Eines mikrofluidischen Chips für ICPMS Probenaufgabe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die elementare Zusammensetzung von monodispersen Mikrotropfen, die einzelne Zellen oder wässrige Lösungen enthalten, mittels I-C-P-M-S zu erzeugen und quantitativ zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein mikrofluidischer Chip durch Abformung mit PDMS hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, Spritzenpumpen mit dem mikrofluidischen Chip zu verbinden.

Die Pumpen liefern die wässrige Probe sowie die hochflüchtige und zugelassene oder organische Trägerphase PFH. Sobald die Spritzenpumpe eingeschaltet wird, erzeugt der mikrofluidische Chip durch Strömungsfokussierung mit PFH monodisperse Tropfen der wässrigen Probelösung oder einer Zellsuspension und stößt diese zusammen mit zusätzlichem PFH als Flüssigkeitsstrahl aus dem Chip aus. Der letzte Schritt besteht darin, den Chip in eine Transportvorrichtung einzusetzen, die aus einer Patronenheizung besteht, welche die Tropfen verdampft, und einem Membrantrenner, der die Lösungsmittel vor der Ionisierung und Detektion des Tropfeninhalts mittels I-C-P-M-S entfernt.

Schließlich werden die aufgezeichneten Signale zusammen mit einer Kalibrierungsmessung anhand einer Standardlösung verwendet, um die Elementzusammensetzung der Probenlösung oder der Zellen in der Suspension zu bestimmen. Die wichtigsten Vorteile unserer mikrofluidischen Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden sind die einstellbare Tröpfchengröße, der geringe Probenverbrauch und das geringe Risiko von Verstopfungen bei der Arbeit mit Zellsuspensionen oder konzentrierten Salzlösungen. Darüber hinaus vermeidet der kostengünstige, Einweg-mikrofluidische Chip Reinigungszeiten und eliminiert Kreuzkontaminationen.

Den Vorgang werden All Vin SC, ein Doktorand aus dem Labor von Professor GTA, und Pascal Fabrica, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Um den MIKROFABRIZIERUNGSPROZESS zu beginnen, messen Sie 40 Gramm PDMS und 4 Gramm PDMS-Härter in einer großen Plastikschale ab. Mischen Sie beide Bestandteile gleichmäßig mit einem Spatel und stellen Sie die Schale anschließend 20 bis 30 Minuten lang in einen Vakuum-Exsikkator, um alle Blasen aus der Mischung zu entfernen.

Während des Entgasens. Legen Sie eine Gießform auf eine mikrostrukturierte Siliziumwafer und verwenden Sie die Führungstruktur um das Design, um sie auf einem flachen Siliziumwafer an ihrer Position einzurasten. Legen Sie eine weitere Gießform frei darauf.

Geben Sie etwa drei bis vier Gramm der entgasten PDMS-Mischung auf beide Gussformen. Übertragen Sie beide Siliziumwafer auf eine Heizplatte. Aushärten des PDMS bei 150 Grad Celsius für sechs Minuten und anschließendes Abkühlen.

Die erstarrten PDMS-Strukturen bei Raumtemperatur mit einem Metallspatel von der Arbeitsfläche lösen. Die festen PDMS-Blöcke vorsichtig von den Formen trennen. Die Bondflächen beider Blöcke vor Partikel- und Fingerabdruckkontamination schützen.

Indem eine Schicht durchsichtigen Klebebands aufgebracht wird, können die PDMS-Stücke nun mit einer Schere bearbeitet und auf die gewünschte Größe zugeschnitten werden. Nach dem Zuschnitt wird das Klebeband von dem mikrostrukturierten PDMS-Block entfernt, und mit einer Biopsie-Lochstanze werden die Zulauföffnungen für das Mikrofluidiksystem angefertigt. Damit ist der Herstellungsprozess für die mikrostrukturierte Hälfte der Vorrichtung abgeschlossen, und sie ist nun bereit, mit ihrem flachen Gegenstück verklebt und zusammengebaut zu werden.

Um die Oberflächen für die PDMS-zu-PDMS-Bindung vorzubereiten, beschichten Sie zunächst eine Schicht PDMS-Härtungsmittel durch Auftragen auf eine leere Siliziumscheibe mit 6.000 U/min für 30 Sekunden. Während das Härtungsmittel noch feucht ist, bringen Sie die Bindungsfläche des mikrostrukturierten PDMS-Blocks mit der Scheibe in Kontakt und üben Sie vorsichtig Druck auf das PDMS aus, um eine nahtlose, blasenfreie Dichtung zu erzeugen. In einem separaten Schritt entfernen Sie das Schutzband von der flachen Gegenseite. Trennen Sie anschließend den mikrostrukturierten PDMS-Block langsam von der Siliziumscheibe.

Richten Sie die beiden PDMS-Stücke sorgfältig aus und bringen Sie die beiden Verbindungsoberflächen in Kontakt. Drücken Sie vorsichtig auf die beiden Blöcke, um eventuelle Blasen an der Grenzfläche zu entfernen, und härten Sie den zusammengesetzten PDMS-Chip 24 Stunden bei Raumtemperatur aus. Verwenden Sie ein Multifunktionsmesser und eine Ausrichtungsvorrichtung, um entlang der Markierungslinie senkrecht zur Auslassdüse einen Schnitt anzubringen. Untersuchen Sie den Chip unter dem Mikroskop auf Beschneidefehler und Partikelkontamination in der Nähe der freigelegten Auslassdüse.

Nach der Beurteilung der Herstellungsqualität können die inneren Oberflächen des PDMS-Mikrokanals silanisiert werden. Verbinden Sie in einer chemischen Abzugshaube ein Ende einer Wolf-Flasche mit einer trockenen Stickstoffquelle und das andere Ende der Flasche mit den Einlässen des PDMS-Chips. Geben Sie mithilfe mehrerer Schläuche, die an ein zentrales Verteilerstück angeschlossen sind, 50 µL der Silanlösung in die Wolf-Flasche und verschließen Sie den Deckel.

Schalten Sie den Stickstoff-Trägerstrom ein und spülen Sie die Mikrokanäle 20 Minuten lang mit einem Salzlösung enthaltenden Dampf bei einer Flussrate von etwa einem Milliliter pro Sekunde durch. Trennen Sie abschließend die Zuleitungsrohre von der Wolf-Flasche. Die beschichteten PDMS-Chips sind nun bereit für Massenspektrometrie-Experimente zur Einzelzell-Massenspektrometrie.

Zunächst verdünnen Sie die Eingangsprobe mit einem geeigneten Puffer, sodass die effektive Zellkonzentration unter 10 Millionen Zellen pro Milliliter liegt. Zur Vorbereitung der Massenspektrometrie befestigen Sie Schläuche an den Proben-Spritzen. Befüllen Sie zwei Fünf-Milliliter-Spritzen mit PFH und die Eingangsprobe in einer separaten Ein-Milliliter-Spritze. Entfernen Sie sämtliche in den Spritzen und Schläuchen eingeschlossenen Blasen und setzen Sie die beiden Spritzen auf eine Spritzenpumpe auf.

Stellen Sie sicher, dass das Transportrohr korrekt ausgerichtet ist und alle Gasschläuche angeschlossen sind. Schließen Sie anschließend die Spritzenschläuche an die Einlassöffnungen des PDMS-Chips an und schalten Sie die Spritzenpumpe für drei bis fünf Minuten ein. Entfernen Sie während dieses Durchflussstabilisierungsprozesses überschüssige Flüssigkeit am Auslass mit einem Tuch.

Falls die austretende Flüssigkeit am Chip keinen geraden Strahl bildet, versuchen Sie nach fünf Minuten, eventuelle Verunreinigungen an der Auslassöffnung des Chips mit einem sauberen Tuch zu entfernen. Falls dies nicht erfolgreich ist, entsorgen Sie den vorhandenen Chip und ersetzen Sie die Verbindung durch einen neuen Chip.

Entfernen Sie den Stopfen vom Adapter des zyklonischen Sprühgeräts und setzen Sie den strömungsstabilisierten PDMS-Chip vorsichtig in den Adapter ein. Ändern Sie die Durchflussrate gemäß den empfohlenen Einstellungen und stabilisieren Sie den Durchfluss erneut für zwei bis fünf Minuten. Stellen Sie gleichzeitig die Durchflussraten aller Gase so ein, dass die maximale Signalintensität des interessierenden Analyten erreicht wird.

Stellen Sie außerdem die Plasmaleistung und die Fokussierlinsenspannung am Massenspektrometer so ein, dass die Signalintensität bei der Signaloptimierung weiter erhöht wird. Stellen Sie das Massenspektrometer auf eine Verweilzeit von 10 Millisekunden ein und beginnen Sie mit der Datenaufnahme. Übertragen Sie nach den Messungen die Rohdaten in ein Datenanalyseprogramm.

Bei einer typischen Datenanalyseroutine werden alle Messungen zunächst in Datenbins unterteilt, wobei jeder Bin die Anzahl der Zählereignisse pro 10 Millisekunden Verweilzeit darstellt. Anschließend wird ein Histogramm für alle Bins erstellt und mit einer Gauß-Verteilungsfunktion angepasst. Der Mittelwert und die Streuung der einzelnen Anpassungen repräsentieren die mittlere Signalintensität sowie die Standardabweichung bei einem bestimmten Massen-zu-Ladungs-Verhältnis. Um den Kalibrierungsprozess zu beginnen, messen Sie zunächst eine Standardlösung mit derselben Flussrate wie Ihre Probe.

Verwenden Sie den PDMS-Chip zur Tropfenbildung, richten Sie zwei Fünf-Milliliter-Spritzen für PFH und eine Ein-Milliliter-Spritze für die Standardlösung ein. Verwenden Sie dann eine Petrischale als Mikroskoppräparathalter, platzieren Sie den PDMS-Chip in der Petrischale und bringen Sie den Chip unter niedriger Vergrößerung in Fokus, wobei Sie die vorherigen Protokollschritte nachahmen. Stabilisieren Sie die Tropfenbildung innerhalb des PDMS-Mikrokanals für drei bis fünf Minuten mit einer Hochgeschwindigkeitskamera.

Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern der wässrigen Tropfen auf dem Chip an der sekundären Verbindung, um aus den Aufnahmen den durchschnittlichen Tropfendurchmesser zu ermitteln. Verwenden Sie eine Bildanalyse-Software mit einer dedizierten Suite für Tropfenmorphologie, Optometrie und Velo-Symmetrie. Unter der Annahme, dass sich jeder Tropfen als kugelförmiges Objekt modellieren lässt, kann das durchschnittliche Tropfenvolumen anhand des von der Software ermittelten durchschnittlichen Tropfendurchmessers geschätzt werden.

Als Nächstes teilen Sie die bekannte Analytkonzentration der Probe durch das durchschnittliche Tröpfchenvolumen, um die Masse des Analyten in einem Tröpfchen zu erhalten. Konvertieren Sie anschließend die resultierende Masse in die Anzahl der Atome. Berechnen Sie abschließend die gesamte Detektionseffizienz, indem Sie die Anzahl der gemessenen Ionen pro Tröpfchen durch das vorherige Ergebnis dividieren.

Diese Nachweisempfindlichkeit kann nun als Kalibriergröße verwendet werden, um die Anzahl der Atome in einer unbekannten Probe zu bestimmen. Mithilfe eines mikrofluidischen Tropfengenerators können einzelne Zellen in monodispersen wässrigen Tropfen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 50 Mikrometern eingeschlossen und mittels I-C-P-M-S analysiert werden. Die organische PFH-Hülle, die den wässrigen Tropfen umgibt, kann leicht entfernt werden, bevor die Probe den I-C-P-M-S-Detektor erreicht.

Bei der Messung von Lösungen zeigt sich die hohe Monodispersität der Tröpfchen als geringe Varianz zwischen Gruppen von Signalen, die entweder von einzelnen Doppel- oder Tripeltröpfchen innerhalb einer bestimmten Verweilzeit stammen. Nach entsprechender Kalibrierung kann der Eisengehalt eines Ensembles einzelner boviner roter Blutkörperchen, die jeweils in einzelnen Tröpfchen suspendiert sind, bestimmt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diese mikrofluidischen Chips zur quantitativen elementaren Analyse sehr kleiner Probenmengen oder einzelner Partikel und Zellen vorbereitet und verwendet.

Die Herstellung dieser Chips benötigt weniger als 15 Minuten, bezogen auf die manuelle Bearbeitungszeit pro Chip, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Zudem ermöglichen die leicht modifizierbaren Chips die Integration weiterer mikrofluidischer Module zur fortgeschrittenen Probenvorbehandlung sowie die gleichzeitige Zufuhr von Proben und Standards, um die Effizienz und Probendurchsatzrate zu verbessern.