Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im biophysikalischen Bereich zu beantworten, z. B. wie stark ein einzelnes Protein in Proteininteraktionen ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur Immobilisierung einer Vielzahl verschiedener Biomoleküle verwendet werden kann. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Handhabung der Rasterkraftmikroskop-Cantilever-Sonde und die Bedienung des Rasterkraftmikroskops selbst eine Herausforderung darstellen können.

Ziehen Sie zunächst säurebeständige Handschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel an. Verwenden Sie unter einem Abzug Isopropanol in fusselfreien Präzisionstüchern. Entfernen Sie groben Staub und Verunreinigungen von mehreren Objektträgern.

Übertragen Sie die sauberen Objektträger in ein stehendes Glas, das mit Salzsäure gefüllt ist, die mit doppelt destilliertem Wasser verdünnt ist. Verschließen Sie das Glas mit einem geeigneten Deckel und stellen Sie es für 90 Minuten bei Raumtemperatur in ein Ultraschallbad. Übertragen Sie dann die Siliziumnitrid-AFM-Cantilever-Sonden mit der Spitze nach oben auf einen sauberen Glasobjektträger.

Bringen Sie den Objektträger in eine UV-lichtundurchlässige Kammer und bestrahlen Sie den Objektträger mindestens 90 Minuten lang mit ultraviolettem Licht von oben. Ersetzen Sie danach die Salzsäure im Färbeglas durch doppelt destilliertes Wasser, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Glasoberfläche nicht austrocknet. Verschließen Sie das Glas mit dem Deckel und stellen Sie es für weitere 10 Minuten wieder in das Ultraschallbad.

In der Zwischenzeit Ethoxysilanpolyethylenglykolsäure in einem Gemisch aus Ethanol und doppelt destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter auflösen. Verschließen Sie diese Lösung hermetisch, um die Verdunstung des Ethanols zu verhindern. Wenn Sie fertig sind, gießen Sie die Silanlösung in zwei separate Petrischale.

Legen Sie die sauberen Objektträger in die eine Petrischale und den Ausleger in die andere. Verschließen Sie beide Platten mit Parafilm hermetisch, um zu verhindern, dass das Ethanol verdampft. Inkubieren Sie die stationären Platten 90 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Danach werden mit drei aufeinanderfolgenden Bechergläsern mit reinem Ethanol sowohl der Ausleger als auch die Objektträger gewaschen. Legen Sie den gewaschenen Ausleger auf einen sauberen Objektträger. Übertragen Sie die funktionalisierten Objektträger in das Färbegefäß.

Beides im Ofen bei 110 Grad Celsius 30 Minuten aushärten. Lagern Sie dann die silanisierten Glasproben und den Ausleger bis zu einer Woche lang in einem Vakuumexsikkator. Wenn Sie bereit sind, mit der zufälligen Immobilisierung von Proteinen zu beginnen, bereiten Sie eine Lösung her, die EDC und NHS in phosphatgepufferter Standardkochsalzlösung enthält, wie im Textprotokoll beschrieben.

Decken Sie die silanbeschichteten Objektträger mit dieser Lösung ab. Legen Sie die silanisierten Cantilever-Sonden in einen Tropfen der ECD/NHS-Lösung. Inkubieren Sie beide 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Spülen Sie anschließend sowohl den Ausleger als auch die Objektträger in drei aufeinanderfolgenden Bechergläsern, um überschüssiges EDC/NHS vollständig abzuwaschen. Übertragen Sie die aktivierten Objektträger in eine Petrischale, die mit einem feuchten Tuch ausgestattet ist. Geben Sie ein Tröpfchen der gewünschten Proteinlösung in den EDC/NHS-aktivierten Bereich der Objektträger, verschließen Sie die Petrischale mit Parafilm und inkubieren Sie die Sonden bei Raumtemperatur.

Geben Sie ein Tröpfchen der gewünschten Proteinlösung in die mit einem feuchten Tuch ausgestattete Cantilever-Box. Waschen Sie dann die Cantilever-Sonden gründlich mit PBS. Legen Sie die Sonden in das Tröpfchen in der Box und schließen Sie die Box.

Inkubieren Sie die Sonden bei Raumtemperatur. Markieren Sie danach den Bereich des Proteintröpfchens auf der Rückseite der Objektträger. Sowohl die Objektträger als auch die Cantilever-Sonden werden gründlich mit drei aufeinanderfolgenden Bechern gereinigt, die mit PBS gefüllt sind.

Legen Sie die gewaschenen Sonden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in ein Gefäß mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung. Waschen Sie dann die Objektträger und die Cantilever-Sonden gründlich mit PBS. Bewahren Sie sie bis zur Verwendung in separaten Petrischalen auf, die mit PBS bedeckt sind.

Befestigen Sie einen frisch gereinigten Objektträger auf dem AFM-Probenhalter und bedecken Sie ihn mit PBS-Puffer. Befestigen Sie anschließend die vorbereitete Cantilever-Sonde am Cantilever-Halter und platzieren Sie sie in den AFM-Kopf. Befeuchten Sie den Ausleger vorsichtig mit einem Tropfen PBS-Puffer.

Bewegen Sie den Cantilever langsam in Richtung der Kalibrierfläche, bis der Cantilever vollständig in den PBS-Puffer eingetaucht ist, aber immer noch von der Kalibrieroberfläche entfernt ist. Verwenden Sie entweder das optische Draufsichtmikroskop oder das inverse Mikroskop des AFM, um den Laser auf der Rückseite des Auslegers zu positionieren. Platzieren Sie den Laserspot in der Nähe des Endes des Cantilevers in der Nähe der Stelle, an der sich die Spitze befindet, und stellen Sie die Position an der Vier-Quadranten-Detektor-Fotodiode des AFM so ein, dass der reflektierte Laserstrahl in der Mitte der Fotodiode positioniert wird.

Öffnen Sie anschließend den Kalibrierungsmanager in der AFM-Software. Um mit der Kalibrierung der Cantilever-Empfindlichkeit und der Federkonstante zu beginnen, nähern Sie sich vorsichtig der Substratoberfläche und zeichnen Sie eine Kraft-Abstands-Kurve auf. Passen Sie eine gerade Linie an den steilsten Teil der Rückzugskraftkurve an, an der die Spitze mit der Substratoberfläche in Kontakt kommt, um die Empfindlichkeit des optischen Hebels zu bestimmen.

Ziehen Sie den Cantilever von der Probenoberfläche zurück und zeichnen Sie mehrere thermische Rauschspektren mit dem Cantilever, der mindestens 100 Mikrometer von der Oberfläche entfernt ist, auf und passen Sie einen harmonischen Oszillator, der von der AFM-Software bereitgestellt wird, an die thermischen Rauschspektren an, um die Federkonstante des Cantilevers zu bestimmen. Ziehen Sie danach den Ausleger langsam zurück und ziehen Sie ihn aus der Lösung zurück. Entfernen Sie die Glasoberfläche, die für die Cantilever-Kalibrierung verwendet wurde, und ersetzen Sie sie durch die Probenoberfläche, die die immobilisierten Proteine enthält.

Bewegen Sie den feuchten Cantilever-Transistor langsam in Richtung der Probenoberfläche, bis der Cantilever-Transistor vollständig mit PBS-Puffer bedeckt ist, aber noch von der Substratoberfläche weg ist. Nähern Sie sich der Oberfläche und zeichnen Sie mehrere Kraft-Abstands-Kurven an verschiedenen Stellen auf der Probenoberfläche mit einer Kontaktkraft von 250 Piconewton, einer Kontaktzeit von einer Sekunde, einer Rückzugslänge von zwei Mikrometern und einer Rückzugsgeschwindigkeit von einem Mikrometer pro Sekunde auf. Wählen Sie in der Datenverarbeitungssoftware das Symbol "Charge von Force Scan öffnen" aus, um die Dateien mit den gemessenen Kraftkurven zu öffnen.

Wählen Sie das Symbol V-Beugung durch Anpassen der Empfindlichkeit in Federkonstante neu kalibrieren, um die Auslegerbeugung in die direkt proportionale Kraft umzuwandeln. Wählen Sie dann das Symbol Basisliniensubtraktion' aus, um die Basislinie des Rückzugskanals in einem Bereich der Kraftkurve zu subtrahieren, der weit von der Oberfläche entfernt ist, wodurch auch das Kraftniveau von Null festgelegt wird. Wählen Sie das Symbol Kontaktpunktbestimmung', um den Punkt zu definieren, an dem die Spitze mit der Probe in Kontakt kommt.

Wählen Sie das Symbol "Tip Sample Separation", um das Höhensignal in eine Tip-Sample-Separation umzuwandeln. Zusätzlich zur Subtraktion der Kontaktpunktposition wird dabei die Auslegerbiegung subtrahiert, um den Abstand zwischen der Substratoberfläche und der AFM-Spitze zu berechnen. Wählen Sie das Symbol "Polymerkettenmodell anpassen" und dann das Modell "Extensible Worm-like Chain" aus, um die Kraftabstandskurven auf Kraftspitzen zu untersuchen, die bei Bruchlängen über 70 Nanometern auftreten.

Sortieren Sie unspezifische Wechselwirkungen aus und wenden Sie das erweiterbare wurmartige Kettenmodell auf die ausgewählten Peaks an. In dieser Studie werden Proteine kovalent mit zufälliger Orientierung über ihre zugänglichen primären Amine immobilisiert. Ein AFM-Bild der silanisierten Polymerschicht zeigt nur kleine Oberflächenwellen mit Höhen zwischen etwa zwei und fünf Nanometern.

Es zeigt sich jedoch, dass die mit Fibronektin funktionalisierte Oberfläche Fibronektinmoleküle mit einer Höhe von etwa 10 Nanometern aufweist. Bei genauerem Hinsehen zeigt sich, dass die dimere Struktur der Moleküle zu erkennen ist. Diese Moleküle erscheinen kompakt, mit einer Höhe von vier bis fünf Nanometern über der PEG-Oberflächenbeschichtung und einer Länge von etwa 120 Nanometern.

Anschließend werden die Wechselwirkungskräfte von RRGA mit Fibronektin untersucht. Repräsentative Trennkurven der Spitzenprobe, die bei einer Polgeschwindigkeit von einem Mikrometer pro Sekunde aufgezeichnet wurden, zeigten eine geringe Hintergrundwechselwirkung und wohlgeformte Wechselwirkungsereignisse, die dann unter Verwendung eines erweiterbaren wurmartigen Kettenmodells angepasst werden. Die Darstellung der Ergebnisse dieser Anpassung zeigt, dass nach Überwindung unspezifischer Oberflächenwechselwirkungen beim Dehnen der PEG-Linker bis zu 19% der Kraftkurven Bruchereignisse mit einer mittleren Bruchkraft von 52 Piconewton für die RRGA-Fibronektin-Wechselwirkung und bei einem Spitzenprobenabstand von etwa 100 Nanometern aufweisen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Daten der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie je nach Einstellungen wie der Kontaktzeit oder der Rückzugsgeschwindigkeit mehrere Informationen enthalten und dass dieses Protokoll nur ein erster Schritt zur vollständigen Datenanalyse sein kann. Diese Methode kann nicht nur Einblicke in die Wechselwirkungen einzelner Moleküle geben, sondern auch zur Untersuchung von Wechselwirkungen auf Einzelzellebene verwendet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Einzelzell-Kraftspektroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie ganze Zellen mit proteinbeschichteten Oberflächen interagieren.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Säuren und UV-Licht extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie säurebeständige Handschuhe und eine UV-lichtundurchlässige Kammer getroffen werden sollten.