Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Etablierung von Explankulturen von Zebrafisch-Keratozyten für den Einsatz in kollektiven Zellmigrations- und Epithel-Wundheilungsstudien. Dazu werden zunächst Schuppen mit anhaftendem Epithelgewebe aus dem anästhesierten adulten Zebrafisch entfernt. Die Schuppen mit anhaftendem Gewebe werden in eine Kulturschale gelegt, damit die Zellen anhaften können.

Dann wird das Nährmedium zusammen mit allen Behandlungen hinzugefügt, die im Versuchsdesign angezeigt sind. Schließlich werden die Zellen inkubiert und per Videomikroskopie für den gewünschten Zeitraum beobachtet. Letztendlich kann eine Vielzahl von Assays verwendet werden, um Veränderungen der Migration oder der zellulären Morphologie sowie der Expression von Proteinen oder anderen Markern im Laufe der Zeit nachzuweisen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Transformationszellkulturmethode, besteht darin, dass Explantatkulturen primär sind, die sich eng an die Eigenschaften der Zelle in vivo anpassen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der epithelialen Wundheilung zu beantworten, wie z.B. die Rolle der kollektiven Migration und des Übergangs von Epithel zu Mesenchym. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da Schuppen möglicherweise nicht an der Wachstumsoberfläche haften oder in einer bestimmten Kulturschale nicht wachsen.

Verfahren wird von Jose Rap PanIN, Medizinstudent Chana TI und Agnes Pasquale, beide leitende wissenschaftliche Mitarbeiterinnen in meinem Labor, demonstriert. Zur Vorbereitung dieses Experiments chlorieren Sie etwa 1,5 Liter Leitungswasser entweder mit einem handelsüblichen Entchlorungsmittel oder indem Sie das Wasser 24 Stunden lang stehen lassen, und verwenden Sie dann 500 Milliliter, um jedes der drei Ein-Liter-Becher zu füllen. Beschriften Sie ein Becherglas zum Halten von Fischen vor jedem Eingriff und ein zweites zum Bergen in das dritte Becherglas.

Fügen Sie 100 Mikrogramm pro Milliliter Trica hinzu. Zur Betäubung von Fischen füllen Sie eine flache Schale mit Eis. Erwärmen Sie das Kulturmedium auf Raumtemperatur und sammeln Sie eine saubere Juwelierpinzette.

Reinigen Sie die Pinzette, indem Sie die Spitzen in 70%iges Ethanol tauchen und durch einen Bunsenbrenner führen, damit das Ethanol abbrennen kann. Fangen Sie die gewünschte Anzahl Fische und legen Sie sie in einen Becherglas. Einen einzelnen Fisch in den Anästhesiebecher geben.

Nachdem Sie den Fisch gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, legen Sie ihn auf Eis und platzieren Sie ihn waagerecht, wobei der Schwanz zur Hand zeigt, die die Pinzette hält. Um die Schuppen zu entfernen, positionieren Sie die Pinzette parallel zum Fisch. Mit der Spitze am Rand einer Schuppe drücken Sie die flache Seite der Pinzette leicht in die Seite des Fisches, damit sich die Schuppe vom Körper des Fisches abhebt.

Fassen Sie die Waage mit der Pinzette an, zupfen Sie sie und legen Sie sie, ohne sie umzudrehen, in die Gewebekulturschale. Wiederholen Sie den Vorgang und entfernen Sie maximal 12 Schuppen von einem großen Erwachsenen und vermeiden Sie dabei die Kiemenregion, die Seitenlinie und die Flossen. Legen Sie den Fisch in das Auffangbecherglas und überwachen Sie, um sicherzustellen, dass er sich von den Auswirkungen der Anästhesie erholt.

Setzen Sie den Fisch dann in ein einzelnes Aquarium um und lassen Sie den Fisch 21 Tage lang sich erholen, um eine vollständige Regeneration der Schuppen zu ermöglichen. Platzieren Sie je nach Versuch bis zu 20 Schuppen pro Kunststoff. 35 Millimeter mit Gewebekultur behandelte Schale oder vier bis sechs Waagen pro Glas.

Untere Schale, lassen Sie die Schuppen an der Schale haften, bevor Sie vorsichtig 1,2 Milliliter vollständiges Medium in jede Kulturschale geben. Inkubieren Sie die X-Explan-Kulturen bei 28 Grad Celsius für den gewünschten Zeitraum mit oder ohne Behandlung, um die Mikroskopie durchzuführen. Nachdem Sie eine Schale mit Zellblättern aus dem Inkubator genommen haben, positionieren Sie sie auf dem Mikroskoptisch.

Verwenden Sie ein vierfaches Objektiv zum anfänglichen Fokussieren, um die Bildaufnahme im Laufe der Zeit zu erleichtern. Markieren Sie die Position jedes Zellblatts und/oder die Ausrichtung der Schale auf dem Tisch. Fotografieren Sie die Zellfaltblätter zu verschiedenen Zeitpunkten gemäß dem Versuchsprotokoll und legen Sie, wenn nur Standbilder für das Experiment benötigt werden, wieder in den Inkubator.

Um Proben für die Immunfluoreszenzmikroskopie zu fixieren, bereiten Sie Lösungen vor und erwärmen Sie sie bei Raumtemperatur. Um OSE-Standorte unter Fluoreszenz zu betrachten, verwenden Sie 35-Millimeter-Schalenkulturschalen mit Glasboden, um Auberginen zu züchten, wie zuvor in diesem Video beschrieben, ohne das Kulturmedium zu entfernen, und fügen Sie 0,8 Milliliter 4 % Paraldehyd in 1,1 XPBS zu jeder Schale hinzu. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Saugen Sie dann die Lösung an. Geben Sie weitere 0,8 Milliliter Fixiermittel in jede Schale und aspirieren Sie die Lösung nach einer zweiten fünfminütigen Inkubation. Sofern keine externen Liganden oder Epitope verwendet werden, permieren Sie die Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter 0,2 % TRITTON X 100 in einer XPBS-Inkubation für fünf Minuten zugeben.

Bevor Sie die Lösung entfernen, fügen Sie 0,5 Milliliter 1%iges BSA in ein XPBS hinzu und inkubieren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius nach der Inkubation, aspirieren Sie die Lösung und fahren Sie mit der Antikörperfärbung fort. Alternativ können Sie ein bis zwei Milliliter 1%BSA in einem XPBS hinzufügen und drei bis vier Wochen bei vier Grad Celsius lagern. Führen Sie eine Immunfluoreszenz durch.

Gemäß dem hier dargestellten Textprotokoll kann beobachtet werden, wie Keratozytenblätter innerhalb weniger Stunden nach der Etablierung der EXPLAN-Kultur unter der Skala hervorwandern. Gelegentlich kann ein individuell wandernder Keratinozyten beobachtet werden, der sich von der kollektiv wandernden Schicht gelöst hat. Die anfängliche Geschwindigkeit des Blattvorschubs ist extrem schnell, aber diese Rate verlangsamt sich schnell, wenn sich die Zellen während der ersten 48 Stunden der Kultur ausbreiten.

Der schnelle Anstieg ist nicht mit der Zellproliferation verbunden, da nach 24-stündiger Markierung mit der fluoreszierenden EDU etwa 10 % der Zellen Anzeichen einer Zellteilung zeigen, eine Rate, die weit unter der von transformierten Zelllinien liegt. Wenn die Behandlung zu dem Zeitpunkt hinzugefügt wird, zu dem X explan etabliert wird, verändern einige Verbindungen die kollektive Zellmigration. Wie hier gezeigt, verringern einige MMP-Inhibitoren beispielsweise die Zellblattfläche nach 24 Stunden.

Wenn in Kultur lösliches RGD-haltiges Peptid zu dem Kulturmedium hinzugefügt wird, um die Adhäsionsbildung zu stören, schrumpft das Lamly an der Vorderkante des Blattes schnell und anschließend löst sich die Vorderkante des Blattes ab und zieht sich zurück und es dauert weniger als zwei Minuten, um die Lokalisation von Proteinen innerhalb des Blattes oder innerhalb von Liter- und Folgezellen zu beurteilen. Das gesamte Blech kann fixiert und gebeizt werden, wie in dieser Abbildung gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 10 bis 15 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, vorwärmte Nährmedien erst hinzuzufügen, nachdem Sie den Zyten Zeit gegeben haben, an der Kulturschale zu haften.

Andere Methoden wie die QPCR können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. Veränderungen der Genexpression in Abhängigkeit von der Zeit und/oder dem Behandlungszustand. Nachdem Sie sich dieses Verfahren angesehen haben, sollten Sie eine viel bessere Vorstellung davon haben, wie Sie IDE-Explankulturen für die Verwendung in einer Vielzahl von Prozeduren einrichten.