Eines mikrofluidischen Chips für ICPMS Probenaufgabe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die elementare Zusammensetzung von monodispergierten Mikrotröpfchen, die einzelne Zellen oder wässrige Lösungen enthalten, mittels I-C-P-M-S zu generieren und quantitativ zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein mikrofluidischer Chip mittels Replica-Molding mit PDMS hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, Spritzenpumpen an den Mikrofluidik-Chip anzuschließen.

Die Pumpen fördern die wässrige Probe und die leicht flüchtige und zulässige bzw. organische Trägerphase PFH. Wenn die Spritzenpumpe eingeschaltet wird, erzeugt der mikrofluidische Chip durch Strömung monodispergierte Tröpfchen der wässrigen Probenlösung oder einer Zellsuspension, fokussiert mit PFH und stößt diese Tröpfchen mit zusätzlichem PFH als Flüssigkeitsstrahl aus dem Chip aus. Der letzte Schritt besteht darin, den Chip in eine Transportanordnung einzusetzen, die aus einer Heizpatrone besteht, die die Tröpfchen verdampft, und einer Membrandesalvator, die die Lösungsmittel entfernt, bevor die Ionisierung und Detektion des Tröpfchengehalts durch ein I-C-P-M-S erfolgt.

Abschließend werden die aufgezeichneten Signale und eine Kalibriermessung mit einer Standardlösung verwendet, um die elementare Zusammensetzung der Probenlösung bzw. der Zellen in der Suspension zu bestimmen. Die Hauptvorteile unserer mikrofluidischen Technik gegenüber bestehenden Methoden sind die einstellbare Tröpfchengröße, der geringe Probenverbrauch und das geringe Risiko von Nologging bei der Arbeit mit Zellsuspensionen oder konzentrierten Salzlösungen. Darüber hinaus vermeidet der kostengünstige mikrofluidische Einweg-Chip die Reinigungszeit und eliminiert Kreuzkontaminationen.

Das Verfahren wird von vin sc, einem Doktoranden aus dem Labor von Professor GTAs, und Pascal Fabrica, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um den MIKROFABRIKATIONSPROZESS zu beginnen, messen Sie 40 Gramm PDMS und vier Gramm PDMS-Härtungsmittel in einer großen Kunststoffschale. Mischen Sie beide Teile gleichmäßig mit einem Spatel und stellen Sie die Form für 20 bis 30 Minuten in ein Vakuumtrocken, um alle Blasen aus der Mischung zu entgasen.

Während der Entgasung. Platzieren Sie eine Gießform auf einem mikrostrukturierten Siliziumwafer und verwenden Sie die Führungsstruktur um das Design, um sie auf einem flachen Siliziumwafer einzurasten. Eine weitere Gießform frei darauf setzen.

Gießen Sie etwa drei bis vier Gramm der Degas PDMS-Mischung auf beide Gießformen. Übertragen Sie beide Siliziumwafer auf eine Heizplatte. Härten Sie das PDMS sechs Minuten lang bei 150 Grad Celsius aus und kühlen Sie es dann ab.

Die erstarrten PDMS-Strukturen werden auf der Bank bei Raumtemperatur mit einem Metallspatel aufgebaut. Trennen Sie die massiven PDMS-Blöcke vorsichtig von den Formen. Schützen Sie die Klebeflächen beider Blöcke vor Partikel- und Fingerabdruckverunreinigungen.

Durch das Aufbringen einer Schicht durchsichtigem Klebeband können die PDMS-Teile nun mit einer Schere angefasst und zugeschnitten werden. Entfernen Sie nach dem Trimmen das Klebeband vom mikrostrukturierten PDMS-Block und verwenden Sie einen Biopsie-Locher, um die mikrofluidischen Einlassöffnungen zu erstellen. Damit ist der Herstellungsprozess für die mikrostrukturierte Hälfte des Geräts abgeschlossen, und es ist nun bereit, mit seinem flachen Gegenstück verklebt und montiert zu werden.

Um die Dienstleistungen für das PDMS-zu-PDMS-Bonding vorzubereiten, beginnen Sie mit der Schleuderbeschichtung einer Schicht PDMS-Härters auf einem leeren Siliziumwafer bei 6.000 U/min für 30 Sekunden, während das Härter noch feucht ist, bringen Sie die Bondschnittstelle des mikrostrukturierten PDMS-Blocks in Kontakt mit dem Wafer und üben Sie sanft Druck auf das PDMS aus, um eine nahtlose Versiegelung ohne Blasen zu bilden. Entfernen Sie in einem separaten Schritt das Schutzband von der flachen Gegenstücke. Trennen Sie dann langsam das mikrostrukturierte PDMS vom Siliziumwafer.

Richten Sie die beiden PDMS-Teile vorsichtig aus und bringen Sie die beiden Bonding-Schnittstellen in Kontakt. Drücken Sie die beiden Blöcke vorsichtig zusammen, um alle Grenzflächenblasen zu entfernen, und härten Sie den zusammengebauten PDMS-Chip 24 Stunden lang aus. Führen Sie bei Raumtemperatur mit einem Universalmesser und einer Ausrichtungsvorrichtung einen Schnitt entlang der Indikatorlinie orthogonal zur Auslassdüse durch. Untersuchen Sie den Chip unter einem Mikroskop auf Beschnitt von Defekten und Partikelverunreinigungen in der Nähe der freiliegenden Auslassdüse

Nach der Bewertung der Fertigungsqualität sind die Innenflächen des PDMS-Mikrokanals bereit für die Siloisierung. Verbinden Sie in einer chemischen Haube ein Ende einer Wolfsflasche mit einer trockenen Stickstoffquelle und verbinden Sie das andere Ende der Flasche mit den Einlässen des PDMS-Chips. Verwenden Sie mehrere Röhrchen, die an einen zentralen Verteiler angeschlossen sind, pipettieren Sie dann 50 Mikroliter der Seline in die Wolfsflasche und verschließen Sie den oberen Deckel.

Schalten Sie den Stickstoffträgerstrom ein und spülen Sie die Mikrokanäle 20 Minuten lang mit einer salzhaltigen Dampflösung bei einer Durchflussrate von etwa einem Milliliter pro Sekunde. Trennen Sie zum Schluss die Einlassschläuche von der Wolfsflasche. Die beschichteten PDMS-Chips sind bereit für massenspektrometrische Experimente für Einzelzell-Massenspektrometrie-Messungen.

Verdünnen Sie zunächst die Eingangsprobe mit einem geeigneten Puffer so, dass die effektive zelluläre Konzentration weniger als 10 Millionen Zellen pro Milliliter beträgt. Zur Vorbereitung der Massenspektrometrie beginnen Sie mit dem Anbringen von Schläuchen an den Probenspritzen. Laden Sie zwei Fünf-Milliliter-Spritzen mit dem PFH und laden Sie die Eingabeprobe in eine separate Ein-Milliliter-Spritze. Entfernen Sie alle Blasen, die in den Spritzen und Schläuchen eingeschlossen sind, und laden Sie die beiden Spritzen auf eine Spritzenpumpe.

Stellen Sie sicher, dass der Transportschlauch richtig ausgerichtet ist und alle Gasschläuche angeschlossen sind. Verbinden Sie anschließend die Spritzenschläuche mit den Einlassanschlüssen des PDMS-Chips und aktivieren Sie die Spritzenpumpe für drei bis fünf Minuten. Entfernen Sie während dieses Strömungsstabilisierungsprozesses überschüssige Flüssigkeit mit einem Tuch aus der Auslassöffnung.

Wenn die Flüssigkeit austritt, bildet der Chip keinen geraden Strahl. Versuchen Sie nach fünf Minuten, mögliche Verstopfungen am Späneauslass mit einem sauberen Tuch abzuwischen. Wenn dies nicht erfolgreich ist, verwerfen Sie den vorhandenen Chip, und ersetzen Sie die Verbindung durch einen neuen Chip.

Entfernen Sie den Stecker vom Adapter des Zyklonsprühgeräts und setzen Sie den strömungsstabilisierten PDMS-Chip vorsichtig in den Adapter ein. Ändern Sie die Durchflussmenge gemäß den empfohlenen Einstellungen und stabilisieren Sie den Durchfluss für zwei bis fünf Minuten. Gleichzeitig werden die Durchflussraten für alle Gase angepasst, bis die maximale Signalintensität des interessierenden Analyten erreicht ist.

Stimmen Sie außerdem die Plasmaleistung und die Fokussierlinsenspannung am Massenspektrometer ab, um die Signalintensität bei der Signaloptimierung weiter zu erhöhen. Stellen Sie das Massenspektrometer auf eine Verweilzeit von 10 Millisekunden ein und beginnen Sie mit der Datenerfassung. Übertragen Sie die Rohdaten nach den Messungen an ein Datenanalyseprogramm.

In einer typischen Datenanalyseroutine werden zunächst alle Messungen in Datenabschnitte unterteilt, wobei jeder Abschnitt die Anzahl der Zählungen pro 10 Millisekunden Verweilzeit darstellt, dann wird ein Histogrammdiagramm für alle Klassen erstellt und mit der Gaußschen Verteilungsfunktion ausgestattet. Der Mittelwert und die Streuung einzelner Anpassungen stellen sowohl die mittlere Signalintensität als auch die Standardabweichung bei einem bestimmten Verhältnis von Masse zu Ladung dar. Um den Kalibrierungsprozess zu starten, messen Sie zunächst eine Standardlösung mit der gleichen Durchflussrate wie Ihre Probe.

Richten Sie mit dem PDMS-Chip für die Tröpfchenerzeugung zwei Fünf-Milliliter-Spritzen für PFH und eine Ein-Milliliter-Spritze für die Standardlösung ein. Verwenden Sie dann eine Petrischale als Mikroskop-Probenhalter, platzieren Sie den PDMS-Chip in der Petrischale und bringen Sie den Chip unter geringer Vergrößerung in den Fokus, um die vorherigen Protokollschritte zu spiegeln. Stabilisieren Sie die Tröpfchenerzeugung innerhalb des PDMS-Mikrokanals für drei bis fünf Minuten mit einer Hochgeschwindigkeitskamera.

Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern von wässrigen Tröpfchen auf dem Chip an der sekundären Verbindungsstelle, um den durchschnittlichen Tröpfchendurchmesser aus den Aufnahmen zu erhalten. Verwenden Sie eine Bildanalysesoftware mit einer speziellen Droplet-Morph-, Optometrie- und Velo-Symmetrie-Suite. Unter der Annahme, dass jedes Tröpfchen als sphärisches Objekt modelliert werden kann, kann das durchschnittliche Tröpfchenvolumen anhand des von der Software ermittelten durchschnittlichen Tröpfchendurchmessers geschätzt werden.

Als nächstes dividiert man die bekannte Analytkonzentration der Probe durch das durchschnittliche Tröpfchenvolumen, um die Masse des Analyten zu erhalten, die in einem Tröpfchen enthalten ist. Wandeln Sie dann die resultierende Masse in die Anzahl der Atome um. Berechnen Sie abschließend die Gesamtdetektionseffizienz, indem Sie die Anzahl der gemessenen Ionen pro Tröpfchen durch das vorherige Ergebnis dividieren.

Diese Detektionseffizienz kann nun als Kalibriergröße verwendet werden, um die Anzahl der Atome in einer unbekannten Probe zu bestimmen. Mit Hilfe eines mikrofluidischen Tröpfchengenerators können einzelne Zellen in monodispergierten wässrigen Tröpfchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 50 Mikrometern eingekapselt und mit I-C-P-M-S analysiert werden. Die organische PFH-Hülle, die das wässrige Tröpfchen umgibt, kann leicht entfernt werden, bevor die Probe den I-C-P-M-S-Detektor erreicht.

Bei der Messung von Lösungen kann die hohe Tröpfchen-Monodispersität als geringe Varianzen zwischen Gruppen von Signalen beobachtet werden, die entweder von einer einfachen, doppelten oder einer dreifachen Tröpfchenzählung innerhalb einer gegebenen Verweilzeit stammen. Nach ordnungsgemäßer Kalibrierung kann der Eisengehalt eines Ensembles einzelner roter Blutkörperchen von Rindern bestimmt werden, die jeweils in einzelnen Tröpfchen suspendiert sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese mikrofluidischen Chips für die quantitative Elementaranalyse von sehr kleinen Probenvolumina oder einzelnen Partikeln und Zellen vorbereiten und verwenden.

Die Herstellung dieser Chips dauert weniger als 15 Minuten, Hands-on-Time pro Chip, wenn sie richtig gut ausgeführt wird. Darüber hinaus ermöglichen die leicht zu modifizierenden Chips die Integration weiterer mikrofluidischer Module für eine fortschrittliche Probenvorbehandlung und die gleichzeitige Einführung von Proben und Standards, um die Effizienz und den Probendurchsatz zu verbessern.