Name: Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Lernen Sie die kovalente Immobilisierung von Proteinen auf Siliziumoxid-Oberflächen für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie mit dem Rasterkraftmikroskop. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen von Proteinwechselwirkungen.

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TB und HG anerkennen, finanziellen Unterstützung durch den Europäischen Forschungsrat "Cellufuel, Advanced Grant Nr. 294438". HCS erkennt finanziellen Unterstützung des Bundesministeriums für Bildung und Forschung durch die Innovationsallianz Technofunktionale Anthocyane (TeFuProt), SS erkennt finanzielle Unterstützung durch das Bayerische Staatsministerium für Wissenschaft und Bildung durch den Forschungsschwerpunkt "Zugespitzt Und Biophysikalische Charakterisierung Dreidimensionaler Gewebe - Galopp". Wir danken Conny Hasselberg-Christoph und Martina Hörig für technischen support

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Seit die Einführung des AFM SMFS basierend, entwickelte es sich zu eine weit verbreitete Technik, Intra- und intermolekularen Kräfte der einzelnen Proteine, Nukleinsäuren und andere Biomoleküle3,4,5direkt zu erforschen. Für erfolgreiche SMFS Experimente ist eine geeignete Oberfläche Kupplung Strategie eine Voraussetzung. Um die Intramolekulare Kräfte in natürlichen und synthetischen Polymeren Sonde, können die Polymere direkt auf die Substratoberfläche und AFM Tipp36,38,39,40,41gekoppelt sein. Für die Untersuchung von Inter molekulare Interaktionen, wie Molekulare Bindungen, aber es ist ratsam, flexible Linker Moleküle wie Hetero-bifunktionelle PEG linker oder Polypeptidketten, mithilfe der Interaktionspartner an die AFM-Spitze befestigen und die Substratoberfläche, um die korrekte Ausrichtung der Bindungspartner, Short-Range Oberfläche Kräfte zu überwinden und zur Vermeidung von Denaturierung und Entfaltung der Proteine21,22,23zu ermöglichen, 24,25,26,27,42. Wir beschrieben daher einfach und geradlinig Protokoll für die kovalente Immobilisierung der Proteine über ihre zugänglich primäre Amine mit Hetero-bifunktionelle PEG Abstandhalter.
Wir zeigten ihre Anwendbarkeit bei der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen adhäsin RrgA von S. Pneumoniae und das extrazelluläre Matrix Protein Fn, erst ausführlich beschrieben an anderer Stelle13.
Die Oberflächenchemie ist gut etabliert und analysiert und ähnliche Ansätze erfolgreich in mehreren SMFS Experimente19,42,43,44,45verwendet wurden. Die Silylether zur Kopplung des Silan Polymers an der Oberfläche ist abhängig von Hydrolyse. Der Grad der Hydrolyse hängt die Menge des gebildeten Siloxan-Anleihen, die während des Prozesses der Silanisierung gesteuert werden kann. Wenn hohe Wechselwirkungskräfte (≥ 1000 pN) während SMFS Messungen zu erwarten sind, sollte der Silanisierung durchgeführt über Dampf-Phase Deposition30 führt zu der Bildung von eine ununterbrochene Schicht der Siloxane. Wie bei vielen Experimenten (z.B. viele Protein-Protein-Wechselwirkungen) sind die Wechselwirkungskräfte im Bereich von wenigen hundert pN und das beschriebene Verfahren, in denen, das Siloxan Bildung erfolgt durch Ablagerung von einer wässrigen Phase und ungebunden Organo-Silane werden sorgfältig mit Ethanol (Schritt 1.1.7) gefolgt von Härtung mit Wärme (Schritt 1.1.8) abgewaschen, ist ausreichend.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist, die restlichen EDC waschen und NHS-Moleküle aus der Oberfläche (Schritt 1.2.3), wie Reste der Aktivierung von Carboxylgruppen der Proteine führen werden. Dies kann entweder Ergebnis in Vernetzung von Proteinen auf der gleichen Fläche, die ihre Funktionalität verändern können oder kovalent paar aktiviert Proteine an andere Proteine auf der gegenüberliegenden Fläche. Dies kann zu spannen der Proteine zwischen der Oberfläche und der AFM-Spitze, führt zu hohen Bruch Kräfte, eventuell begleitet von Domäne Entfaltung führen (siehe Abb. 3 b, Spur 1, 4 und 5, Entfaltung des Fn-Domänen)46. Das gleiche Problem kann auftreten, wenn die aktive NHS Ester der PEG Abstandhalter ungesättigten übrig sind. Daher ist die Inkubation mit Tris gepufferte Kochsalzlösung (Schritt 1.2.6) empfohlen, da das primäre Amin Tris die restlichen reaktive Aminogruppen stillt.
Nach dem Protokoll schrittweise führt zu einer homogenen Verteilung der Fn auf dem silanisiert Glas Oberfläche (siehe Abbildung 2), so dass eine dimeres Form des Proteins. Dies ähnelt Fn´s Struktur in Lösung und steht im Einklang mit früheren AFM-Daten auf andere Probe Oberflächen37. Darüber hinaus wird eine entsprechende Konzentration des RrgA auf die AFM-Spitze erreicht, die erzeugt eines Zielwert von ~ 20 % der klar definierten Interaktion Ereignisse während des SMFS Messungen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Eine andere elegante Möglichkeit, Steuern Sie die Anzahl der Moleküle gekoppelt mit der Probe Substrat und Cantilever Spitze neben unterschiedlichen Protein Konzentration und/oder Inkubation Zeit, ist die Kombination von Silan-Agenten mit unterschiedlichen sekundären Funktionsgruppen. Durch die Änderung des Verhältnis von Protein reaktivgruppen erstreckt sich von der PEG-Polymer, kann die Zahl der immobilisierten Proteine gesteuerte15,16,17,18.
Das hier beschriebene Protokoll einsetzbar auch anderen -NH2 enthaltenden Molekülen zu immobilisieren oder paar Proteine auf andere Siliziumoxid Fläche neben Glas und Siliziumnitrid angepasst werden. Abhängig von der Protein-Design der Amine reaktive Carboxylgruppe kann geändert werden zu einer Sulfhydryl reaktive Gruppe (z.B., Maleimide oder ortho-Pyridyl Disulfid) Protein über koppeln sein freies – SH-Gruppen. Für Fn führt dies zu einer vordefinierten Orientierung13,17,20.
Zusammenfassend lässt sich sagen dieses Protokoll kann angepasst werden, um verschiedenen Anforderungen zu bedienen und eignet sich für andere biophysikalischen Anwendungen neben Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie-Experimenten.

Neben optischen und magnetischen Pinzette der Rasterkraft-Mikroskop (AFM)1,2 entstanden als ein nützliches Tool zum Analysieren und Bearbeiten von Molekülen und Sonde, ihren Eigenschaften und Funktionen, einschließlich ihrer Reaktion auf externe Kraft3 ,4. Im Gegensatz zu Methoden wie das Enzym verknüpften Immunosorbentprobe Assay (ELISA), Oberfläche Plasmon-Resonanz (SPR) oder Quarz Kristall Mikrowaage (QCM) Setups, AFM ermöglicht zu Interaktionen auf die einzelnen Moleküls (SMF)5 und Einzelzelle (SKSF)6 Messen . Diese Technologien ergab wertvolle Einblicke in die Bindung Mechanismen wie die Fang-Anleihen für die Interaktion von E. Coli Pilus Protein FimH mit Mannose7oder Tandem β-Reißverschluss wiederholt durch Fn-bindende Proteine aus S. Aureus gebildet gefunden bei der Bindung an Fn8. Wir waren vor kurzem in der Lage zu zeigen, dass der Pilus-1 adhäsin RrgA9,10 aus dem gram-positiven Bakterium Streptococcus Pneumoniae (Streptococcus Pneumoniae)11 ist in der Lage, an Fibronektin12 binden mit seinen zwei terminal-Domains. Dies ergab einen neuen zwei-Domain Bindungsmechanismus unterscheidet sich von der Tandem-β-Reißverschluss und Piliated Pneumokokken zu bilden und zu pflegen eine vorübergehende Kontakt zum Fibronektin-haltigen Host Oberflächen13ermöglichen kann.
Der Erfolg des SMFS Experimente hängt entscheidend von der funktionalen und native Immobilisierung von Biomolekülen auf festen Oberflächen und AFM-Tipps. Wie hohe Kräfte bei SMFS Messungen auftreten können, sollte die Proteine bevorzugt kovalent an die Oberfläche gekoppelt. Es gibt eine große Anzahl von verschiedenen Kupplung Methoden für die Immobilisierung von Proteine und andere Biomoleküle als auch ganze Zellen auf (anorganisch) festen Oberflächen, Nano-Partikeln und anderen Geräten beschrieben in der Literatur14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Diese Protokolle machen oft gefährlicher Stoffe zu verwenden, sind schwer zu führen und/oder erfordern spezielle Ausrüstung (z.B. Plasma Reiniger). Eine einfache Möglichkeit, paar Moleküle auf Glas ist Befestigung eine dickere Polymerschicht Heterobifunctional Vernetzer mit einem Silan-reaktive Gruppe auf der einen Seite und einem Amin-reaktive Gruppe auf ihrer anderen Seite. Abhängig von der Anwendung der Haftvermittler können umfassen flexible Hydro-Kohlenstoffketten mit variabler Länge, z. B.., Polyäthylenglycol (PEG). Sie unterdrücken unspezifische Wechselwirkungen der modifizierten Oberflächen (z.B., hydrophobe, elektrostatische und van-der-Waals-Wechselwirkungen) und der gekoppelten Molekül Rotationsfreiheit vorsehen.
Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll für die kovalente Kopplung von Proteinen enthält einen oder mehrere freie Aminogruppen (-NH2) Glas Oberflächen und Siliziumnitrid AFM Tipps über eine Heterobifunctional Ethoxy Silan-PEG-Carboxylgruppen (-COOH). Dieses Protokoll kann in SMFS Experimente, die beispielhaft ist basierend auf dem Zusammenspiel von RrgA und das extrazelluläre Matrix Protein Fn verwendet werden (siehe Abbildung 1 für eine Übersicht).
Der erste Schritt ist der Silanisierung der Oberfläche28,29,30,31. Es geht um die Hydrolyse der Ethoxy-Gruppen von der Haftvermittler um hochreaktive SiOH-Gruppen bilden. Diese können mit SiOH-Gruppen auf dem Substrat reagieren. In einem primären Kondensation Schritt, diese Silanolen Form Wasserstoffbindungen und ausgebreitet auf dem Substrat. In einer sekundären Kondensationsreaktion (das erfordert in der Regel Hitze oder Vakuum, um Wasser zu entfernen), Siloxan Anleihen gebildet werden. Daraus resultiert eine kovalent verbunden Organo-Silan-Schicht.
Der zweite Schritt ist die Kopplung von Proteinen zum funktionalen (-COOH) Gruppen, die aus dem Polymer-32erweitern. Erstens wird in eine reaktive N-Hydroxysuccinimid (NHS) Ester Mittelstufe, die durch die etablierten NHS/EDC gewonnen wird die Säure umgewandelt (1-Ethyl - 3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimid Chemie33 und erfährt Nucleophilen Substitution endlich eine Amid-Bindung mit primären Aminen der Proteine zu bilden.
Auf diese Weise RrgA mit Silizium-Nitrid-AFM-Tipps und menschlichen Fn auf Glassubstraten in einer wirrlage gekoppelt war und ihre Interaktion Kräfte wurden auf der Einzelmolekül-Ebene analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Oberflächenchemie zu einer homogenen Verteilung der Fn auf der Glasoberfläche und eine entsprechende Konzentration von RrgA an der Spitze, offensichtlich durch den Zielwert von bis zu 20 % der Interaktion Ereignissedes SMFS Messungen führt. Diese Chemie reduziert die unspezifischen Hintergrund Interaktionen, wenig Veränderung während der Datenerfassung unterliegt und eignet sich daher hervorragend für präzise SMFS Experimente.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752</td><td></td></tr><tr><td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Carl Roth</td><td>3738</td><td>100 %; analytische Reinheit</td></tr><tr><td>Doppelt destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065</td>&<td>ge; 99,8 %; analytische Reinheit</td></tr><tr><td>Ethoxysilan-Polyethylenglykolsäure</td><td>Nanocs</td><td>PG2-CASL-5k</td><td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Carl Roth</td><td>X896</td><td>32 %</td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimid</td><td>Merck</td><td>804518</td><td>NHS; für die Synthese</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung - Dulbecco</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Sondenmolekül z.B. Fibronektin, humanes Plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056</td><td></td></tr><tr><td>Sondenmolekül z.B. RrgA</td><td></td><td></td><td>Im Labor hergestellt</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Carl Roth</td><td>AE15</td><td>&ge; 99,3 %; TRIS; Pufferqualität</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Becher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasschneider Glasdias</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth</td><td>0656</td><td></td></tr><tr><td>Inertgas-Exsikkator</td><td>Sicco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop - Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 1</td><td>JPK Instruments</td> JPK NanoWizard SPM und DP Software JPK Instruments <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laborofen</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrospatel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Marke</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Meter</td><td>Knick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Starlab</td><td></td><td>10-100 & Mikro; L, 50-200 &Mikro; l, 100-1000&nbsp; &Mikro; l</td></tr><tr><td>Präzisionswaage</td><td>Acculab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siliziumnitrid-Cantilever-Ausleger - MLCT</td><td>Bruker AXS S.A.S</td><td></td><td>Federkonstante &le; 100 pN/nm</td></tr><tr><td>Beschallungsbad</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Färbegefäß</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop - Zeiss Stemi</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rührstab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimtech science precision wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twezzers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV PenRay</td><td>UVP, LLC</td><td>90-0012-01</td><td>Quecksilberspektrum mit der Primärenergie bei 254&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiegepapier</td><td>Carl Roth</td><td>TP64</td><td></td></tr></tbody></table>

kovalente immobilisierung von proteinen für die einzelmolekül-spektroskopie kraft

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In den letzten Jahren basierte Rasterkraftmikroskopie (AFM) Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie (SMF) erweitert das Verständnis der molekularen Eigenschaften und Funktionen. Es gab uns die Möglichkeit, eine Vielzahl von biophysikalischen Mechanismen, z. B., wie bakterielle Adhesins binden an Host Oberfläche Rezeptoren genauer zu erkunden. Neben anderen Faktoren hängt der Erfolg SMFS Experimente auf die funktionale und native Immobilisierung von Biomolekülen auf festen Oberflächen und AFM-Tipps. Hier beschreiben wir eine einfache Protokoll für die kovalente Kopplung von Proteinen zu Silizium-Oberflächen mit Silan-PEG-Carboxyls und die etablierten N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) Chemie in Ordnung Das Zusammenspiel von Pilus-1 adhäsin RrgA aus dem gram-positiven Bakterium Streptococcus Pneumoniae (Streptococcus Pneumoniae) mit der extrazellulären Matrix Protein Fibronektin (Fn) zu erkunden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Oberfläche Funktionalisierung zu einer homogenen Verteilung der Fn auf der Glasoberfläche und eine entsprechende Konzentration von RrgA auf der AFM Cantilever Spitze, offensichtlich durch den Zielwert von bis zu 20 % der Interaktion Ereignissedes SMFS führt Messungen und ergab, dass RrgA mit einer mittleren Kraft von 52 pN an Fn bindet. Das Protokoll kann Paar über bestimmte freie Thiol Websitegruppen eingestellt werden. Dies führt zu einer vordefinierten Protein oder Molekül Ausrichtung und eignet sich für andere biophysikalischen Anwendungen neben dem SMF.

Das Protokoll beschriebenen hier Ergebnisse in eine kovalente Immobilisierung der Proteine über ihre zugänglich primäre Amine mit wirrlage (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt ein AFM-Bild einer silanisiert Glasfläche mit (links) und ohne (rechts) Fn immobilisiert, aufgenommen nach der Austrocknung der Proben unter einen sanften Strom von Stickstoff. Die Silan Polymerschicht zeigt nur kleine Oberfläche Wellen mit einer Höhe von ca. 2-5 nm (Abbildung 2, rechts), während auf der Oberfläche funktionalisiert mit Fn, etwa 10 nm hohe Fn Moleküle sind erkennbar (Abbildung 2, Links). In Nahaufnahmen kann die dimeres Struktur des Fn erkannt werden. Die Fn-Moleküle scheinen kompakt mit einer Höhe von ca. 4-5 nm über die PEG-Oberflächenbeschichtung und einer Länge von ~ 120 nm (siehe Beilagen).
Um die Wechselwirkungskräfte der RrgA mit Fn, zu untersuchen, die vor kurzem im Detail von unserer Gruppe13beschrieben wurde, war RrgA ein Silizium-Nitrid AFM Tipp und menschlichen Fn auf Glassubstrat (Abbildung 3a) gekoppelt. Abbildung 3 zeigt repräsentative Tipp Probe Trennung Kurven der Wechselwirkung von RrgA mit Fn mit einer Zugkraft Geschwindigkeit von 1 µm s-1aufgezeichnet. Die verwendeten Oberflächenchemie führte zu einer niedrigen Hintergrund Interaktion und wohlgeformten einzeln (oder doppelt) Interaktion Veranstaltungen (Abbildung 3a), die ausgestattet waren mit einem erweiterbaren Wurm wie Chain (eWLC)-Modell (rote Kurve). Plotten der Ergebnisse der Passung (Bruch Kraft und -Länge, siehe Abbildung 4) zeigt, dass nach Überwindung unspezifische Oberfläche Wechselwirkungen zwischen AFM-Spitze und Substrat und Dehnung der PEG-Linker (&gt; 70 nm) bis ~ 19 % der Kraft Kurven zeigten Bruch Veranstaltungen mit einem mittleren Bruch zu zwingen, für die RrgA - Fn Zusammenspiel von ~ 52 pN an eine Spitze-Probe-Entfernungen von etwa 100 nm. Im Gegensatz dazu eine unanwendbar Oberflächenchemie (hier weggelassenen abschrecken mit Tris gepuffert saline Abb. 3 b) wird eine klare Bewertung einzelne Interaktion Veranstaltungen durch unspezifische Interaktionen verhindern mehrere Protein binden (Spur 2 und 3) und/oder Kovalente Kopplung von Proteinen zwischen der Probenoberfläche und der AFM Cantilever Spitze. Dies führt zu hohen Bruch Kräfte (Spur 1) eventuell begleitet von Entfaltung der Protein (Fn) Domains (Spur 4 und 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über die Oberflächenchemie. Die Hydrolyse von Ethoxy Silan-PEG-Carboxylgruppen folgt die Kondensation an der hydratisierten Glasoberfläche und die Bildung von Siloxan Querverbindungen. Die Reaktion von EDC mit der Carboxylgruppen führt zu einer reaktiven o- Acylisourea, Amin-reaktives Zwischenprodukt mit einer extrem kurzen Halbwertszeit in wässriger Lösung (Hydrolyse). Das Zwischenprodukt ist durch die Bildung von einem NHS Ester stabilisiert, erfährt der Nucleophilen Substitution um endlich eine Amid-Bindung mit primären Aminen auf die Proteine zu bilden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Abbildung 2: Immobilisierung von Fibronektin auf ein Glas Substrat über Heterobifunctional Ethoxy Silan PEG Carboxylgruppen Haftvermittler. AFM Bilder von funktionalisierten Glas Oberflächen mit (links) und ohne (rechts) FN Zahlen einzelnen Fn-Moleküle, die auf der Substratoberfläche (Einsätze) homogen verteilt sind. Die Moleküle nehmen eine dimeres und kompakte Struktur mit einer Höhe von ca. 4-5 nm über die PEG-Beschichtung und einer Länge von &gt; 100 nm. Dies ähnelt die Struktur des Fn in Lösung und steht im Einklang mit früheren AFM-Daten auf anderen Oberflächen, z. B. Glimmer (Maßstabsleiste Inlays = 500 nm)37. Unterhalb der AFM sind Bilder Höhenprofile entlang der Linien in der AFM-Bilder angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Abbildung 3: Abbildung eines SMFS Experiment und Vertreter zwingen Abstand Kurven des RrgA - Fn Interaktion. (a) RrgA und Fn waren kovalent verknüpfte über Heterobifunctional Ethoxy Silan PEG Carboxylgruppen Haftvermittler zu einer Siliziumnitrid AFM freitragende Spitze und einer Glasoberfläche bzw.. Vertreter SMFS zwingen Abstand, die Kurven für die RrgA - Fn Interaktion mit einer Retraktion Geschwindigkeit von 1 µm s-1 mit den beschriebenen Immobilisierung von RrgA und Fn angezeigt werden. Rote Kurven repräsentieren die erweiterbare Wurm-ähnliche Kette passt angewendet, um Bruch Kräfte und Längen zu erhalten. Die Figur wurde von Becke, Et Al., ACSnano 201813geändert. (b) Vertreter SMFS zwingen Abstand Kurven erhalten für die RrgA - Fn-Interaktion ohne abschrecken mit Tris gepufferte Kochsalzlösung. In diesem Fall das primäre Amin Tris abwesend war, dass aktive verbleibenden NHS Ester blieben ungesättigten während des Experiments. Dies führte zu Multi Protein binden (Spur 2 und 3) und die Klemmung der Proteine zwischen der Oberfläche und der AFM-Spitze führte zu hohen Bruch zwingt Begleitung (Fn)-Domäne Entfaltung (Spur 1, 4 und 5; beachten Sie die unterschiedlichen Skalierungen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Abbildung 4: Kraft und Länge Verteilung der einzelnen RrgA - Fn Interaktionen. Bruch, Kraft und entsprechenden Bruch Länge Histogramme gewonnenen RrgA - Fn SMFS Interaktion Messungen (n = 1400) mit einer Retraktion Geschwindigkeit von 1 µm s-1. Die Histogramme zeigen eine wahrscheinlichste Bruch Kraft fMP von 51,6 pN (Gauss passen, schwarze Linie) und eine Ansammlung von Bruch Längen rund 100 nm. Die Figur wurde von Becke, Et Al., ACSnano, 201813geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die kovalente Immobilisierung von Proteinen mit einer Heterobifunctional Silan Haftvermittler auf Siliziumoxid Oberflächen für die atomic Force Mikroskopie basierend Einzelmolekül Kraft Spektroskopie entwickelt die am Beispiel der Interaktion von RrgA (Pilus-1 Tipp adhäsin des Streptococcus Pneumoniae) mit Fibronektin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im biophysikalischen Bereich zu beantworten, z. B. wie stark ein einzelnes Protein in Proteininteraktionen ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur Immobilisierung einer Vielzahl verschiedener Biomoleküle verwendet werden kann. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Handhabung der Rasterkraftmikroskop-Cantilever-Sonde und die Bedienung des Rasterkraftmikroskops selbst eine Herausforderung darstellen können.Ziehen Sie zunächst säurebeständige Handschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel an. Verwenden Sie unter einem Abzug Isopropanol in fusselfreien Präzisionstüchern. Entfernen Sie groben Staub und Verunreinigungen von mehreren Objektträgern.Übertragen Sie die sauberen Objektträger in ein stehendes Glas, das mit Salzsäure gefüllt ist, die mit doppelt destilliertem Wasser verdünnt ist. Verschließen Sie das Glas mit einem geeigneten Deckel und stellen Sie es für 90 Minuten bei Raumtemperatur in ein Ultraschallbad. Übertragen Sie dann die Siliziumnitrid-AFM-Cantilever-Sonden mit der Spitze nach oben auf einen sauberen Glasobjektträger.Bringen Sie den Objektträger in eine UV-lichtundurchlässige Kammer und bestrahlen Sie den Objektträger mindestens 90 Minuten lang mit ultraviolettem Licht von oben. Ersetzen Sie danach die Salzsäure im Färbeglas durch doppelt destilliertes Wasser, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Glasoberfläche nicht austrocknet. Verschließen Sie das Glas mit dem Deckel und stellen Sie es für weitere 10 Minuten wieder in das Ultraschallbad.In der Zwischenzeit Ethoxysilanpolyethylenglykolsäure in einem Gemisch aus Ethanol und doppelt destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter auflösen. Verschließen Sie diese Lösung hermetisch, um die Verdunstung des Ethanols zu verhindern. Wenn Sie fertig sind, gießen Sie die Silanlösung in zwei separate Petrischale.Legen Sie die sauberen Objektträger in die eine Petrischale und den Ausleger in die andere. Verschließen Sie beide Platten mit Parafilm hermetisch, um zu verhindern, dass das Ethanol verdampft. Inkubieren Sie die stationären Platten 90 Minuten lang bei Raumtemperatur.Danach werden mit drei aufeinanderfolgenden Bechergläsern mit reinem Ethanol sowohl der Ausleger als auch die Objektträger gewaschen. Legen Sie den gewaschenen Ausleger auf einen sauberen Objektträger. Übertragen Sie die funktionalisierten Objektträger in das Färbegefäß.Beides im Ofen bei 110 Grad Celsius 30 Minuten aushärten. Lagern Sie dann die silanisierten Glasproben und den Ausleger bis zu einer Woche lang in einem Vakuumexsikkator. Wenn Sie bereit sind, mit der zufälligen Immobilisierung von Proteinen zu beginnen, bereiten Sie eine Lösung her, die EDC und NHS in phosphatgepufferter Standardkochsalzlösung enthält, wie im Textprotokoll beschrieben.Decken Sie die silanbeschichteten Objektträger mit dieser Lösung ab. Legen Sie die silanisierten Cantilever-Sonden in einen Tropfen der ECD/NHS-Lösung. Inkubieren Sie beide 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.Spülen Sie anschließend sowohl den Ausleger als auch die Objektträger in drei aufeinanderfolgenden Bechergläsern, um überschüssiges EDC/NHS vollständig abzuwaschen. Übertragen Sie die aktivierten Objektträger in eine Petrischale, die mit einem feuchten Tuch ausgestattet ist. Geben Sie ein Tröpfchen der gewünschten Proteinlösung in den EDC/NHS-aktivierten Bereich der Objektträger, verschließen Sie die Petrischale mit Parafilm und inkubieren Sie die Sonden bei Raumtemperatur.Geben Sie ein Tröpfchen der gewünschten Proteinlösung in die mit einem feuchten Tuch ausgestattete Cantilever-Box. Waschen Sie dann die Cantilever-Sonden gründlich mit PBS. Legen Sie die Sonden in das Tröpfchen in der Box und schließen Sie die Box.Inkubieren Sie die Sonden bei Raumtemperatur. Markieren Sie danach den Bereich des Proteintröpfchens auf der Rückseite der Objektträger. Sowohl die Objektträger als auch die Cantilever-Sonden werden gründlich mit drei aufeinanderfolgenden Bechern gereinigt, die mit PBS gefüllt sind.Legen Sie die gewaschenen Sonden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in ein Gefäß mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung. Waschen Sie dann die Objektträger und die Cantilever-Sonden gründlich mit PBS. Bewahren Sie sie bis zur Verwendung in separaten Petrischalen auf, die mit PBS bedeckt sind.Befestigen Sie einen frisch gereinigten Objektträger auf dem AFM-Probenhalter und bedecken Sie ihn mit PBS-Puffer. Befestigen Sie anschließend die vorbereitete Cantilever-Sonde am Cantilever-Halter und platzieren Sie sie in den AFM-Kopf. Befeuchten Sie den Ausleger vorsichtig mit einem Tropfen PBS-Puffer.Bewegen Sie den Cantilever langsam in Richtung der Kalibrierfläche, bis der Cantilever vollständig in den PBS-Puffer eingetaucht ist, aber immer noch von der Kalibrieroberfläche entfernt ist. Verwenden Sie entweder das optische Draufsichtmikroskop oder das inverse Mikroskop des AFM, um den Laser auf der Rückseite des Auslegers zu positionieren. Platzieren Sie den Laserspot in der Nähe des Endes des Cantilevers in der Nähe der Stelle, an der sich die Spitze befindet, und stellen Sie die Position an der Vier-Quadranten-Detektor-Fotodiode des AFM so ein, dass der reflektierte Laserstrahl in der Mitte der Fotodiode positioniert wird.Öffnen Sie anschließend den Kalibrierungsmanager in der AFM-Software. Um mit der Kalibrierung der Cantilever-Empfindlichkeit und der Federkonstante zu beginnen, nähern Sie sich vorsichtig der Substratoberfläche und zeichnen Sie eine Kraft-Abstands-Kurve auf. Passen Sie eine gerade Linie an den steilsten Teil der Rückzugskraftkurve an, an der die Spitze mit der Substratoberfläche in Kontakt kommt, um die Empfindlichkeit des optischen Hebels zu bestimmen.Ziehen Sie den Cantilever von der Probenoberfläche zurück und zeichnen Sie mehrere thermische Rauschspektren mit dem Cantilever, der mindestens 100 Mikrometer von der Oberfläche entfernt ist, auf und passen Sie einen harmonischen Oszillator, der von der AFM-Software bereitgestellt wird, an die thermischen Rauschspektren an, um die Federkonstante des Cantilevers zu bestimmen. Ziehen Sie danach den Ausleger langsam zurück und ziehen Sie ihn aus der Lösung zurück. Entfernen Sie die Glasoberfläche, die für die Cantilever-Kalibrierung verwendet wurde, und ersetzen Sie sie durch die Probenoberfläche, die die immobilisierten Proteine enthält.Bewegen Sie den feuchten Cantilever-Transistor langsam in Richtung der Probenoberfläche, bis der Cantilever-Transistor vollständig mit PBS-Puffer bedeckt ist, aber noch von der Substratoberfläche weg ist. Nähern Sie sich der Oberfläche und zeichnen Sie mehrere Kraft-Abstands-Kurven an verschiedenen Stellen auf der Probenoberfläche mit einer Kontaktkraft von 250 Piconewton, einer Kontaktzeit von einer Sekunde, einer Rückzugslänge von zwei Mikrometern und einer Rückzugsgeschwindigkeit von einem Mikrometer pro Sekunde auf. Wählen Sie in der Datenverarbeitungssoftware das Symbol "Charge von Force Scan öffnen" aus, um die Dateien mit den gemessenen Kraftkurven zu öffnen.Wählen Sie das Symbol V-Beugung durch Anpassen der Empfindlichkeit in Federkonstante neu kalibrieren, um die Auslegerbeugung in die direkt proportionale Kraft umzuwandeln. Wählen Sie dann das Symbol Basisliniensubtraktion' aus, um die Basislinie des Rückzugskanals in einem Bereich der Kraftkurve zu subtrahieren, der weit von der Oberfläche entfernt ist, wodurch auch das Kraftniveau von Null festgelegt wird. Wählen Sie das Symbol Kontaktpunktbestimmung', um den Punkt zu definieren, an dem die Spitze mit der Probe in Kontakt kommt.Wählen Sie das Symbol "Tip Sample Separation", um das Höhensignal in eine Tip-Sample-Separation umzuwandeln. Zusätzlich zur Subtraktion der Kontaktpunktposition wird dabei die Auslegerbiegung subtrahiert, um den Abstand zwischen der Substratoberfläche und der AFM-Spitze zu berechnen. Wählen Sie das Symbol "Polymerkettenmodell anpassen" und dann das Modell "Extensible Worm-like Chain" aus, um die Kraftabstandskurven auf Kraftspitzen zu untersuchen, die bei Bruchlängen über 70 Nanometern auftreten.Sortieren Sie unspezifische Wechselwirkungen aus und wenden Sie das erweiterbare wurmartige Kettenmodell auf die ausgewählten Peaks an. In dieser Studie werden Proteine kovalent mit zufälliger Orientierung über ihre zugänglichen primären Amine immobilisiert. Ein AFM-Bild der silanisierten Polymerschicht zeigt nur kleine Oberflächenwellen mit Höhen zwischen etwa zwei und fünf Nanometern.Es zeigt sich jedoch, dass die mit Fibronektin funktionalisierte Oberfläche Fibronektinmoleküle mit einer Höhe von etwa 10 Nanometern aufweist. Bei genauerem Hinsehen zeigt sich, dass die dimere Struktur der Moleküle zu erkennen ist. Diese Moleküle erscheinen kompakt, mit einer Höhe von vier bis fünf Nanometern über der PEG-Oberflächenbeschichtung und einer Länge von etwa 120 Nanometern.Anschließend werden die Wechselwirkungskräfte von RRGA mit Fibronektin untersucht. Repräsentative Trennkurven der Spitzenprobe, die bei einer Polgeschwindigkeit von einem Mikrometer pro Sekunde aufgezeichnet wurden, zeigten eine geringe Hintergrundwechselwirkung und wohlgeformte Wechselwirkungsereignisse, die dann unter Verwendung eines erweiterbaren wurmartigen Kettenmodells angepasst werden. Die Darstellung der Ergebnisse dieser Anpassung zeigt, dass nach Überwindung unspezifischer Oberflächenwechselwirkungen beim Dehnen der PEG-Linker bis zu 19% der Kraftkurven Bruchereignisse mit einer mittleren Bruchkraft von 52 Piconewton für die RRGA-Fibronektin-Wechselwirkung und bei einem Spitzenprobenabstand von etwa 100 Nanometern aufweisen.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Daten der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie je nach Einstellungen wie der Kontaktzeit oder der Rückzugsgeschwindigkeit mehrere Informationen enthalten und dass dieses Protokoll nur ein erster Schritt zur vollständigen Datenanalyse sein kann. Diese Methode kann nicht nur Einblicke in die Wechselwirkungen einzelner Moleküle geben, sondern auch zur Untersuchung von Wechselwirkungen auf Einzelzellebene verwendet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Einzelzell-Kraftspektroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie ganze Zellen mit proteinbeschichteten Oberflächen interagieren.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Säuren und UV-Licht extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie säurebeständige Handschuhe und eine UV-lichtundurchlässige Kammer getroffen werden sollten.

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Die kovalente Befestigung von Sondenmolekülen an aatomaren Kraftmikroskopie(AFM)-Auslegerspitzen ist eine wesentliche Technik für die Untersuchung ihrer physikalischen Eigenschaften. So können wir die Dehnkraft, Desorptionskraft und Länge von Polymeren über die AFM-basierte Einzelmolekülkraftspektroskopie mit hoher Reproduzierbarkeit bestimmen.

Kovalente Befestigung einzelner Moleküle für die AFM-basierte Kraftspektroskopie

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung mehrerer Phosphorylierungen eines intrinsisch ungeordneten Proteins mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), wobei das Tau-Protein als Fallstudie verwendet wird. Rekombinantes Tau wird vor der Datenerfassung und -analyse in vitro durch eine Kinase isotopenangereichert und modifiziert.

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Lernen Sie die kovalente Immobilisierung von Proteinen auf Siliziumoxid-Oberflächen für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie mit dem Rasterkraftmikroskop. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen von Proteinwechselwirkungen.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

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