Name: Schnelle enzymatische Prozessierung von Proteinen für MS-Detektion mit einem Durchfluss-Mikroreaktor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung eines Durchfluss-Mikroreaktors für die schnelle enzymatische Verdauung von Proteinen zur Massenspektrometrie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht eine effiziente Proteinidentifizierung.

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Diese Arbeit wurde durch NSF/DBI-1255991 Zuschuss an IML unterstützt.

1. Herstellung der Kapillarreaktor <ol><li> Schneiden die 100 &amp; mgr; m Innendurchmesser (ID) x 360 um Außendurchmesser (OD) Kapillare auf eine Länge von 7-8 cm, und die 20 &amp; mgr; m ID x 90 um OD Kapillare 3-5 cm mit der Glaskapillare Spalter; unter dem Mikroskop zu überprüfen, dass beide Kapillarenden eine saubere, gerade geschnitten haben, ohne vorstehende Grate. </li><li> Legen Sie die 20 &amp; mgr; m ID x 90 &amp; mgr; m OD Kapillare in ein Ende der 100 &amp; mgr; m ID x 360 &amp; mgr; m OD Kapillare, auf einer Länge von ca. 6 mm; im Bedarfsfall zu beachten, diese Operation unter dem Mikroskop. </li><li> Tragen Sie eine kleine Tröpfchen Kleber E6000 um die Kreuzung der 90 &amp; mgr; m OD / 100 &amp; mgr; m ID Kapillaren mit dem Ende eines Q-Tip, und lassen Sie den Leim Heilung O / N bei RT. </li><li> Schneiden die eingelegte 20 um ID x 90 um OD Kapillare auf eine Länge von ~ 10-15 mm; dies wird der Elektrospray-Ionisations-Emitter sein. </li><li> Vorgeschnittene die 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; OD PEEK und 1/16 &quot;OD PTFE Wanneing in Stücke von 4-5 cm in der Länge; diese werden die Hülsen in der Kapillar-Gewerkschaften verwendet werden, um eine leckfreie Verbindung bereitstellt. </li><li> Schließen Sie das andere Ende der 100 &amp; mgr; m ID x 360 &amp; mgr; m OD Kapillare zu einer PEEK Vereinigung; verwenden, um eine 1/32 &quot;PEEK Hülse für eine leckagefreie Verbindung bereitstellt. </li><li> Insert / ziehen ein Stück ~ 5 cm lange 1/16 &quot;PTFE-Schlauch in das entgegengesetzte Ende der Union. </li><li> Wiegen ca. 4 mg C18 (5 um) Teilchen in einer vorgereinigten / getrocknete 2 ml Glasphiole; 0,5 ml Isopropanol, schließen Sie die Aufschlämmung in dem Ultraschallgerät Bad das Fläschchen und zu verteilen. </li><li> Ziehen Sie mit einer 250 &amp; mgr; l-Spritze etwa 200 &amp; mgr; l Brei, legen Sie die Spritzennadel in den 1/16 &quot;PTFE-Schlauch der PEEK-Vereinigung, und verzichten Sie langsam den Schlamm in den 100 &amp; mgr; m ID x 360 &amp; mgr; m OD Kapillare, beobachten unter dem Mikroskop als die Kapillare füllt sich mit Teilchen bis zu einer Länge von 2-3 mm Verpackung erreicht wird, dies wird der Mikroreaktor (Abbildung 1) werden , um die 20 μ.m ID Kapillare behält die Partikel im Mikroreaktor durch eine Keystone - Effekt. 15 </li><li> Spülen Sie das Mikroreaktor mit ~ 50 &amp; mgr; l Lösung von H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, und dann mit ~ 50 &amp; mgr; l Lösung von H 2 O / CH 3 CN 98: 2 v / v. </li></ol> 2. Herstellung von Beispiellösungen Hinweis: Operationen, die aus organischen Lösungsmitteln und Säuren und Herstellung der Lösung beinhalten Handhabung sind in einem Abzug durchgeführt werden. Schutzbrille, Handschuhe und Schutzkleidung. <ol><li> Spülen mit CH 3 OH und trocknen einige Glasfläschchen (4 ml) und Polypropylenröhrchen (15 ml). </li><li> Herstellung von 10 ml einer Lösung von H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in einem 15 ml Polypropylenröhrchen durch Mischen von 9,8 ml H 2 O mit 200 &amp; mgr; l CH 3 CN; mischen durch Beschallung. </li><li> Herstellung von 10 ml einer Lösung von H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in einem 15 ml Polypropylenröhrchen durch Mischen von 5 ml H 2 &lt;/ sub&gt; O mit 5 ml CH 3 CN; mischen durch Beschallung. </li><li> Herstellung von 4 ml einer angesäuerten wässerigen Lösung (TFA 0,01% v / v) durch Zugabe von 4 &amp; mgr; l TFA (10%) auf 4 ml H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in einem 4 ml - Glasfläschchen; mischen durch Beschallung. </li><li> Herstellung von 4 ml einer angesäuerten organischen Lösung (TFA 0,01% v / v) durch Zugabe von 4 &amp; mgr; l TFA (10%) auf 4 ml H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in ein 4 - ml - Glasgefß; mischen durch Beschallung. </li><li> Man wiegt 16 mg NH 4 HCO 3 mit einer analytischen Mikrowaage in einem 4-ml-Glasampulle; 4 ml des H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) Lösung und zu dispergieren durch Beschallung; dies führt zu einer 50 mM Lösung von NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) in wässrigem Puffer. </li><li> Wiegen 5 mg eines Standard - Proteins (beispielsweise Rinderserumalbumin, Hämoglobin - α / β, Cytochrom C, Carboanhydrase, α-2-HS-Glycoprotein, etc.) mit einem analytischen Mikrowaage in einem 4 - ml - Glasampulle; 4 ml DI water und zerstreuen durch Beschallung; Dies führt in der Regel in einem hohen &amp; mgr; M-Ebene Konzentration Lösung. </li><li> Bereiten Sie 1 ml Proteinlösung (1-2 uM) durch die hohe uM-Level - Konzentration Lösung mit einem geeigneten Volumen von NH 4 HCO 3 (50 mM) wässrigen Puffer verdünnt; mischen durch Beschallung. </li><li> Bereiten Sie die Trypsin - Lösung (5 uM) durch Auflösen von 20 &amp; mgr; g - Sequenzierung-Grade - Trypsin in 170 &amp; mgr; l NH 4 HCO 3 (50 mM) wässrigen Puffer; zerstreuen durch Beschallung. </li></ol> 3. Versuchsaufbau Anmerkung: Die LTQ-MS-System mit einer modifizierten ESI-Quelle ausgestattet ist, der ein Haus gebaut XYZ-Stufe enthält, die verschiedenen Probeneingabe Ansätze des Massenspektrometers ermöglicht Schnittstelle. <ol><li> Trennen Sie das Kapillarreaktor aus der PEEK-Anschluss und eine Verbindung mit dem PEEK-T-Stück. </li><li> Legen Sie eine ~ 2 cm lange Pt-Draht in der Seiten Arm des PEEK-T; verwenden, um eine 1/32 &quot;PEEK Hülse für die Bereitstellung einerleckagefreie Verbindung und für die Pt-Draht isolierend. </li><li> Verbinden einer 50 um x 360 um ID OD (~ 0,5 m lang) Probenübertragungs Kapillare zu dem entgegengesetzten Ende des PEEK Tee; verwenden, um eine 1/32 &quot;PEEK Hülse für eine leckagefreie Verbindung bereitstellt. </li><li> Sichern Sie die PEEK-T-Stück auf der XYZ-Bühne und positionieren Sie den ESI Emitter ~ 2 mm entfernt von dem Massenspektrometer Einlasskapillare. </li><li> Schließen Sie den Pt-Draht an die ESI-Stromversorgungsquelle des Massenspektrometers. </li><li> Schließen Sie das andere Ende der Proben Transferkapillare auf die Edelstahl-Vereinigung; verwenden, um eine 1/16 &quot;PEEK Hülse für eine leckagefreie Verbindung bereitstellt. </li><li> Schließen Sie einen 4-5 cm langen 1/16 &quot;PTFE - Schlauch mit dem gegenüberliegenden Ende des Edelstahl Union und legen Sie die 250 &amp; mgr; l Spritzennadel in dem PTFE - Schlauch, biegen Sie an der Pumpe und stellen Sie die Durchflussrate auf den gewünschten Wert (zB 2 &amp; mgr; l / min). </li><li> Eingangs Tandem-MS-Datenerfassungsparameter in das Softwarepaket, das die MS-Gerät ein steuertals eine Methode Datei bereit Setup-d speichern Sie die Analyse für die Durchführung; für das LTQ-MS-System verwenden, um die abhängigen Analyseparameter folgende Daten: dynamische Ausschluss für 180 Sekunden mit Ausschluss Masse Breite ± 1,5 m / z freigegeben; ein MS um eine Zoom gefolgt Scan und MS 2 Scans auf den Top - 5 - intensivsten Peaks, Zoom Scanbreite von ± 5 m / z; stoßinduzierte Dissoziation (CID) auf Isolationsbreite eingestellt Parameter 3 m / z, normalisierten Kollisionsenergie von 35%, die Aktivierung Q 0,25 und Aktivierungszeit 30 ms. </li></ol> 4. Mikrofluidik-Setup <ol><li> Bereiten einer mikrofluidischen Vorrichtung aus Glas oder polymeren Substraten; 16-18 die Anordnung der Vorrichtung ist in Figur 2A, die aus einem Mikroreaktor (1) (0,13 mm Breite x 2 mm Länge x 50 um tief) , die mit einem Einlass (2 ), Auslass (3) und einer Seitenöffnung (4); die Verbindungskanäle für fluidische Manipulationen sind ~110 &amp; mgr; m breit und ca. 50 &amp; mgr; m tief; eine mehrkanalige Struktur (5), bestehend aus ~ 1,5-2 &amp; mgr; m tief x 10 um breit x 100 um lang platziert Mikrokanäle 25 &amp; mgr; m voneinander entfernt, als ein Filter wirken , werden die Partikel in den Mikroreaktor zum Halten. </li><li> Aktivieren Fluidabgabe Verbindungen zu dem Chip durch spezialisierte Verbinder mit den Einlassöffnungen Kleben oder durch ein polymeres Stand Konzeption , die Armaturen für Flüssigkeitsabgabe (2B) aufnimmt. 16 </li><li> Bereiten einer Aufschlämmung von Teilchen C18 (5 um), wie in Schritt 1.8; die Aufschlämmung auf den Mikroreaktor mit einer Spritze zu liefern unter Verwendung von 1/16 &quot;PTFE - Schlauch mit dem Chip - Seitenanschluß (4) verbunden, dichten den Port nach Partikelbeladung mit Epoxidkleber und Heilung für 1 h in einem Ofen bei 90 ºC 16. </li><li> Legen Sie eine Kapillare (20 &amp; mgr; m ID x 90 &amp; mgr; m Außendurchmesser x 10 mm Länge) in der Austrittsöffnung, Dichtung mit E6000 Leim und lassen Heilung O / N; dies wird der ESI Emitter werden ( <strong&gt; 6). </li><li> Schließen Sie eine 50 &amp; mgr; m ID x 360 &amp; mgr; m OD (~ 0,5 m lang) Probentransfer Kapillare mit dem Chip Einlassöffnung (2); das entgegengesetzte Ende der Kapillare verbinden, wie beschrieben in einen 250 &amp; mgr; l-Spritze und der Spritzenpumpe, in 3,6-3,7. </li><li> Legen Sie eine leichte PEEK T - Anschluss auf der Probenübertragungsleitung kurz vor dem Einlassöffnung (2) und legen Sie eine Pt - Draht auf der Seite-Arm des T, wie in 3.2 beschrieben; dies wird die ESI-Elektrode sein. </li><li> Sichern Sie die Mikrofluidik-Vorrichtung auf der XYZ-Bühne mit dem ESI-Emitter positioniert ~ 2 mm entfernt von dem Massenspektrometer Einlasskapillare; die MS für die Analyse vorzubereiten, wie in 3.8 beschrieben. </li></ol> 5. Probe Beladen, proteolytischen Abbau und Elution für MS-Analyse Anmerkung: Alle Lösung / sample Transferschritte werden mit Hilfe einer Spritzenpumpe durchgeführt, und sollte für einige weitere Minuten ermöglichen abzuschließen, für die Toten-Volum zu kompensierenes mit den Übertragungsleitungen verbunden sind und von dem Mikroreaktor; die notwendige Zeit hängt von den Strömungsgeschwindigkeiten abhängig beteiligt. <ol><li> Spülen Sie das Mikroreaktor und bereiten sie für die Analyse durch eine wässrige Lösung von NH 4 HCO 3 Infundieren (50 mM) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) bei 2 &amp; mgr; l / min für 5 min; verwenden, um eine 250 &amp; mgr; l-Spritze. </li><li> Laden Sie die Proteinprobe (1 &amp; mgr; M) auf dem Mikroreaktor durch Infundieren der Probenlösung bei 2 ul / min für 5 min; verwenden, um eine 250 &amp; mgr; l-Spritze. </li><li> die Trypsin-Lösung (5 &amp; mgr; M) über das adsorbierte Protein auf der Mikroreaktor bei 2 ul / min für 1-3 min ziehen lassen. </li><li> Quenche die proteolytische Verdauung durch den Mikroreaktor mit einer angesäuerten wässrigen Lösung von TFA Spülen (0,01% v / v) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) bei 2 &amp; mgr; l / min für 5 min; verwenden, um eine 250 &amp; mgr; l-Spritze. </li><li> Starten Sie das Protein unter Elution aus dem Mikroreaktor verdauen durch eine angesäuerte organische Lösung von TFA Infusion (0,01%v / v) in H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) bei 300 nl / min. </li><li> Schalten Sie den MS-Daten-Erfassungsprozesses und der ESI-Spannung (~ 2000 V); erwerben MS-Daten die Datenerfassungsparameter zur Verfügung gestellt in Schritt 3.8 verwendet wird; Die Elution der tryptischen Peptide beobachten. </li></ol> 6. Datenverarbeitung <ol><li> Verarbeiten Sie die Tandem-MS-Daten mit einer Suchmaschine kompatibel mit dem rohen MS-Datenformat. <ol><li> Verarbeiten Sie die LTQ-MS Raw-Dateien einen Organismus spezifischen minimal redundanten Proteindatenbank verwendet wird; laden die Rohdaten in der Suchmaschine, stellen Sie die Eltern und Fragmentionenmassentoleranzen zu 2 und 1 Da jeweils nur voll tryptischen Fragmente verwenden, um mit bis zu zwei für die Suche verpasst cleavages; nicht für posttranslationale Modifikationen ermöglichen; stellen Sie die oberen und mittleren Vertrauen False Discovery Rate (FDR) bis 1% und 3%, bzw., und erlauben keine posttranslationalen Modifikationen. </li></ol></li><li> Filtern Sie die Daten nur hoch Vertrauen zu wählenPeptid entspricht den Proteinen in der Datenbank; bewerten die Protein- und Peptid-Level-Ergebnisse. </li></ol>

<ol><li>Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetersen%2C+DH+%22Encyclopedia+of+Microfluidics+and+Nanofluidics%22">Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics</a>. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).</li>
<li>Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+applications+of+immobilized+microfluidic+enzymatic+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+enzymatic+reactors+for+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic enzymatic reactors for proteome research.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).</li>
<li>Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping%3A+strategy%2C+characterization%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22LabChip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance.</a> LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).</li>
<li>Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchip-based+proteolytic+digestion+system+driven+by+electroosmotic+pumping%5BTitle%5D)+AND+%22LabChip%22%5BJournal%5D)">A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping.</a> LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-immobilized+microfluidic+process+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Enzyme-immobilized microfluidic process reactors.</a> Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).</li>
<li>Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).</li>
<li>Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+microfluidic+enzyme+reactor+utilizing+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads.</a> Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).</li>
<li>Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle+assembly+microfluidic+reactor+for+efficient+on-line+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).</li>
<li>Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titania+and+alumina+sol-gel-derived+microfluidics+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping%3A+design%2C+characterization%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance.</a> J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).</li>
<li>Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+protein+digestion+through+the+confinement+of+nanozeolite-assembled+microchip+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors.</a> Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).</li>
<li>Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+enzyme+reactor+and+high+resolving+chromatography+in+%26%2334%3Bsub-chip%26%2334%3B+dimensions+for+sensitive+protein+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in &#34;sub-chip&#34; dimensions for sensitive protein mass spectrometry.</a> Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).</li>
<li>Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-enhanced+enzyme+reaction+for+protein+mapping+by+mass+spectrometry%3A+A+new+approach+to+protein+digestion+in+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes.</a> Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).</li>
<li>Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-assisted+sample+preparation+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis.</a> Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).</li>
<li>Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tapers+and+restrictors+for+capillary+electrochromatography+and+capillary+electrochromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).</li>
<li>Lazar, I. M., Kabulski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+LC+Device+with+Orthogonal+Sample+Extraction+for+On-Chip+MALDI-MS+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection.</a> Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).</li>
<li>Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+and+sample+injection+systems+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip.</a> Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).</li>
<li>Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Injection+Schemes+and+Column+Geometry+on+the+Performance+of+Microchip+Electrophoresis+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices.</a> Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).</li>
<li>Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Proteomic+Protocol+for+Biomarker+Fingerprinting+in+Cancerous+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).</li>
<li>Doucette, A., Craft, D., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometric+Study+of+the+Effects+of+Hydrophobic+Surface+Chemistry+and+Morphology+on+the+Digestion+of+Surface-Bound+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).</li>
<li>Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Liquid+Chromatography+System+for+Proteomic+Applications+and+Biomarker+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening.</a> Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).</li>
<li>Lazar, I. M., Karger, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Open-Channel+Electroosmotic+Pumping+System+for+Microfluidic+Sample+Handling%2C%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,&#34.</a> Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).</li>
<li>Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+TOFMS+Detection+for+Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis.</a> Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).</li>
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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Der Mikroreaktor in dieser Arbeit beschriebenen bietet eine einfach zu implementierende Versuchsaufbau zur Durchführung einer enzymatischen Verdauung der Proteine ​​MS-Analyse und Identifizierung in weniger als 30 min zu ermöglichen. Die klaren Vorteile dieses Systems im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen, sind Einfachheit, Geschwindigkeit, niedrige Reagenzienverbrauch und niedrige Kosten. Insbesondere gibt es keine Notwendigkeit für teure immobilisiertem Trypsin Perlen und Patronen. Die Herstellung der Kapillarreaktor...

Die Identifizierung und Charakterisierung der gereinigten Proteine ​​wird unter Verwendung von MS-Techniken häufig erreicht. Das Protein wird mit einem Enzym verdaut und die Peptide werden weiter durch MS analysiert, indem eine einfache Infusionsversuchsaufbau verwendet. Proteolytische Verdauung ist zur Erzeugung von kleinen Peptidfragmente notwendig, die in der nützlichen Massenbereich von den meisten MS-Analysatoren fallen, und das kann leicht durch geringe Energiestoßinduzierte Dissoziation fragmentiert werden, um Aminosäuresequenzinformation zu erzeugen. Für isolierte Proteine ​​oder Proteingemische einfache, gibt es keine weitere Notwendigkeit für die chromatographische Trennung von Peptiden vor der MS-Detektion. Eine Mischung aus 25-50 Peptide können leicht durch Infundieren der Probe mit einer Spritzenpumpe in den MS-Ionenquelle direkt analysiert werden. Das Massenspektrometer kann die Analyse durchzuführen und die Sequenz eines Proteins innerhalb einer kurzen Zeitrahmen zu bestätigen. Bei modernen Datenerfassungsverfahren kann dieses Verfahren durchgeführt werden wnnerhalb ein paar Minuten oder sogar Sekunden. Der begrenzende Faktor des gesamten Prozesses in Vollendung auf einer kurzen Zeitskala ist die proteolytischen Verdauungsschritt. Normalerweise ist dies ein paar Stunden (oder O / N) durchgeführt über, in Lösung, bei 37 ° C, unter Verwendung von Substrat: Enzym-Verhältnisse von (50-100): 1. Um die enzymatische Digestionszeit auf Minuten oder Sekunden, immobilisierte Enzym Mikroreaktoren, in Form von Mikrofluidik - Reaktoren oder handelsüblichen Kartuschen zu verringern, sind beschrieben worden. 1-6 Typischerweise wird das Enzym durch kovalente, nicht-kovalente / physikalische Adsorption, Komplex immobilisiert 3,6 die verbesserte Effizienz des enzymatischen Verfahrens durch die große Oberfläche-zu-Volumen und Enzym-zu-Substrat - Verhältnisse Bildung oder Verkapselung, aktiviert zu werden. Weitere Vorteile von immobilisierten Reaktoren sind ua Autolyse und Störungen durch das Enzym in MS-Analyse reduziert, Enzymstabilität und Wiederverwertbarkeit verbessert. Eine Vielzahl von Ansätzen unter Verwendung von Glas- oder Polymer mikrofabrizierten Vorrichtungen beschrieben worden sind,Enzyme immobilisiert auf magnetischen Kügelchen durch Antikörper-Antigen - Wechselwirkungen unter Verwendung 7,8 in Gold - Nanopartikel Netzwerke eingeschlossen, 9 in Titandioxid-Aluminiumoxid - Sol-Gele 10 und nanozeolites verkapselt, 11 oder gefangen durch Ni-NTA oder His-Tag - Komplexbildung. 6 Alternativ ebenso wurden 12 Darüber hinaus hat gezeigt , verbesserte proteolytischen Spaltung wurde, offenen Rohr Kapillaren mit immobilisierten Enzymen entwickelt., unter Verwendung von gesteuerten Mikrowellenbestrahlung 13 oder druckunterstützten oder Druckzyklisierung Technologie (PCT) zur Verringerung der Reaktionszeiten auf 30-120 min. 14 Trotz der vielen Vorteile von immobilisierten Enzymreaktoren, die die Kosten der kommerziellen Patronen hoch ist, die Verfügbarkeit von Mikrofluidik-Vorrichtungen für die Routineanwendung ist begrenzt, und die Verwendung von Mikrowellen- oder PCT Technologien führt Notwendigkeit zusätzlicher Instrumentierung. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein Verfahren zu entwickeln, die circumvezur Durchführung einer enzymatischen Spaltung von Proteinen in der Vorbereitung für MS-Analyse innerhalb von Minuten ngen diese Nachteile, und das kann leicht in jedem Labor durchgeführt werden Forscher mit einem einfachen und effektiven Ansatz zu stärken. Der Ansatz beruht auf der Verwendung von hydrophoben, C18-Teilchen, die in einer Kapillare oder mikrofluidische Vorrichtung vorbelastet sind, und die Adsorption des Protein (e) von Interesse auf den Teilchen durch enzymatischen Verdau während der Infusion des Enzyms über den gefolgten gepackte Bett und nahm Protein (e). In diesem Ansatz wird das Substrat durch nicht-kovalente Wechselwirkungen immobilisiert sind, und das Enzym wird über das immobilisierte Protein infundiert. Die proteolytische Verdauung Effizienz wird durch die große Partikeloberfläche Bereichen erhöht, die das Protein für die enzymatische Verarbeitung, reduzierte Abstände und Diffusionszeiten zu und von der Oberfläche der Teilchen, verbesserte Massenübertragung, keine kovalente Bindung belichten, die die Aktivität des Enzyms beeinflussen können, die Fähigkeit, schnell evaluate Kombinationen verschiedener Enzyme, Entsorgbarkeit und Multiplexen, wenn das Verfahren in einem mikrofluidischen Format ausgeführt. Dieser Ansatz wird unter Verwendung einer Mischung von Standardproteinen und Trypsin-das am häufigsten verwendete Enzym für proteolytischen Verdau vor der ESI-MS-Detektion nachgewiesen. Das Massenspektrometer zur Detektion in dieser Studie verwendet wurde, war eine lineare Quadrupol-Falle (LTQ) -Instrument.

<table><tbody><tr><td>Ionenfalle ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>Das LTQ-Massenspektrometer wird zur Erfassung von Tandem-MS-Daten</td></tr><tr><td>XYZ-Tisch</td><td>Newport</td><td>Mehrere Teile</td><td>verwendet Der selbstgebaute XYZ-Tisch wird verwendet, um die kommerzielle LTQ-Nano-ESI-Quelle so anzupassen, dass sie Eingaben von verschiedenen Probenabgabesystemen empfängt</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Edmund-Optik</td><td>G81-278</td><td>Das Mikroskop wird verwendet, um den Packungsprozess des Mikroreaktors zu beobachten</td></tr><tr><td>Analysenwaage/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>Die Waage wird zum Wiegen der Proteinproben verwendet</td></tr><tr><td>Ultraschallbad/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>Das Schallbad wird zum Mischen/Homogenisieren der Proben und zum Dispergieren der C18-Partikelaufschlämmung verwendet</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe 22</td><td>Harvard Apparatus 552222</td><td></td><td>Die Mikropumpe wird zum Laden, Spülen und Eluieren der Probe und des Enzyms auf und aus dem gepackten Kapillarmikroreaktor verwendet</td></tr><tr><td>Milli-Q Reinstwassersystem</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&nbsp;</td><td>Das MilliQ Wassersystem wird zur Aufbereitung von gereinigtem DI-Wasser verwendet</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1.000&nbsp; &Mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>Der Pipettierer dient zur Messung kleiner Volumina von Probenlösungen</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&nbsp; &Mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>Der Pipettierer dient zur Messung kleiner Volumina von Probenlösungen</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp; &Mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>Der Pipettierer wird zur Messung kleiner Volumina von Probenlösungen</td></tr> verwendet: <tr><td>Quarzglaskapillare (100 & Mikro; m ID x 360 &Mikro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>Diese Kapillare wird für die Herstellung der</td>Mikroreaktor-Quarzglaskapillare</tr><tr><td>(20&nbsp; &Mikro; m ID x 100 &Mikro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>Diese Kapillare wird für die Herstellung der ESI-Emitter-Quarzglaskapillare</td></tr><tr><td>(50&nbsp; &Mikro; m ID x 360 &Mikro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>Diese Kapillare wird verwendet, um die Proben und das Eluent von der Spritzenpumpe in den Kapillarmikroreaktor zu übertragen</td></tr><tr><td>Glaskapillar-Cleaver</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>Dies ist ein Werkzeug zum Schneiden von Quarzglaskapillaren auf die gewünschte Länge</td></tr><tr><td>Kleber</td><td>Eclectic Products</td><td>E6000 Craft</td><td>Dieser Kleber wird verwendet, um den ESI-Strahler im Kapillarmikroreaktor oder im Mikrofluidik-Chip zu befestigen</td></tr><tr><td>Epoxidkleber</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>Dieser Kleber wird verwendet, um das mikrofluidische Einlassloch abzudichten, durch das die C18-Partikel geladen werden</td></tr><tr><td>Umkehrphasen-C18-Partikel (5&nbsp; &Mikro; m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>Hierbei handelt es sich um C18-Partikel, an denen die Proteine adsorbiert werden; die Partikel wurden aus einem 4&nbsp; mm x 20 cm C18 LC Säule aus Agilent</td></tr><tr><td>Spritze/Glas (250 & micro; l)</td><td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>Die Glasspritzen werden verwendet, um die C18-Partikelaufschlämmung in den Kapillarmikroreaktor zu laden und die Probe und die Eluenten in den Mikroreaktor zu befördern</td></tr><tr><td>Interne reduzierende PEEK-Union (1/16" bis 1/32")</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>Diese Verbindung wird verwendet, um die 250 & micro; l Spritze in den Mikroreaktor zum Laden des 5 & micro; m Partikelaufschlämmung</td></tr><tr><td>Verschraubung aus rostfreiem Stahl (1/16")</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>Die Edelstahlverbindung wird verwendet, um die Glasspritzennadel mit der Infusionskapillare</td></tr><tr><td>zu verbinden Mikrovolumen-PEEK-T-Anschluss (1/32")</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>Das Peek-T-Stück wird verwendet, um die Probentransferkapillare mit dem Kapillarmikroreaktor zu verbinden. An seinem Seitenarm ermöglicht es das Einsetzen des Pt-Draht-T-Steckers</td></tr><tr><td>(geringes Gewicht)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>Dieser T-Steckverbinder wird verwendet, um ESI-Spannung an den Mikrofluidik-Chip über die Probentransferleitung</td></tr><tr><td>Pt-Draht (0,404 mm) anzulegenVWR</td><td></td> <td>66260-126</td><td>Der Pt-Draht dient als elektrischer Anschluss für die ESI-Erzeugung und wird mit dem Massenspektrometer ESI-Stromversorgung</td></tr><tr><td>, PTFE-Schlauch (1/16") verbunden OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>Der Teflonschlauch wird verwendet, um eine luftdichte Verbindung zwischen der Spritzennadel und der Edelstahlverbindung zu ermöglichen&nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK-Schlauch (0,015" Innendurchmesser x 1/16" OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>Der Peek-Schlauch wird als Hülse verwendet, um eine luftdichte Verbindung zwischen der Edelstahlverbindung und dem 50&nbsp; &Mikro; m ID Transfer</td></tr><tr><td>Kapillar-PEEK-Schlauch (0,015" Innendurchmesser x 1/32" OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>Der Peek-Schlauch wird als Hülse verwendet, um eine leckagefreie Verbindung zwischen den Quarzglaskapillaren und dem Peek Tee</td></tr><tr><td>zu ermöglichen Sauberer Polymer-Schlauchschneider</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>Dieser Schneider wird zum Vorschneiden des 1/16" und 1/32" verwendet. Peek-Polymerschlauch, der als Hülse für leckagefreie Verbindungen in Stücken von ~4-5 cm Länge verwendet wird</td></tr><tr><td>Braunes Fläschchen (2 ml)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>Die Fläschchen werden zur Herstellung von Probenlösungen und der C18-Partikelaufschlämmung verwendet.</td></tr><tr><td>Braunes Fläschchen (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>Die Fläschchen werden zur Herstellung von Probenlösungen verwendet</td></tr><tr><td>Polypropylen-Röhrchen (15&nbsp; ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>Die Fläschchen werden zur Herstellung von Pufferlösungen verwendet</td></tr><tr><td>Zylinder (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>Der Zylinder dient zur Messung des Lösungsmittelvolumens</td></tr><tr><td>Zylinder (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>Der Zylinder wird zur Messung des Volumens von Lösungsmitteln verwendet</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (1.000 & Mikro; l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>Die Pipettenspitzen werden zur Messung kleiner Probenmengen verwendet</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (100 & Mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>Die Pipettenspitzen werden zur Messung kleiner Volumina von Probenlösungen verwendet</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (10 & Mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>Die Pipettenspitzen werden zur Messung kleiner Probenmengen verwendet Lösungen</td></tr><tr><td>Glassubstrate</td><td>Nanofilm</td><td>B270 weiße Krone, 3" x 3"</td><td>Dabei handelt es sich um Glassubstrate für die Herstellung von Mikrochips</td></tr><tr><td>Verschraubung mit Außengewinde (1/16")</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>Diese Armatur wird für die Verbindung von Transferkapillaren mit dem Mikrofluidik-Chip</td></tr><tr><td>verwendet Nanoport-Baugruppe</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>Diese Armatur wird für die Verbindung von Transferkapillaren mit dem Mikrofluidik-Chip verwendet</td></tr><tr><td>Proteinstandards</td><td>Sigma</td><td>Multiple #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, HPLC-Qualität</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, HPLC-Qualität</td><td>Fisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, HPLC-Qualität</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, Sequenzierqualität</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle enzymatische prozessierung von proteinen für ms-detektion mit einem durchfluss-mikroreaktor

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Die überwiegende Mehrheit der Massenspektrometrie (MS) -Basis Proteinanalyseverfahren beinhalten ein enzymatisches Verdauungsschritt der Detektion vor, typischerweise mit Trypsin. Dieser Schritt ist für die Erzeugung von niedermolekularen Peptide erforderlich, in der Regel mit MW &lt;3000-4000 Da, die innerhalb des effektiven Scan-Bereich der Massenspektrometrie Instrumentierung fallen. Herkömmliche Protokolle beinhalten O / N enzymatische Verdauung bei 37 ºC. Jüngste Fortschritte haben zu der Entwicklung einer Vielzahl von Strategien geführt, in der Regel die Verwendung eines Mikroreaktor mit immobilisierten Enzymen oder aus einer Reihe von komplementären physikalischen Prozessen beteiligt, die die Zeit , die für proteolytischen Verdau zu einigen Minuten (beispielsweise Mikrowellen- oder Hoch reduzieren Druck). In dieser Arbeit beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Lösung, die in einem Labor für die Erreichung schnelle enzymatische Verdauung eines Proteins umgesetzt werden können. Das Protein (oder Proteingemisch) adsorbiert an C18-gebundene Umkehrphasen-Hochleistungormance Flüssigchromatographie (HPLC) Siliciumdioxidteilchen in einer Kapillarsäule vorgespannt, und Trypsin in wässrigem Puffer wird für eine kurze Zeit über die Teilchen infundiert. Zu ermöglichen Online-MS-Detektion, die tryptischen Peptide werden mit einem Lösungsmittelsystem mit einem erhöhten Gehalt an organischen Stoffen direkt in der MS-Ionenquelle eluiert. Dieser Ansatz vermeidet die Verwendung von hochpreisigen immobilisiertem Enzympartikel und erforderlich macht keine Hilfe für den Prozess abzuschließen. Protein Verdauung und vollständige Probenanalyse kann in weniger als ~ 3 min und ca. 30 min bzw. erreicht werden.

Ein repräsentatives Ergebnis eines proteolytischen Verdauungsprozess gleichzeitig durchgeführt auf einer Mischung von Proteinen, mit den oben beschriebenen Mikroreaktoren (Figuren 1 oder 2) ist in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt. Die Tabelle , die die einzigartigen Peptidsequenzen umfasst, die ein bestimmtes Protein zu identifizieren, wobei der Quer Korrelation Score (Xcorr) (dh eine Punktzahl, die für die entsprechenden Tandem - Massenspektrum...

Ein schnelles Protokoll für den proteolytischen Aufschluss mit einem hausgemachten Durchfluss-Tryptik-Mikroreaktor, der mit einem Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometer (ESI) gekoppelt ist, wird vorgestellt. Die Herstellung des Mikroreaktors, der Versuchsaufbau und der Datenerfassungsprozess werden beschrieben.

Schnelle enzymatische Prozessierung von Proteinen für MS-Detektion mit einem Durchfluss-Mikroreaktor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Herstellung eines durchflussbasierten tryptischen Mikroreaktors zu beschreiben, der eine schnelle enzymatische Verdauung von Proteinen ermöglicht und somit die Identifizierung von Proteinen mittels Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometer erlaubt. Die Methode kann dazu beitragen, die Aminosäuresequenz isolierter und gereinigter Proteine aufzuzeigen, um die nachgeschaltete Charakterisierung von Struktur und Funktion zu unterstützen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es schnell, kostengünstig und gut in Workflows integrierbar ist, die mikrofabrizierte Plattformen nutzen.Beginnen Sie damit, mit einem Glas-Kapillarschneider die größere Glas-Kapillare auf eine Länge von sieben bis acht Zentimetern und die kleinere auf eine Länge von drei bis fünf Zentimetern zu schneiden. Überprüfen Sie mithilfe eines Mikroskops, ob beide Kapillarenden sauber und gerade geschnitten sind und keine abstehenden Grate aufweisen. Führen Sie die kleinere Kapillare etwa sechs Millimeter in eines der Enden der größeren Kapillare ein.Verwenden Sie anschließend einen Wattestäbchen, um einen kleinen Tropfen Klebstoff am Übergang der Kapillaren anzubringen, und lassen Sie den Klebstoff über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Schneiden Sie danach die eingefügte Kapillare auf eine Länge von etwa 10 bis 15 Millimetern zu. Dieses Ende dient als Elektrospray-Ionisations-Emittierer.Stecken Sie das gegenüberliegende Ende der Kapillare mit größerem Durchmesser in ein 1/32-Zoll-PEEK-Röhrchen, das zuvor auf eine Länge zwischen vier und fünf Zentimetern zugeschnitten wurde, und verbinden Sie es mit einem PEEK-Verbinder. Danach wird das fünf Zentimeter lange Stück 1/16-PTFE-Schlauch in das gegenüberliegende Ende des Verbinders eingesetzt und festgedreht. In einer sauberen, trockenen 2-ml-Glasküvette wiegen Sie 4 Milligramm C18-Partikel ab und geben anschließend 0,5 Milliliter Isopropanol hinzu.Schließen Sie das Gefäß. Geben Sie es in ein Ultraschallbad und setzen Sie Ultraschall ein, um die Teilchen gleichmäßig in der Lösung zu verteilen. Anschließend pipettieren Sie mit einer 250-Mikroliter-Spritze 200 Mikroliter der C18-Suspension auf.Setzen Sie die Spritze in das 1/16-Zoll-PTFE-Schläuchchen ein und geben Sie die Suspension langsam in die große Kapillare ab. Beobachten Sie unter dem Mikroskop, wie sich die Kapillare mit Partikeln füllt, bis eine Partikelschüttung von zwei bis drei Millimetern erreicht ist. Das kleinere Kapillarrohr hält diese Partikel im Mikroreaktor durch einen Keil-Effekt zurück.Schließlich spülen Sie den Mikroreaktor mit 50 Mikrolitern einer 50:50-Lösung aus Wasser und Acetonitril, gefolgt von 50 Mikrolitern einer Lösung, die 49 Mikroliter Wasser und einen Mikroliter Acetonitril enthält. Trennen Sie den kapillaren Mikroreaktor von der PEEK-Verbindung und schließen Sie ihn an ein PEEK-T-Stück an. Führen Sie dann einen zwei Zentimeter langen Platin-Draht, der mit einer 1/32-Zoll-PEEK-Hülle isoliert ist, zur verlustfreien Verbindung in den Seitenarm des PEEK-T-Stücks ein.Schließen Sie eine halb Meter lange Probentransferkapillare an das gegenüberliegende Ende des PEEK-T-Stücks an. Verwenden Sie eine PEEK-Hülse mit 1/32-Zoll, um eine dichte Verbindung herzustellen. Befestigen Sie das PEEK-T-Stück auf der XYZ-Bühne.Positionieren Sie den Elektrospray-Ionisations-Emittor etwa zwei Millimeter entfernt von der Kapillareinlassöffnung des Massenspektrometers. Schließen Sie dann den Platin-Draht an die Elektrospray-Ionisations-Stromversorgung des Massenspektrometers an. Verbinden Sie außerdem das gegenüberliegende Ende der Probenübertragungskapillare mit der Edelstahl-Verbindung, wobei eine 1/16-Zoll-PEEK-Hülse verwendet wird, um eine dichte Verbindung sicherzustellen.Verbinden Sie anschließend ein vier bis fünf Zentimeter langes Stück PTFE-Schlauch mit einem Durchmesser von 1/16 Zoll mit dem gegenüberliegenden Ende der Edelstahl-Verbindung. Geben Sie die Parameter für die Datenakquisition des Tandem-Massenspektrometers gemäß dem begleitenden Textprotokoll in die Software ein, die das MS-Gerät steuert. Speichern Sie diese als Methodendatei, um die Einrichtung für die Durchführung der Analyse vorzubereiten.Das LTQ-MS-System ist mit einer modifizierten ESI-Quelle ausgestattet, die eine selbstgebaute XYZ-Bühne enthält, wodurch die Kopplung des Massenspektrometers an verschiedene Probeneingabeverfahren ermöglicht wird. Befüllen Sie eine 250-Mikroliter-Spritze mit einer wässrigen Lösung von 50 Millimolar Bicarbonat, gelöst in 2 % Acetonitril. Anschließend verbinden Sie die Spritze mit dem Mikroreaktor und platzieren Sie diese unter der Spritzenpumpe.Spülen Sie den Mikroreaktor mit zwei Mikrolitern pro Minute fünf Minuten lang, um ihn für die Analyse vorzubereiten. Laden Sie danach die Proteinprobe der Untersuchung in eine 250-Mikroliter-Spritze und infundieren Sie die Probenlösung mit zwei Mikrolitern pro Minute über einen Zeitraum von fünf Minuten. Anschließend setzen Sie eine 250-Mikroliter-Spritze, die mit einer fünf Mikromolar Trypsin-Lösung gefüllt ist, unter die Spritzenpumpe und infundieren sie über das gebundene Protein auf dem Mikroreaktor mit zwei Mikrolitern pro Minute für eine bis drei Minuten. Es ist entscheidend, dass man die Trypsinlösung vor jedem Experiment frisch auftaut und zubereitet. Dies gewährleistet, dass das proteolytische Enzym seine Aktivität sowie den Betriebs-pH-Wert des Mikroreaktors, der bei etwa 8 liegt, beibehält. Befüllen Sie eine weitere 250-Mikroliter-Spritze mit einer wässrigen Lösung, die aus 0,1 % Trifluoressigsäure in 2 % Acetonitril besteht.Verwenden Sie diese Lösung, um den proteolytischen Verdauungsprozess durch Spülen des Mikroreaktors mit zwei Mikrolitern pro Minute über fünf Minuten zu stoppen. Danach wechseln Sie zu einer Spritze, die mit 01% Trifluoressigsäure in 50% Acetonitril gefüllt ist, und schalten den MS-Datenerfassungsprozess bei der Elektrospray-Ionisation auf etwa 2000 Volt ein. Verwenden Sie die angesäuerte Lösung, um das Proteinverdauungsprodukt mit 300 Nanolitern pro Minute über einen Zeitraum von 20 bis 30 Minuten aus dem Mikroreaktor zu eluieren.Erfassen Sie die Massenspektrometriedaten mithilfe der in der begleitenden Textanleitung angegebenen Aufnahmeparameter. Verarbeiten Sie die rohen LTQ-MS-Dateien unter Verwendung einer minimal redundanten Protein-Datenbank, indem Sie zunächst die Rohdaten in die Suchmaschine hochladen. Stellen Sie anschließend die Massentoleranzen für Vorläufer- und Fragmentionen auf zwei bzw. einen Dalton ein und verwenden Sie für die Suche ausschließlich vollständig tryptische Fragmente mit bis zu zwei übersehenen Spaltungen.Stellen Sie außerdem die Falsch-Entdeckungs-Raten für hohe und mittlere Vertrauenswürdigkeit auf 1 % bzw. 3 % ein und erlauben Sie keine posttranslationalen Modifikationen, es sei denn, gezielt nach bestimmten Modifikationen gesucht wird. Filtern Sie abschließend die Daten, um nur die Peptidübereinstimmungen mit hoher Vertrauenswürdigkeit auszuwählen. Gezeigt ist hier ein Massenspektrum, das aus tryptischen Peptiden besteht und aus einem Proteingemisch erzeugt wurde, das einer Proteolyse im Mikroreaktor unterzogen wurde.Diese Markierungen repräsentieren die intensivsten tryptischen Peptidionen und geben deren Sequenz sowie die entsprechende Proteinidentifikationsnummer an. Dieser Mikroreaktor ermöglicht einen einfach zu realisierenden experimentellen Aufbau zur Durchführung der enzymatischen Verdauung von Proteinen und erlaubt eine Massenanalyse und Identifizierung in weniger als 30 Minuten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Sauberkeit der Gefäße und der Geräte, die mit den Lösungen in Kontakt kommen, entscheidend ist, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden.Nach dieser Methode können andere Verfahren zur Datenerfassung mittels Massenspektrometrie eingesetzt werden, um eine genauere Charakterisierung der generierten Peptide zu ermöglichen und zusätzliche Fragestellungen bezüglich der Proteinstruktur zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im Bereich der Proteomik den Weg, schnellere Protokolle zur Analyse von Proteinen zu entwickeln und die Erschließung neuartiger mikrofluidischer Plattformen voranzutreiben, die die hochdurchsatzfähige Untersuchung biologischer Proben ermöglichen. Diese Technik ist auf die Analyse relativ einfacher Proteinmischungen beschränkt, die 25 bis 50 Peptide erzeugen.Diese Peptide können durch einfache Infusionsversuche analysiert werden und erfordern keine chromatographische Trennung vor der MS-Analyse. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Vermeiden offener Flammen, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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