Schnelle enzymatische Prozessierung von Proteinen für MS-Detektion mit einem Durchfluss-Mikroreaktor

Ein schnelles Protokoll für den proteolytischen Aufschluss mit einem hausgemachten Durchfluss-Tryptik-Mikroreaktor, der mit einem Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometer (ESI) gekoppelt ist, wird vorgestellt. Die Herstellung des Mikroreaktors, der Versuchsaufbau und der Datenerfassungsprozess werden beschrieben.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Herstellung eines Durchfluss-tryptischen Mikronektors zu beschreiben, der einen schnellen enzymatischen Verdau von Proteinen durchführt, um die Proteinidentifizierung mit einem Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometer zu ermöglichen. Die Methode kann helfen, die Aminosäuresequenz von isolierten und gereinigten Proteinen zu veranschaulichen, um die nachgelagerte Charakterisierung von Struktur und Funktion zu unterstützen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es schnell, kostengünstig und anfällig für die Integration in Workflows ist, die mikrofabrizierte Plattformen verwenden.

Schneiden Sie zunächst mit einem Glaskapillarspalter das größere Glaskapillarrohr auf eine Länge von sieben bis acht Zentimetern und das kleinere auf eine Länge von drei bis fünf Zentimetern. Überprüfen Sie mit einem Mikroskop, ob beide Kapillarenden einen sauberen, geraden Schnitt ohne hervorstehende Grate haben. Führen Sie die kleinere Kapillare etwa sechs Millimeter in das eine Ende der größeren ein.

Trage dann mit einem Wattestäbchen ein kleines Tröpfchen Kleber um die Verbindungsstelle der Kapillaren auf und lasse den Kleber über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Schneiden Sie anschließend die eingesetzte Kapillare auf eine Länge von etwa 10 bis 15 Millimetern ab. Dieses Ende fungiert als Elektrospray-Ionisationsstrahler.

Führen Sie das gegenüberliegende Ende der Kapillare mit größerem Durchmesser in ein 1/32-Zoll-PEEK-Rohr ein, das zwischen vier und fünf Zentimetern Länge vorgeschnitten und mit einer PEEK-Verbindung verbunden wurde. Führen Sie dann das fünf Zentimeter lange Stück 1/16 PTFE-Schlauch in das gegenüberliegende Ende der Verschraubung ein und ziehen Sie es fest. Wiegen Sie in einer sauberen, trockenen Zwei-Milliliter-Glasfeile vier Milligramm C18-Partikel ab und fügen Sie dann 0,5 Milliliter Isopropanol hinzu.

Schließen Sie die Durchstechflasche. Legen Sie es in ein Ultraschallbad und beschallen Sie, um die Partikel gleichmäßig in der Lösung zu verteilen. Verwenden Sie anschließend eine 250-Mikroliter-Spritze, um 200 Mikroliter der C18-Aufschlämmung aufzusaugen.

Führen Sie die Spritze in den 1/16-Zoll-PTFE-Schlauch ein und geben Sie die Aufschlämmung langsam in die große Kapillare ab. Beobachten Sie unter dem Mikroskop, wie sich die Kapillare mit Partikeln füllt, bis eine Partikelpackung von zwei bis drei Millimetern erreicht ist. Das kleinere Kapillarrohr hält diese Partikel durch einen Keystone-Effekt im Mikroreaktor zurück.

Zum Schluss wird der Mikroreaktor mit 50 Mikrolitern einer 50- bis 50-Lösung aus Wasser und Acetonitril gespült, gefolgt von 50 Mikrolitern einer Lösung mit 49 Mikrolitern Wasser, gemischt mit einem Mikroliter Acetonitril. Trennen Sie den Kapillarmikroreaktor von der PEEK-Verbindung und schließen Sie ihn an ein PEEK-T an. Führen Sie dann einen zwei Zentimeter langen Platindraht ein, der mit einer 1/32-Zoll-PEEK-Hülse isoliert ist, um eine leckagefreie Verbindung in den Seitenarm des PEEK-T zu gewährleisten.

Schließen Sie eine einen halben Meter lange Probentransferkapillare an das gegenüberliegende Ende des PEEK-T an. Verwenden Sie eine 1/32-Zoll-PEEK-Hülse, um eine leckagefreie Verbindung zu gewährleisten. Befestigen Sie das PEEK-T auf dem XYZ-Tisch.

Und positionieren Sie den Elektrospray-Ionisationsstrahler etwa zwei Millimeter von der Einlasskapillare des Massenspektrometers entfernt. Verbinden Sie dann den Platindraht mit der Elektrospray-Ionisationsstromquelle des Massenspektrometers. Verbinden Sie außerdem das gegenüberliegende Ende der Probentransferkapillare mit der Edelstahlverbindung und verwenden Sie eine 1/16-Zoll-PEEK-Hülse, um eine leckagefreie Verbindung zu gewährleisten.

Verbinden Sie als Nächstes ein vier bis fünf Zentimeter langes Stück PTFE-Schlauch mit dem gegenüberliegenden Ende der Edelstahlverbindung. Geben Sie die Tandem-MS-Datenerfassungsparameter, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, in das Softwarepaket ein, das das MS-Gerät steuert. Speichern Sie sie als Methodendatei, um das Setup für die Durchführung der Analyse vorzubereiten.

Das LTQ MS-System ist mit einer modifizierten ESI-Quelle ausgestattet, die einen selbst gebauten XYZ-Tisch umfasst, der die Anbindung des Massenspektrometers an die verschiedenen Probeneingangsansätze ermöglicht. Laden Sie eine 250-Mikroliter-Spritze mit einer wässrigen Lösung aus 50 millimolarem Bicarbonat, gelöst in 2 % Acetonitril. Schließen Sie dann die Spritze an den Mikroreaktor an und legen Sie sie unter die Spritzenpumpe.

Spülen Sie den Mikroreaktor und zwei Mikroliter pro Minute fünf Minuten lang, um ihn für die Analyse vorzubereiten. Laden Sie dann die gewünschte Proteinprobe in eine 250-Mikroliter-Spritze und infundieren Sie die Probenlösung fünf Minuten lang mit zwei Mikrolitern pro Minute. Legen Sie als Nächstes eine 250-Mikroliter-Spritze, die mit einer fünfmikromolaren Trypsinlösung beladen ist, unter die Spritzenpumpe und infundieren Sie das absorbierte Protein auf dem Mikroreaktor mit zwei Mikrolitern pro Minute für ein bis drei Minuten.

Es ist wichtig, dass man die Trypsinlösung vor jedem Experiment frisch auftaut und zubereitet. Dadurch wird sichergestellt, dass das protolytische Enzym seine Aktivität und seinen Betriebs-pH-Wert des Mikroreaktors beibehält, der bei einem pH-Wert von etwa 8 liegt. Laden Sie eine weitere 250-Mikroliter-Spritze mit einer wässrigen Lösung, die aus 0%1% Trifluoressigsäure besteht, die mit 2%Acetonitril zugesetzt wird.

Verwenden Sie diese Lösung, um den proteolytischen Aufschlussprozess zu löschen, indem Sie den Mikroreaktor fünf Minuten lang mit zwei Mikrolitern pro Minute spülen. Wechseln Sie dann zu einer Spritze, die mit 01 % Trifluoressigsäure gefüllt ist, die 50 % Acetonitril zugesetzt wird, und schalten Sie den MS-Datenerfassungsprozess in der Elektrospray-Ionisationsspannung auf etwa 2000 Volt ein. Verwenden Sie die angesäuerte Lösung, um den Proteinverdau aus dem Mikroreaktor bei 300 Nanolitern pro Minute für 20 bis 30 Minuten zu eluieren.

Erfassen Sie Massenspektrometriedaten mithilfe der Datenerfassungsparameter, die im begleitenden Textprotokoll bereitgestellt werden. Verarbeiten Sie die LTQ MS-Rohdateien mit einer minimal redundanten Proteindatenbank, indem Sie zunächst die Rohdaten in die Suchmaschine hochladen. Legen Sie dann die Massentoleranzen für das Ausgangs- und das Fragmention auf zwei bzw. ein Dalton fest und verwenden Sie für die Suche nur vollständig tryptische Fragmente mit bis zu zwei übersehenen Spaltungen.

Legen Sie außerdem die False-Discovery-Raten mit hoher und mittlerer Konfidenz auf 1 % bzw. 3 % fest und lassen Sie keine posttranslationalen Modifikationen zu, es sei denn, es wird speziell nach bestimmten Modifikationen gesucht. Filtern Sie abschließend die Daten, um nur die Peptidübereinstimmungen mit hoher Zuverlässigkeit auszuwählen. Hier ist ein Massenspektrum dargestellt, das aus tryptischen Peptiden besteht, die aus einem Proteingemisch erzeugt wurden, das im Mikroreaktor einer Proteolyse unterzogen wurde.

Diese Markierungen repräsentieren die intensivsten tryptischen Peptidionen und liefern deren Sequenz und den entsprechenden Proteinidentifikator. Dieser Mikroreaktor bietet einen einfach zu implementierenden Versuchsaufbau für den enzymatischen Verdau von Proteinen und ermöglicht eine Massenanalyse und -identifizierung in weniger als 30 Minuten. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass die Erhaltung der Sauberkeit der Fläschchen und Instrumente, die mit Lösungen in Kontakt kommen, entscheidend ist, um eine Kontamination der Probe zu vermeiden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere massenspektrometrische Datenerfassungsmethoden verwendet werden, um eine bessere Charakterisierung der generativen Peptide zu ermöglichen und zusätzliche Fragen zur Struktur von Proteinen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Proteonomik, schnellere Protokolle für die Analyse von Proteinen zu entwickeln und die Entwicklung neuartiger mikrophalyticischer Plattformen zu erforschen, die die Erforschung biologischer Proben mit hohem Durchsatz ermöglichen. Diese Technik beschränkt sich auf die Analyse von eher einfachen Proteinmischungen, die 25 bis 50 Peptide erzeugen.

Diese Peptide können durch einfache Infusionsexperimente analysiert werden und erfordern keine flüssigkeitschromatographische Trennung vor der MS-Analyse. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln äußerst gefährlich sein kann und bei diesem Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Vermeidung offener Flammen getroffen werden sollten.