöglicht mehrere Experimente mit derselben molekularen Konfiguration.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen vielseitigen Ansatz für die molekulare Kopplung an AFM-Spitzen.
- Es erhöht die Zuverlässigkeit von Oberflächenwechselwirkungsstudien.
- Diese Methode kann auf verschiedene Arten von Molekülen und Oberflächen angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Single molecule atomic force spectroscopy enables direct quantification of molecular adhesion forces at bio-interfaces, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-resolution, quantitative data on molecular interactions, informing target validation and predictive confidence for biopharma R&D portfolios. The ability to isolate and repeatedly measure individual molecular events advances the reliability of early-stage decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of molecular adhesion, clarifying interaction mechanisms at the single-molecule level.
- Supports functional target validation by distinguishing specific from nonspecific binding events.
- Provides quantitative force and energy data to inform predictive models and triage targets.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of passivated, functionalized probes for reproducible single-molecule assays.
- Enables generation of hundreds of force-distance curves per probe, supporting robust assay standardization.
- Delivers quantitative outputs (adhesion force, length, free energy) for reliable compound or surface evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular interaction data with disease-relevant bio-interfaces for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing mechanistic insight into molecular adhesion under physiologically relevant conditions.
- Enables comparison of molecular behavior across different solvent environments and surfaces.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through assay development and preclinical model selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying specific molecular interactions and adhesion mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Generates force-distance curves and statistical distributions for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Links molecular adhesion data to bio-interface relevance, supporting biomarker alignment when applicable.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to diverse molecules and surfaces for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable single-molecule measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-resolution molecular data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on quantitative adhesion metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and single-molecule force spectroscopy.
- Demands access to specialized instrumentation and analytical infrastructure for data acquisition and analysis.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of probe functionalization and measurement protocols.
- Adaptation may be needed for different molecular systems or surface chemistries.
- Practical limitations include throughput and the need for careful control of nonspecific interactions.
