Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, automatisierte Trennungen von kleinen Partikelvolumina mithilfe einer mikrofluidischen photischen Vorrichtung durchzuführen. Diese Methode kann wichtige Verfahren im Bereich der biomedizinischen Technik ermöglichen, einschließlich der robusten Aufbereitung und Trennung von Proben für Anwendungen in der Bio-Detektion und klinischen Forschung. Die Hauptvorteile dieser Technik sind Modularität, Präzision, Robustheit und Automatisierung, wodurch sie nicht nur für die Retic-Trennung, sondern auch für eine Vielzahl von Durchfluss-mikrofluidischen Trennvorrichtungen anpassbar und flexibel ist.

Wir erkannten zunächst die Notwendigkeit dieser Fähigkeit, Trennungen an biologischen Probenmengen im Submillimeterbereich routinemäßig und zuverlässig durchzuführen, ohne dass es zu einer erheblichen Verdünnung oder zu einem Analytverlust kommt. Die Integration der Probenmesstechnik und der automatisierten Weiterleitung von der Quelle zu den Sammelgefäßen zusammen mit den Standardoperationen der Spritzenpumpe ist entscheidend, um im Mikromaßstab erfolgreich arbeiten zu können. Beginnen Sie mit der Konstruktion des akustischen Retic-Geräts und der Gestaltung der beiden Fotomasken, wie in Abschnitt eins des begleitenden Textprotokolls beschrieben.

Danach die Fluidanschlüsse auf der Rückseite auf einen doppelseitig polierten Siliziumwafer mit der Orientierung 1 0 0 strukturieren. Mithilfe der Standard-Photolithographie mit positivem Resist diese Geometrie mittels tiefer reaktiver Ionenätzung auf eine Tiefe von 350 bis 400 Mikrometern ätzen. Anschließend den Wafer umdrehen und die Geometrie der Fluidkanäle auf der Vorderseite strukturieren.

Erneut unter Verwendung der Standard-Positivresist-Photolithographie wird der strukturierte Wafer auf einen zweiten unstrukturierten Silizium-Trägerwafer montiert. Mit dem Fotolack werden nun die freigelegten Kanäle bis zu einer Tiefe von 200 Mikrometern geätzt. Mithilfe des Tiefen-Reaktivionsätzverfahrens wird der Bauelementewafer anschließend in einer Resist-Abbeizlösung getaucht, um ihn vom unstrukturierten Siliziumwafer zu lösen.

Als Nächstes reinigen Sie die Gerätewafer und eine strukturlose 0,5 Millimeter dicke Borosilikatglaswafer mit Piranha-Lösung. Versiegeln Sie anschließend die Fluidkanäle durch ionische Bindung der Glas- und Siliziumwafer unter Verwendung der hier gezeigten Bedingungen. Schneiden Sie abschließend die einzelnen Chips mit einer Diamantklinge auf einer Trennsäge aus einem Zweikomponenten-Epoxidharz mit niedriger Viskosität voneinander ab.

Wiegen Sie das empfohlene Verhältnis beider Komponenten ab und mischen Sie diese gründlich. Anschließend platzieren Sie das bleihaltige Zirkonat-Titanat oder das PCT-Piezokeramik in einer geeigneten Halterung und verteilen mithilfe einer Pipette etwa 10 Mikroliter der Epoxymischung gleichmäßig darauf, um eine dünne, homogene Schicht zu erzeugen. Danach setzen Sie den Chip in die Halterung ein und richten die mit Epoxid beschichtete Seite des Piezokeramiks mit dem mikrofluidischen Chip aus.

Es kann notwendig sein, den Chip mit Klebeband festzukleben, um ihn während der Ausrichtung an Ort und Stelle zu halten. Klemmen Sie die Baugruppe in einen Schraubstock ein und achten Sie darauf, dass keine der Komponenten bricht; härten Sie anschließend gemäß den vom Hersteller des Epoxids empfohlenen Temperatur und Dauer aus. Nach dem Aushärten des Epoxids verwenden Sie ein feines Lötkolbengeschirr, um dünne Drahtleitungen an jeder Seite der piezoelektrischen Keramik anzulöten.

Falls erforderlich, verwenden Sie das geeignete Lot, um die Pizo-Oberfläche vorzubereiten. Achten Sie darauf, den Kontakt mit dem Pizo so kurz wie möglich zu halten, um eine thermische Entpolung zu vermeiden. Befestigen Sie den Chip mithilfe von Klemmhalterungen an einer fluidischen Grundplatte.

Befestigen Sie außerdem einen Kühlventilator an der Lochrasterplatine, um die Temperatur während akustischer Experimente zu regulieren. Danach schrauben Sie den Chip-zu-Welt-Verbinder ein. Montieren Sie die Lochrasterplatine auf den Mikroskopständer und verbinden Sie die Welt-zu-Chip-Verbinder an den Einlässen und Auslässen mit zusätzlichen Schläuchen.

Unter Verwendung von standardmäßigen Viertelzoll-28-Gewindeverbindungen. Für ein 1/16-Zoll-Schlauchsystem verbinden Sie den mikrofluidischen Chip mit der Spritzenpumpe, computerkontrollierten Multiventil-Auswahlventilen, PC-gekoppelten Durchflussmessgeräten und Schläuchen, wie hier dargestellt und in Abbildung vier des begleitenden Textprotokolls beschrieben. Bevor die Trennung durchgeführt wird, füllen Sie die Reinigungsreagenzreservoirs und spülen Sie die entsprechenden Fluidleitungen vor.

Stellen Sie außerdem die Ventile drei und vier an den Chip-Ausgängen so ein, dass die Flüssigkeit zunächst in die Abfallreservoirs fließt. Schalten Sie als Nächstes den Kühlventilator ein. Verbinden Sie die Leitungen der piezoelektrischen Keramik mit dem Leistungsverstärker und stellen Sie den Funktionsgenerator auf die Resonanzfrequenz des verwendeten akustischen Chips ein.

Stellen Sie den Spannungssollwert am Funktionsgenerator so ein, dass der HF-Verstärker zwischen 12 und 25 Volt Spitze-zu-Spitze ausgibt, je nach gewünschter Trennung. Anschließend schließen Sie die geeigneten Sammelgefäße und das Pufferzulaufgefäß an das System an. Verwenden Sie den Probepuffer, der für die zu trennenden Zellen oder Partikel geeignet ist, oder wie er durch den nach der Trennung verwendeten Analyse-Test erforderlich ist.

Laden Sie anschließend die Steuersoftware und verwenden Sie diese, um die Ventile, Durchflusssensoren und die Pumpe zur Durchführung der vollautomatischen Spül- und Trennprozedur zu steuern. Unmittelbar vor Beginn der Trennprozedur wirbeln Sie das Probenfläschchen kurz an, um eventuell abgesetzte Partikel erneut zu suspendieren. Alternativ pipettieren Sie die Probe 10-mal auf und ab, um biologische Proben, die durch Wirbeln leicht beschädigt oder verklumpt werden können, zu mischen.

Befestigen Sie dann das Probenfläschchen an der Zuleitung und leiten Sie unverzüglich die Spülroutine und Trennprozedur ein. Beginnen Sie damit, mithilfe der Software den Luftzulauf der Ventile eins und zwei zu spülen, um sicherzustellen, dass sich keine Flüssigkeit in den Schläuchen befindet. Spülen Sie gleichzeitig die Schläuche, die das Puffer-Eingangsfläschchen mit Ventil zwei und das Proben-Eingangsfläschchen mit Ventil eins verbinden.

Lassen Sie die Spritzenpumpe etwa 15 Mikroliter aus beiden Vials ziehen, um die Schläuche vollständig zu füllen, und verbinden Sie diese mit den Ventilen. Schalten Sie anschließend die Ventile eins und zwei auf Abfall, um überschüssige Flüssigkeit oder eingeschlossene Luft aus der Ladespule zu entfernen. Richten Sie danach das Programm zum Beladen der ProbenSpule ein, indem Sie zunächst 25 Mikroliter Luft mit einer Geschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Minute ansaugen.

Danach 250 Mikroliter Probe mit 200 Mikrolitern pro Minute aufladen, gefolgt von 35 Mikrolitern Leitpuffer mit 200 Mikrolitern pro Minute und schließlich weiteren 25 Mikrolitern Luft mit 50 Mikrolitern pro Minute. Anschließend die Spritzenpumpen so einstellen, dass die geladenen Flüssigkeitssegmente mit 100 Mikrolitern pro Minute infundiert werden, und die Durchflussraten an den Auslässen für kleine und große Partikel mithilfe von Durchflusssensoren überwachen. Das geeignete Durchflussverhältnis kann wie in der begleitenden Textanleitung beschrieben bestimmt werden.

Wenn die Durchflusssensoren einen Anstieg der Durchflussrate erkennen, der auf das Passieren der ersten Luftlücke hinweist, schalten Sie das entsprechende Auslassventil von der Abfallflasche auf eine Probenahmeflasche um. Stellen Sie anhand der Messwerte der Durchflusssensoren sicher, dass der Durchfluss stabil ist, während die Probe das Chip durchläuft und separiert wird. Während die Probe durch den Chip fließt, werden die getrennten Fraktionen an den Auslassventilen gesammelt.

Am Ende des Probenstaus den Flusssensor beobachten und die zweite Luftlücke detektieren. Zu diesem Zeitpunkt die Auslassventile wieder auf Abfall umschalten. Nachdem das volle Volumen abgegeben wurde, die Spritzenpumpe stoppen und die Automatisierungsroutine beenden.

Nach Abschluss des Trennversuchs die Sammelgefäße für die kleinen und großen Partikel trennen und zur anschließenden Analyse entsprechend lagern. Den Probennahmeschlauch in leere Gefäße sichern, um überschüssige Reinigungslösungen aufzufangen, die durch die Schläuche gespült werden. Anschließend die automatisierte Systemreinigungsroutine starten, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Während dieses Vorgangs steuert das Programm die Ventile und die Spritzenpumpe, um die Haltespule nacheinander mit Reinigungsreagenzien zu beladen und diese durch das System zu spülen. Nach Abschluss des automatisierten Reinigungs- und Dekontaminationsvorgangs entsorgen Sie die überschüssigen Spüllösungen und die Gefäße, in denen sie gesammelt wurden, gemäß den geeigneten Verfahren für die Entsorgung biologischer oder chemischer Abfälle. Hier ist ein repräsentativer Frequenzscan von einem gut gekoppelten Piezo- und mikrofluidischen Gerät dargestellt.

Wenn die Kopplung zwischen dem Piezo und dem mikrofluidischen Gerät gut ist, fokussieren sich die Partikel bei der Resonanzfrequenz stark, was zu einem deutlichen Peak in der Fluoreszenzintensität und einer Migration in die erwartete Fokussierposition führt. Im Gegensatz dazu fokussieren sich Partikel bei schlechter Kopplung nicht gut, und das Gerät ist ungeeignet, wenn eine hochwertige Fokussierung oder eine schnelle Strömung für die gewünschte Anwendung entscheidend sind. Jede Linie in diesem Diagramm stellt Trennungsergebnisse unter Verwendung verschiedener Polystyrol-Partikelgrößen und Piezo-Ansteuerspannungen dar.

Im Allgemeinen sind höhere Spannungen erforderlich, um kleinere Partikel zu extrahieren. Trockene Spannungen können jedoch nicht beliebig erhöht werden, da die Wärmeabgabe größer wird und die Effekte des akustischen Strömungsverhaltens zunehmen. Um die Eignung dieser Plattform für die Trennung biologischer Partikel zu demonstrieren, wurden humane Raji-Zellen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von acht bis 10 Mikrometern mit dem Dengue-Virus, das einen ungefähren Durchmesser von 50 Nanometern aufweist, versetzt und anschließend mithilfe der akustischen mikrofluidischen Vorrichtung getrennt.

Wenn ein solches System einmal zusammengebaut und programmiert ist, können Trennungen routinemäßig in etwa fünf Minuten durchgeführt werden. Etwa drei Proben pro Stunde können mit vollständiger Reinigung und Entkontaminierung zwischen den Proben verarbeitet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zellzählung, Western Blotting oder Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt werden, um die Reinheit der Trennung zu bestätigen und die biologische Bedeutung aufzuklären.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein typisches mikrofluidisches Trenngerät herstellt. Verwenden Sie World-to-Chip-Verbindungen, um mit der Hardware zu kommunizieren und ein automatisiertes Trennverfahren präzise und robust durchzuführen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit infektiösen Materialien äußerst gefährlich sein kann und nur von entsprechend geschultem Personal unter Verwendung der institutionell vorgeschriebenen Ausrüstung und Verfahren für den biologischen Sicherheitsstandard durchgeführt werden darf.