Experimentelle Bewertung der Maus Sociability einer automatisierten Bildverarbeitung Ansatz

Das übergeordnete Ziel dieser Verhaltensversuche in Kombination mit automatischer Analyse ist es, die Sozialverhalten von Mäusen zeiteffizient zu quantifizieren. Diese Methode kann bei der schnellen Untersuchung von Wirkstoffen zur Steigerung der Sozialverhalten in validierten Mausmodellen des Autismus-Spektrums helfen. Der Hauptvorteil der Einführung einer automatisierten Analyse besteht darin, dass sie den Prozess beschleunigt und das Screening effizienter macht.

Die Notwendigkeit einer automatisierten Methode zur Beurteilung des sozialen Verhaltens von Mäusen ergab sich daraus, dass die visuelle Echtzeitanalyse einer einzelnen Dosis einer Testverbindung über 50 Stunden in Anspruch nimmt. Später im Video wird meine Doktorandin Frency Varghese die automatisierte Analyse demonstrieren. Beginnen Sie damit, den dreikammerigen Käfig mit schwarzen Wänden aufzubauen.

Platzieren Sie für die erste Sitzung eine leere, umgedrehte Drahttasse in jedes Endfach des Käfigs. Bereiten Sie nun die Videokamera vor, um den Käfig von oben zu beobachten. Alle drei Fächer sollten mit einer Auflösung von mindestens 720 mal 480 Pixeln sichtbar sein.

Danach die Käfige mit indirektem Glühlampenlicht beleuchten, sodass die Innenseite des Käfigs, gemessen vom Boden aus, nicht mehr als 3,5 Lux aufweist. Zusätzlich Infrarotlicht bereitstellen, um den Käfig so zu beleuchten, dass die Kamera es erfassen kann. Eine Einzelbildaufnahme des leeren Käfigs zur Referenz aufnehmen.

Stellen Sie für die erste Sitzung die Testmaus in den Käfig. Um die automatisierte Analyse des Videos zu starten, wedeln Sie anschließend genau einmal mit der Hand über den Käfig. Lassen Sie die Maus 10 Minuten lang den Testkäfig erkunden.

Bringen Sie es dann in seinen Heimkäfig zurück. Für die zweite Sitzung platzieren Sie die Stimulus-Maus unter eine der beiden umgedrehten Tassen. Wählen Sie die Tasse nach einem gegenläufigen Schema aus.

Geben Sie in der Software an, unter welchem Becher die Stimulusmaus platziert wurde. Gemäß der Benennungskonventionen wird der Becher, der die eingeschlossene Maus enthält, als sozialer Becher bezeichnet, während der andere Becher als asozialer Becher gilt. Die Abteilungen werden auf ähnliche Weise benannt.

Beginnen Sie den Anfang der zweiten Sitzung mit einer Handbewegung wie bei der ersten Sitzung. Entfernen Sie am Ende der zweiten Sitzung die umgedrehten Becher, um die zweite Maus freizulassen. Verwenden Sie eine weitere Handbewegung, um den Beginn der dritten Sitzung anzugeben, und lassen Sie die beiden Mäuse 10 Minuten lang im Testkäfig interagieren.

Nach 10 Minuten bringen Sie beide Mäuse in ihre Heimkäfige zurück. Dieser Abschnitt erläutert, wie die Filme mithilfe der Benutzeroberfläche verarbeitet werden. Es ist jedoch auch eine schnelle Batch-Analyse ohne Benutzereingaben möglich.

Beginnen Sie mit dem Laden des Films mithilfe der Schaltfläche „Load“. Wählen Sie dann die Käfigkonfiguration aus. Das Analyseprogramm ermittelt die Käfiggrenzen, Kompartimente und Becher.

Wählen Sie eine der vier voreingestellten Konfigurationen aus oder passen Sie die Koordinaten manuell an. Führen Sie nun für jeden Einzelbild des Films die folgenden Verarbeitungsschritte aus. Konvertieren Sie zunächst die Einzelbilder in Graustufen.

Ziehen Sie als Zweites den Graustufen-Referenzrahmen, der während der Vorbereitungen aufgenommen wurde, ab, um so die Pixelwerte überall bis auf die Position der Maus auf null zu setzen. Als Drittes binarisieren Sie die Einzelbilder, indem Sie alle Pixel oberhalb einer Helligkeitsschwelle auf Weiß setzen und alle übrigen auf Schwarz. Passen Sie diese Einstellung an die Beleuchtungsbedingungen an.

Entfernen Sie nun den Schwanz aus den Bildern, indem Sie die Funktion „Erode/Dilate“ verwenden. Erodieren Sie das binarisierte Bild zunächst dreimal. Danach dilatieren Sie den Rahmen sechsmal.

Danach die Frames noch dreimal erodieren. Dies erfordert möglicherweise eine Anpassung, wenn eine andere Pixelauflösung verwendet wird. Die Handbewegungen lassen sich leicht anhand großer Sprünge im Volumen der weißen Pixel identifizieren.

Dadurch ist eine automatische Erkennung von Sitzungsbeginn und Sitzungsreihenfolge möglich. Erkennen Sie innerhalb jeder Sitzung die größte Komponente aus weißen Pixeln mithilfe des L/Comp-Befehls. Dadurch werden Pixel eliminiert, die nicht zur Maus gehören.

Verwenden Sie dann die Funktion „Enden finden“, um die beiden am weitesten voneinander entfernten Pixel innerhalb der größten Komponente aus weißen Pixeln zu bestimmen. Dies sind die Schnauze und der Schwanz. Die Software ermittelt den Schwerpunkt oder COG des Objekts aus weißen Pixeln und berechnet daraus die Bewegungsrichtung von Bild zu Bild.

Für Sitzungen mit zwei Mäusen müssen zwei Objekte verfolgt werden. Wählen und orientieren Sie die beiden größten Objekte mit den meisten weißen Pixeln unter Verwendung desselben Befehlssatzes aus. Die Software überprüft automatisch die COGs von Bild zu Bild.

Wenn sich die Größe eines der Objekte um mehr als 20 % verändert oder sich ein Schwerpunkt weiter bewegt, als es für eine Maus möglich ist, wird die Binarisierungsschwelle automatisch erhöht, bis diese Kriterien erfüllt sind. Die Software überprüft automatisch die Schwerpunkte von Bild zu Bild. Wenn sich die Größe eines der Objekte um mehr als 20 % ändert oder sich ein Schwerpunkt weiter bewegt, als es für eine Maus möglich ist, wird die Binarisierungsschwelle automatisch angepasst, bis diese Kriterien erfüllt sind.

Interaktionen werden automatisch erfasst, wenn sich die Objekte innerhalb von zwei Zentimetern befinden. Diese Segmente werden zur Eingabe durch den Benutzer wiedergegeben. Für jedes Segment kennzeichnen Sie die Perspektive der Testmaus entweder als Soziale Vermeidung, Soziale Annäherung oder Keine.

Um die automatische Analyse zu überprüfen, laden Sie den Film mithilfe der Schaltfläche „Laden“. Klicken Sie anschließend auf „Sitzung 1 starten“, um den ersten Frame dieser Sitzung anzuzeigen. Steuern Sie die Wiedergabe mit dem Befehl „Wiedergabe/Stop“.

Die verarbeiteten Filme zeigen jede Maus mit einem farbigen Kreis an Kopf und Schwanz. Außerdem werden die Sozialitätsmaße auf dem Bildschirm angezeigt und während der Wiedergabe aktualisiert. Korrigieren Sie alle Fehler, die bei der automatisierten Analyse aufgetreten sind.

Der häufigste Fehler ist eine Kopf-Schwanz-Umkehrung, die mithilfe eines Werkzeugs auf der Oberfläche behoben werden kann. Dies tritt bei etwa 20 % der Videos auf. In seltenen Fällen komplizierterer Fehler können diese gewöhnlich behoben werden, indem man manuell die Position der Mausnase über eine bestimmte Serie von Videobildern hinweg angibt.

Nach der Überprüfung die Sozialitätsdaten mithilfe der Export-Funktion im Tabellenkalkulationsformat exportieren. Um Daten aus mehreren Filmen als einzelne Tabelle zu exportieren, müssen die Filme in einem Ordner gebündelt werden, und die Funktion „Daten zusammenstellen“ führt den Vorgang durch. In Sitzung eins wurde eine vier Wochen alte BALB/c-Testmaus verfolgt, die sich innerhalb von 10 Minuten 59-mal zwischen den Kammern bewegte.

Die verbrachte Zeit in jedem Kompartiment gilt als Baseline für die Kompartimentpräferenz ohne soziellen Stimulus. In der zweiten Sitzung wurden eine soziale und eine nichtsoziale Schale mit einer versteckten vier Wochen alten ICR-Maus präsentiert. Es zeigte sich eine deutliche Präferenz dafür, die Zeit im sozialen Kompartiment zu verbringen.

Insbesondere verbrachte die Maus mehr Zeit mit der sozialen Tasse als mit der nichtsozialen Tasse. In der dritten Sitzung wurden die Tassen angehoben, und die Mäuse durften interagieren. Insgesamt wurden 35 soziale Annäherungen innerhalb von 10 Minuten durchgeführt.

Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik eine schnellere Untersuchung erfolgversprechender Medikamente, um den Kernsymptombereich der beeinträchtigten Sozialverträglichkeit in validierten Mausmodellen des Autismus-Spektrums zu verbessern. Die automatisierte Auswertung kann an verschiedene Käfigdesigns und Arten angepasst werden. Jedes Verhalten von Interesse kann bewertet werden, solange ein Algorithmus zur zuverlässigen Erkennung desselben entwickelt werden kann.