Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Die Erhaltung des Epithelgewebes erfordert die kontinuierliche Entfernung geschädigter und absterbender Zellen, ohne die Barrierefunktion zu stören. Um dies zu erreichen, extrudieren Sie sterbende Zellen, indem Sie einen Ring aus Aktin und Myosin in der Zelle bilden und zusammenziehen, die die sterbende Zelle umgibt, um sie auszustoßen und gleichzeitig alle Lücken zu schließen, die sich aus ihrem Austritt ergeben haben könnten. In diesem Videoartikel "Eine Methode zur Induktion und Abbildung der apoptotischen Zellextrusion aus der Epidermis von Zebrafischlarven" in Echtzeit.

Dies wird durch die Injektion einer rot fluoreszierenden Protein-markierten F-Aktin-Sonde in transgene Zebrafischembryonen im Zellstadium erreicht, die grün fluoreszierendes Protein in der Epidermis exprimieren, um wirkende Filamente in Epithelgeweben sichtbar zu machen. Am vierten Tag werden Larven nach der Personalisierung, die sowohl GFP als auch RFP exprimieren, mit G vier 18 behandelt, um Apoptose in der Epidermis zu induzieren. Die Dynamik des Aktins und die Formänderungen der Epithelzellen, die während der Extrusion auftreten, werden durch Zeitraffer-Bildgebung an einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop visualisiert.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Immunkräften und Analysen besteht darin, dass wir schnelle Veränderungen und Aktindynamiken beobachten können, die während des Extrusionsprozesses in einem lebenden Epithelgewebe auftreten. In diesem Video zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Abbildung der Extrusion von apoptotischen Zellen aus der Epidermis von sich entwickelnden Zebrafischen in Echtzeit. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um zu verstehen, wie Zellen ihr Akton-Zytoskelett koordiniert neu anordnen, um apoptotische Zellen zu entfernen, während die Barrierefunktion erhalten bleibt, und wie eine Unterbrechung des Extrusionsprozesses zu bestimmten Krankheitszuständen führen kann.

Fangen wir also an: Um die Handlungsdynamik während der Zellextrusion in der Epidermis von sich entwickelnden Zebrafischen sichtbar zu machen, beginnen Sie mit dem Auftauen zuvor transkribierter RNA auf Eis. Wir transkribieren Mr.mRNA, das für ein rot fluoreszierendes Protein kodiert, das mit dem Calp in der Homologiedomäne von Utrophin fusioniert ist und im Bindungsprotein wirkt. Fügen Sie der RNA Phenolrot im Verhältnis eins zu eins hinzu, um eine endgültige RNA-Konzentration von etwa 30 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen, und laden Sie einen Mikroliter Lösung durch Rückfüllung in eine gezogene Kapillarnadel.

Sammeln Sie etwa 75 1-Zell-Embryonen des C-K-G-F-P-Stadiums in E-3-Puffer. Pipettieren Sie die entnommenen Embryonen mit einer Fünf- und Dreiviertel-Nudelpipette in die Mikroinjektionsform und richten Sie die Embryonen vorsichtig mit FST Dumont im Trog aus. Nummer fünf: Die Pinzette wirkt schnell, um zu vermeiden, dass die RNA unter einem Standard-Stereomikroskop im Labor in mehrstufige Embryonen injiziert werden muss.

Verwenden Sie einen druckgesteuerten Mikroinjektor, um die RNA als Phenolfossil in das Joch der Embryonen zu injizieren. Rot sollte im Embryo nach der Injektion sichtbar sein. Achten Sie darauf, dass Sie für jedes Experiment mindestens 50 Embryonen injizieren.

Sortieren Sie die Embryonen, um unbefruchtete oder beschädigte Eizellen zu entfernen, und inkubieren Sie alle verbleibenden Embryonen bei 28 Grad Celsius. Verwenden Sie nach 24 Stunden ein Fluoreszenz-Präpariermikroskop, um Zebrafischembryonen auszuwählen, die ein hohes Maß an GFP-Fluoreszenz in der Epidermis und eine RFP-markierte wirkende Fluoreszenz aufweisen. Inkubieren Sie die ausgewählten Embryonen bei 28 Grad Celsius, bis sie mit der medikamentösen Behandlung fortfahren können, um eine Apoptose-Exposition gegenüber dem Aminoglykosid zu induzieren.

Das Antibiotikum G vier 18 oder das Arzneimittel bewirkt die Extrusion apoptotischer Zellen aus der Epidermis der sich entwickelnden Zebrafischlarven. Wichtig ist, dass diese Behandlung nur bei Larven wirkt, die vier Tage nach der Befruchtung älter sind, um die Zellextrusion zu induzieren. Sammeln Sie 4 Tage nach der Befruchtung bis zu 25 Zebrafischlarven, die sowohl GFP als auch RFP exprimieren, in eine 35 x 10 Millimeter große Kulturschale mit drei Millilitern E drei Medium.

Ersetzen Sie das Medium vorsichtig durch drei Milliliter E drei, das ein Milligramm pro Milliliter G vier 18 enthält, und inkubieren Sie die Larve vier Stunden lang im Dunkeln bei 28 Grad Celsius in dem Arzneimittel. Entfernen Sie dann das Medium und ersetzen Sie es durch vorwärmte E drei Medien mit 0,02 % trica und fahren Sie mit dem Einbetten der Larven fort, um die Larven für die Bildgebung zu mounten. Übertragen Sie bis zu drei Larven in ein 1,5-Milliliter-Fendorröhrchen und entfernen Sie den größten Teil des E drei Mediums.

Mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze pipettieren Sie 120 Mikroliter mit 1 % niedriger Schmelze in die Tube und mischen sie. Und dann pipettieren Sie die Mischung aus Larven und Aro vorsichtig auf das Deckglas am Boden einer Matech-Kulturschale. Richten Sie die Larven mit einem FST-Stifthalter mit einem Einsatzstift oder einer Wolframnadel schnell so aus, dass sie gerade und flach auf dem Deckglas anliegen.

Lassen Sie den Kessel erstarren. Füllen Sie dann die Schale vorsichtig mit E drei medium mit 0,02 % trica. Wir haben festgestellt, dass der gesamte Prozess der apoptotischen Zellextrusion aus der Epidermis der sich entwickelnden Zebrafischlarven etwa 20 Minuten dauert.

Hier zeigen wir, wie man ein Zeitraffer-Bildgebungsexperiment mit einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop und der und/oder IQ-Software einrichtet, um eine Ebene der Serie Z durch eine einzelne Schicht der Zebrafisch-Epidermis zu sammeln. Schalten Sie zunächst die Argon- und Helium-Neonlaser, die Mikroskopkamera und die Epi-Leuchtstofflampe in der und/oder IQ-Software ein. Erstellen Sie ein Zeitreihenprotokoll mit den abzubildenden Wellenlängen.

Die Häufigkeit der Intervalle zwischen den Bildaufnahmen und die Häufigkeit, mit der die Aufnahme wiederholt werden sollte: Stellen Sie die Mattec-Schale, die die Probe enthält, vorsichtig auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie dann ein 20-fach-Objektiv mit Durchlicht, um auf die Larven zu fokussieren. Bringen Sie das 40-fach Wasserimmersionsobjektiv in die richtige Position. Mit diesem Ziel können wir etwa 20 bis 25 Zellen pro Feld filmen, was es uns ermöglicht, das zelluläre Verhalten während der Extrusion zu verfolgen und gleichzeitig die subzelluläre Handlungsdynamik aufzulösen.

Geben Sie vorsichtig einen Tropfen Wasser auf die Oberseite des 40-fachen Objektivs und stellen Sie die Mattec-Schale schnell darauf. Identifizieren Sie die Probe mit Hellfeldbeleuchtung und verwenden Sie dann die 488-Nanometer-Epifluoreszenz, um sich speziell auf die GFP-positive Epidermis zu fokussieren. Wechseln Sie in den konfokalen Scanmodus.

Passen Sie die Laserintensität und die Belichtungszeit für jeden der Kanäle entsprechend an. Achten Sie darauf, die Laserleistung und die Belichtungszeit auszugleichen, um Ihr Signal optimal zu erfassen und Phototoxizität zu vermeiden. Um extrudierende Zellen zu identifizieren, verwenden Sie die Epi-Fluoreszenz, um die GFP-markierte Epidermis sichtbar zu machen, und identifizieren Sie eine Gruppe von Zellen in einem klassischen Rosettenmuster, das aus einer Ansammlung von Zellen besteht, die eine kleine runde Zelle in der Mitte umgeben.

Zusätzlich sollte es eine Anhäufung des RFP-markierten Aktins geben, das als Ring um die kleine runde Zelle in der Mitte sichtbar ist, ein Kennzeichen der Zellextrusion. Sobald eine Extrusionszelle identifiziert wurde, können Sie schnell die oberen und unteren Grenzwerte für die Z-Serie und die Schrittweite festlegen. Beginnen Sie dann mit der Erfassung von vier konfokalen D-Datensätzen, um die Daten anzuzeigen und die Kontraktion des Aktinrings und das Epithelverhalten zu visualisieren, das um die sterbende Zelle herum auftritt.

Erstellen Sie im Laufe der Zeit 3D-Projektionen der Z-Serie, und speichern Sie die Daten als Filmdatei. Dieser Schritt kann mit einer Vielzahl von Softwarepaketen durchgeführt werden. Diese Abbildung zeigt die Expression von RFP UTR CH in der Epidermis einer vier Tage nach der Befruchtung CK GFP Zebrafischlarven.

Hier sind immer noch Z-Projektionen aus einem Zeitrafferfilm zu sehen, die der Dynamik des Live-Schauspiels folgen. Während des Prozesses der Extrusion von Epithelzellen sind die Pfeile dargestellt, die den von benachbarten Zellen gebildeten Aktinring bezeichnen, der sich im Laufe von zwei Minuten zusammenzieht und schließt. Nach diesem Verfahren können wir andere Methoden in Kombination mit dieser Technik verwenden, wie z. B. die Verwendung chemischer Inhibitoren oder genetischer Mutationen, um besser zu verstehen, wie eine Veränderung der Extrusion zu bestimmten Krankheitszuständen führen kann.

Aufgrund des Scheiterns, apoptotische Zellen zu beseitigen, haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie ein Zeitraffer-Bildgebungsexperiment einrichten können, um den Extrusionsprozess aus der Epidermis des sich entwickelnden Zebrafischs zu visualisieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Lichtmenge, die Ihrer Probe ausgesetzt ist, zu begrenzen, um Lichtbleichen oder Toxizität zu vermeiden. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.