Name: Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Partikeltrennung in kleinen Volumina mit einer akustischen Mikrofluidik-Plattform. Diese Methode ermöglicht präzise biomedizinische Probenverarbeitung ohne Verlust von Analyten.

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Diese Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des U.S. Department of Energy vom Lawrence Livermore National Laboratory unter dem Vertrag DE-AC52-07NA27344 durchgeführt und teilweise durch das Laboratory Directed Research and Development (LDRD) Programm des LLNL, 14-LW-077, unterstützt. Die Autoren danken Michael Wilson, Mark Stenglein und Joe DeRisi von der University of California, San Francisco, für die großzügige Bereitstellung von GGV- und Boa-Zellproben. Die EJF bedankt sich für die Unterstützung durch das LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS dankt der UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll stellt die System-Level-Integration von mikrofluidischen Vorrichtungen zur Makroskala Ausrüstung, automatisierte biologische Probe Verarbeitung durchzuführen. Die Modularität dieser Plattform ermöglicht es, anpassungsfähig an jede Durchflussvorrichtung sein, und als Beispiel wird der Fokus der dargestellten Protokoll auf die Charakterisierung und Optimierung der Leistung einer acoustofluidic Partikeltrennvorrichtung. Drei wesentliche Vorteile dieses Protokolls werden hervorgehoben: (i) Modularität und Span-zu-Welt Anbindung, (ii) robuste Charakterisierung der Geräteleistung, und (iii) die automatisierte Verarbeitung von genau dosierten Probenvolumina zur Partikelabscheidung. ich. Modularität und Span-zu-Welt Schnittstelle Wie in Abbildung 2 dargestellt, ist der Mikrofluid-Chip auf einem kundenspezifischen Steckbrett, leicht auf einen Mikroskoptisch für die direkte Beobachtung passen montiert. Das Steckbrett enthält # 6-40 UNF Gewindebohrungen auf einem 5 mm-Pitch-Gitter, enabling der Chip befestigt ist, und Fluidverbindungen vorgenommen werden. Die Fluidanschlüsse sind Rohre mit bearbeiteten Enden, PEEK, die Abdichtung gegen die Fluidik-Chip mit einem Gummi-Gesicht-Dichtung und einem Edelstahl-Halsband. Diese Schnittstelle Schema sorgt für eine einfache und schnelle Chip-Ersatzgerät Redesign, erfordern einige oder gar keine Änderungen an anderen Systemkomponenten, sofern Chip Fußabdrücke an das Netz-Format entsprechen. Beispielsweise haben wir diese Plattform mit mikrofluidischen Chips für Durchfluss-Elektrophorese thermische Zelllyse 29 schnellen Vermischung der Reagenzien für die chemische Synthese, und Einzelzellen-Abscheidung und die Abfrage benutzt. ich ich. Robuste Charakterisierung der Leistung der Vorrichtung Um die Leistung jeder Mikrofluidik-Trennvorrichtung zu optimieren, müssen ihren Betrieb zunächst gründlich charakterisiert werden. Das hier beschriebene System unterstützt die Entwicklung von schnellen und automatisierten Protokollen, dies zu tun. Zum spezifischen Blutzuckerwerle der akustischen Fokussierungseinrichtungen, der Fokussierungsqualität, Betriebsfrequenz, und die Position der fokussierten Teilchen in dem mikrofluidischen Kanal muss für jede einzelne Vorrichtung bestimmt werden. Diese Messungen erfordern fegt durch eine Reihe von piezokeramischen Antriebsfrequenzen, Spannungen und Durchflussraten, um die optimalen Parameterkombinationen für hochwertige Trennung zu identifizieren. Die dargestellte Protokoll automatisch variiert diese abstimmbare Parameter und nimmt den entsprechenden Daten- dh Fluoreszenzbilder von Teilchen in den Kanal strömt, die nachbearbeitet, um die erforderlichen Messungen der Partikelfokussierungsqualität, Frequenz und Position (3) zu erzeugen. Vollständige Charakterisierung der akustischen Leistung der Vorrichtung erfordert Wiederholung der Schritte 4.4 und 4.5, wie unter verschiedenen Versuchsbedingungen notwendig. Zum Beispiel ist der absolute Fokusposition eines Chips, indem Sie den Frequenz-Scan bei relativ niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten und hohe Spannung gefundens, um die vollständige Migration auf die Knotenstandort zu gewährleisten. Zusätzlich kann eine solche Frequenzabtastungen die Qualität der Vorrichtungsanordnung (bei Verwendung mit Polystyrolkügelchen bekannter Größe ausgeführt wird) zu beurteilen oder zu bestimmen, wie eine zuvor unbekannte Teilchensorte im System verhalten (nachdem ein Chip mit Perlen untersucht). Ein Chip mit einer guten Energietransfer von der Piezokeramik an den mikrofluidischen Kanal wird in engen Fokussierung bei hohen Flussraten (&gt; 1 ml / min) und Niederspannung (12-15 V pp) zur Folge haben, während diejenigen mit schlechten Energieübertragung werden nicht einmal zu konzentrieren bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten (&lt;100 &amp; mgr; l / min) und hohen Spannungen (&gt; 20 V pp). Wir haben gefunden, dass ein enger Kontakt zwischen der Mikrofluid-Chip und der Piezokeramik ist kritisch für eine effiziente Energieübertragung in die Flüssigkeit. Weitere Untersuchungen der optimalen Verfahren zum Verbinden der Mikrofluid-Chip und der Piezokeramik wird zuverlässige Produktion von High-Performance-Geräte ermöglichen. Schließlich eine vollständigeBild der Betrieb eines acoustophoretic Gerätes kann durch die Kombination der bildbasierten Frequenz-Scan Messungen der Stufe 4 (und Abbildung 3) mit Partikelzählungen von der SPO und LPO als Funktionen der relevanten Betriebsparameter gesammelt, erhalten werden kann, von mit Mikrokügelchen durchgeführt Trennversuche wird, wie in Schritt 5. Wie in Figur 6 gezeigt ist, beschrieben, kann eine solche Reihe von automatisierten Experimente schnellen Charakterisierung Leistung und Abstimmbarkeit eines einzelnen Gerätes, Informieren des Benutzers über die optimale Parameterraum, die Vorrichtung zur Partikelabscheidung zu betreiben. iii. Automatisiertes Kleinprobenaufbereitung zur Partikelabscheidung Für eine erfolgreiche und genaue Mikrofluid-Chip-basierte Probenverarbeitung, ist es wichtig, sicher und präzise meter, Last, zu liefern, zu sammeln und die Volumina der Flüssigkeit, während sie passieren. Diese Genauigkeit ist besonders wichtig, wenn das Probenvolumen klein ist(~ 0,1-1 ml), die in der klinischen oder Forschungslabor Einstellungen gemeinsam ist. 30 Präzise Probenhandling ist eine Herausforderung in traditionellen mikrofluidischen Experimente, die manuelle Rücknahme der Probe in einer Spritze und Infusion in einem Gerät ohne Feedback der bei der Probe zu beschäftigen wurde abgetrennt und, wenn es gesammelt werden sollten. Das vorgestellte Protokoll beschäftigt automatisierte Probenspule Laden und Abgeben gekoppelt mit Echtzeit-Feedback von Durchflusssensoren, um reproduzierbare Trennungen von kleinen Probenvolumina zu ermöglichen. Abbildung 5 zeigt die Strömungsprofile, gemessen an der SPO und LPO aus einer typischen Trenn Experiment. Zuerst führt Puffer von mindestens 35 &amp; mgr; l geladen, um eine stabile Strömung zu gewährleisten, bevor die Probe das akustische Chip erreicht. Probenvolumina von weniger als 100 &amp; mgr; l werden für diese Systemkonfiguration zu empfehlen, da die Probenverdünnung aufgrund der führenden Puffer zu groß wird. Ein Stecker der Luft zu Beginn des th verwendete Injektion vor der Vorderpuffer, um die Probe Stecker aus der folgenden Beschreibung wird verhindert Vermischung und Verdünnung der Probe und als Indikator für die Durchflusssensoren dienen Flüssigkeit zu trennen. Nach einer ersten transienten als Flüssigkeit beginnt, durch das System bewegen, scharf spitze Signale in beiden Filialen zeigen den Durchgang der ersten Luftblase. Diese Transienten werden durch einen langen Zeitraum stabile Strömung folgen, während die Probe fließt durch das System dann eine andere Spitze, wenn die zweite Luftblase durchläuft und schließlich eine eventuelle Verringerung der Strömungsrate auf Null, nachdem die Spritzenpumpe stoppt. Der Durchgang der Luft-Stecker durch die Durchflusssensoren wird als Triggerpunkte verwendet werden, um die Ventile zu schalten zum Starten und Stoppen Probensammlung und minimiert so verlorenen Probe und Verdünnung durch nicht-Probenflüssigkeitsvolumina. Closed-Loop-Dosierung von Probenvolumina verarbeitet beseitigt die Notwendigkeit, vor dem Beginn des Experiments jedesmal, wenn die Eingangsabtastung geändert umprogrammieren diese Werte. Diese Funktion istbesonders wichtig, wenn Probenvolumen ist begrenzt, beispielsweise im Fall von vielen klinischen Proben. Echtzeit-Durchflussüberwachung hilft auch bei der Fehlersuche; eine schlechte Lauf (beispielsweise eine Verstopfung bildet in einem der Ausgänge) ist unmittelbar ersichtlich aus den resultierenden Strömungsprofile, wie in 5b. Um die Flexibilität und Effizienz der acoustofluidic Trennung unter Verwendung des dargestellten Systemarchitektur gereinigt DENV und GGV Virusstämme zu demonstrieren, wurden in Zellvorräte durch den mikrofluidischen Chip versetzt, und durch die Verarbeitung getrennt. 7a zeigt, daß Raji-Zellen wurden gut getrennt von Viren, wie 97 % der Raji-Zellen Verlassen des Chips wurde gefunden, dass in der LPO werden, wodurch eine hoch angereicherte Probe DENV im SPO verlassen. Im Vergleich dazu war die Effizienz der DENV Trennung unteren, mit 70% der DENV Verlassen der Chip in der SPO gefunden. Dies kann zu einer leichten Konvektionsmischung durch die Windungen des separati induzierte zurückzuführenauf dem Kanal, aber eher zu einigen DENV Partikel migrieren mit den Raji-Zellen in das LPO. Zellen seitlich Migration über Stromlinien ziehen etwas Flüssigkeit mit ihnen, auch bei niedrigen Reynolds-Zahl. Durch diesen Mechanismus sowie unspezifische Oberflächenadsorption übertragen Viruspartikeln in das LPO. Dennoch ist das hoch angereicherte Probe DENV im SPO ein bedeutender Vorteil, beispielsweise wenn die de novo-Sequenzierung wird verwendet, um zu erkennen und zu identifizieren Viren. 7B zeigt, daß in einer Testreihe werden nur etwa 70% der Zellen Boa Verlassen des Chips wurden passgenau in der LPO gefunden, verglichen mit fast 100% Abscheidegrad für Raji-Zellen. Der Unterschied in der Trennleistung zwischen den beiden Zelltypen die auf eine kleinere mittlere Größe oder eine geringere Dichte an Boa Zellen im Vergleich zu Raji-Zellen, was daher zu kleineren akustische Kräfte. Um zu bestätigen oder zu widerlegen diese Vermutungen, die Größe, Dichte und Morphologie der BoaZellen in Suspension (das normalerweise wachsen haft) Boa Zellen muß genau gemessen werden, ein Aufwand für weitere Untersuchungen. In den gleichen Experimenten, ähnlich wie bei den Versuchen mit DENV, der Hauptteil der gewonnenen GGV verlassen vom SPO, was eine Anreicherung der Virusfraktion. Die dargestellten Daten unterstreichen die inhärenten Herausforderungen der Technik breit anwendbar Plattformen für die Verarbeitung einer Vielzahl von biologischen Proben. Wichtig ist, dass die biologischen Interaktionen beginnen, eine ebenso große Rolle wie die physikalischen und mechanischen Effekte spielen. Allerdings sind diese Vorversuche auch die Kraft und die Verheißung der Verwendung dieser Systemarchitektur für die Probenverarbeitung in der klinischen und Forschungsanwendungen zu demonstrieren. Als robust, gut charakterisiertes System entwickelt, bietet diese Plattform die Möglichkeit, Antworten auf neue wissenschaftliche Fragen zu suchen.

Probentrennung und Fraktionierung ist eine der vielversprechendsten Anwendungsgebiete für Mikrofluidtechnik. Eine solche Probenhandhabungsschritte sind integrale für effektive klinische Diagnose, Therapie Entwicklung, biosurveillance Bemühungen und Fortschritte in der Life-Science-Forschung und Technologie. Eine Myriade Mikrofluidik-Trenn Strategien für Fluid suspendierten Partikeln und Kolloiden, sowie für chemische und biologische Spezies nachgewiesen worden; mehr Bewertungen bieten Übersichten über die jüngsten Fortschritte und Entwicklungen in diesen Bereichen 1-9. Obwohl viele dieser mikrofluidische Trenntechnologien (im Folgenden als &quot;Core-Geräte&quot; genannt) wurden ausführlich charakterisiert, haben einige Berichte die Probentrennproblem auf Systemebene betrachtet. Die Core-Geräte sind in der Regel einzelne Zentimeter-Skala-Chips, eine Schnittstelle zu Fluorpolymer-Schläuche, mit durch eine Verschiebung oder Druckpumpe geförderten Flüssigkeit.Und doch, wenn das Versprechen der Mikrofluidik - einschließlich der erhöhten Automatisierung, Zuverlässigkeit und Verringerung der Probenmengen - ist, Wirklichkeit zu werden, zumindest eine gleichwertige Anstrengungen unternommen werden müssen, um das Design einer vollständigen Trennung System, in das die Kernvorrichtung integriert gewidmet werden . Darüber hinaus ist eine große Herausforderung für die Mikrofluidik-Ansätze zur Lebenderkennung ist das Makro bis Mikro-Schnittstelle. Dies bezieht sich nicht nur auf die physische &quot;Welt-to-chip&quot; Verbindungen einer mikrofluidischen Vorrichtung zu makroskopischen Komponenten und der Fehlanpassung zwischen typischen klinischen oder analytischen Probenvolumina (~ 0,1-10 ml) und das Innenvolumen des Mikrofluidik-Chips (~ 0,01-10 &amp; mgr; l), sondern auch auf die statistischen Stichprobenbegrenzungen aus Überbrückung dieser Größenskalen. Diese Probleme beitragen, die Wahrnehmung, dass die Probe vor der Verarbeitung und Zubereitung sind die &quot;schwache Glied&quot; der Biodetektion. 10 Die in dieser Arbeit beschriebenen ta-Plattformkes wichtige Schritte in Richtung der Bewältigung dieser Herausforderungen. Einen Ansicht auf Systemebene, dieses Protokoll beschreibt die sichere Verarbeitung von genau dosierte analytischen Maßstab Volumina (Bereich von 0,15 bis 1,5 ml) auf ~ 10 min Zeitskalen. Dies ist eine &quot;Ein-Knopf&quot; Operation: Sobald die Quelle Fläschchen mit der Probe und Ziel-Fläschchen für Fraktionssammlung in das System gelegt, den Befehl &quot;Ausführen&quot; startet den Vorgang, und alle Schritte sind computergesteuert. Am Ende eines Durchlaufs können die Sammelfläschchen aus dem System für nachgeschaltete Analyse der getrennten Fraktionen entfernt werden. Der Core-Gerät in diesem System ist ein acoustophoresis Chip, der Säugetierzellgroße (5-20 &amp; mgr; m) Partikel aus der Probe extrahiert. Acoustophoretic Trennung wird hier gewählt, vor allem, weil es Hochdurchsatz (bis zu 100 s von &amp; mgr; l / min), markierungsfreie und berührungslose und bietet damit Vorteile bei der Trennung von lebensfähigen Viruses von Zellen, die nur wenige andere mikrofluidische Techniken entsprechen. Die Physik der Schallpartikel Fokussierung wurden ausführlich beschrieben ist, 11 bis 13 und sind nicht der Schwerpunkt dieses Protokoll, sondern eine kurze Zusammenfassung der zugrunde liegenden Konzepte folgendermaßen vor, um das Verständnis der Anwendung auf Mikrofluidik-Trenn unterstützen. Ultraschall-Stehwellen in Resonanz in flüssigkeitsgefüllten Mikrokanälen zu erzeugen Druckfelder, die zu Kräften, die Partikel in Richtung Knoten des Niederdruck-Antrieb zu geben. Die Kraftgröße ist abhängig von Volumen des Teilchens, und 14 als solche auf einem akustischen Kontrastfaktor von den relativen Dichten und Kompressibilität des Teilchens abgeleitet und der Suspensionsflüssigkeit., Akustische Fokussierung ist ideal gelegen, um die Trennung von Zell-Größe (~ 15.7 geeignet mgr; m) von Virus-Größe (~ 50-200 nm) Teilchen. Die größeren Partikel wandern zu einem Druck-Knoten; da jedoch die Kraftgröße sehr klein ist fürPartikel, die kleiner als 2-3 um, diese kleinen Teilchen oder gelösten Spezies kaum bewegen. Unsere spezielle Implementierung akustische Trennung, wie zuvor beschrieben, 15 enthält eine dünne Wand, um den Fluidkanal zu unterteilen und ermöglicht abstimmbaren asymmetrische Anordnung der Fokussierungsposition. Dies erhöht die Flexibilität im Gerätedesign und die Leistungsvorteile, einschließlich der erhöhten Trennqualität und Geschwindigkeit-vollständig an anderer Stelle beschrieben. 16,17 Allerdings ist ein großer Vorteil der in dieser Arbeit beschriebenen System-Level-Design-Ansatz, dass sie anpassungsfähig zu einer großen Vielfalt von Mikrofluid-Core-Geräte ist. Beispielsweise können die meisten anderen Durchfluß-Trennungen, einschließlich Trägheits- Strömungsfeld-Fraktionierung, deterministische seitliche Verschiebung (DLD), und verschiedene Arten von elektrokinetische Vorrichtungen ohne weiteres eingebaut werden, mit entsprechenden Anpassungen vorgenommen, um Änderungen der Einlass / Auslass-Konfigurationskonto , Fließraten,und Probenvolumina. Geräte mit verschiedenen Arten von On-Chip-Bereichen (elektrisch, magnetisch) oder Gradienten (thermische, chemische) können zusätzliche Verbindungen mit dem Chip oder die Integration zusätzlicher Hardware, die diese Plattform bietet Platz benötigen. Dieses Protokoll sieht die erforderlich ist, um eine mikrofluidische Trenneinrichtung zu gestalten, und Silizium-Glas-Chips in vielen Mikrofertigungseinrichtungen herzustellen durch tiefe reaktive Ionenätzen (DRIE, ein Plasma-Ätzprozess zur Verfügung, die alternierenden Zyklen von Ätzen und Passivieren tief zu erreichen nutzt Schritte Funktionen mit vertikalen Seitenwänden 18). Als nächstes beschreiben wir die Charakterisierung der acoustofluidic Einrichtung, um die optimalen Betriebsparameter für die Trennung bestimmen, und schließlich Detail den vollintegrierten Trennsystem und das Verfahren für die Verarbeitung von biologischen Proben. Typische Bauteilcharakterisierung Ergebnisse und Probenverarbeitung Daten werden dann vorgestellt und diskutiert und die wichtigsten Vorteile dieser approach markiert sind, einschließlich Modularität, Robustheit, Präzision und Automation.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Erforderliche Materialien für die Schritte 1-3: Gerätedesign, Herstellung und Montage</td></tr><tr><td>Doppelseitiger polierter Siliziumwafer</td><td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td><td>100 mm < 100>&nbsp; Prime Wafer</td><td>1-20 Ohm-CM, 495 &#177; 25&#160; &Mikro; m Doppelseitig polierter</td></tr><tr><td>Glaswafer</td><td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td><td>100 mmx0,5 mm Boro</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist, AZ 1518</td><td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Deutschland</td><td>AZ 1518</td><td>Photoresist zum Kleben von Wafern auf Rohlinge zum Ätzen von DRIE</td></tr><tr><td>Photoresist, AZ 4620</td><td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Deutschland</td><td>AZ 4620</td><td>Photoresist zur Definition von Fluid- und Via-Maskenmustern</td></tr><tr><td>DRIE Plasmaätzer</td><td>STPS, Newport, NP, Vereinigtes Königreich</td><td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP-System</td><td></td></tr><tr><td>Wafer Bonder</td><td>Electronic Visions Group,&nbsp; St.Florian am Inn, Österreich</td><td>EVG 501</td><td></td></tr><tr><td>Würfelsäge</td><td>Kulicke & Soffa Industries, Singapur</td><td>K& S 982</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Kit</td><td>Epoxy Technology, Billerica, MA, USA</td><td>EPO-TEK 301</td><td>Epoxidharz zur Kopplung von Piezo- und Mikrofluidik-Chip</td></tr><tr><td>PZT Piezokeramik&nbsp;</td><td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td><td>PSI-5A4E</td><td>37,5 > 10 & 0,5 mm</td></tr><tr><td>28 AWG Kynar-isolierter Massivdraht</td><td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td><td>UL1422</td><td></td></tr><tr><td>2-Komponenten-Silber-Epoxidharz&nbsp;</td><td>MG Chemicals, Surrey, BC, Kanada</td><td>8331</td><td>Leitfähiger Klebstoff zum Befestigen von Drahtleitungen an PZT</td></tr><tr><td>L-Edit</td><td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td><td>Ledit v15.1 64-Bit-CAD-Software</td><td>für das Maskenlayout</td></tr><tr><td colspan="4">Erforderliche Materialien für Schritt 4: Charakterisierung der akustischen Fokussierungsleistung</td></tr><tr><td>Dual-Pump-Harvard-Gerät</td><td>, Holliston, MA, USA</td><td>PHD ULTRA-Serie, 703007</td><td></td></tr><tr><td>5&#160; ml-Spritzen</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Luer-auf-Gewinde-Port-Adapter</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-659</td><td>Verbindet die Spritze mit dem Schlauch</td></tr><tr><td>Union</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-623</td><td>Verbindet die Welt mit Chip-Verbindungen mit Fluorpolymer-Schläuchen. Kann auch Gurte verwenden&nbsp;</td></tr><tr><td>Aderendhülse 1/4-28 mit flachem Boden</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-200</td><td>Wird mit Mutter verwendet, um Verbindungen zwischen Schlauch und Spritze, Durchflusssensoren und Welt-zu-Chip-Hardware</td></tr> herzustellen <tr><td>Mutter&nbsp; 1/4-28 flacher Boden</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-202</td><td>Wird mit Aderendhülse verwendet, um Verbindungen zwischen Schlauch und Spritze, Durchflusssensoren und Welt-zu-Chip-Hardware</td></tr><tr><td>herzustellen 1/16" OD Fluorpolymer-Schlauch</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>1912L</td><td>Schlauch zum Verbinden von Spritzenpumpen mit Welt-Chip-Verbindungen. Die Schlauchgröße ist während der Verschlussschritte nicht kritisch (.01-.03" ID wird typischerweise verwendet, andere geeignete Teilenummern: 1907L, 1902L).</td></tr><tr><td>Kleiner ID-Fluorpolymer-Schlauch</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>1476-20</td><td>Verwendet für Durchflussbegrenzer: 0,006" ID, 1/16" OD FEP&nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK-Schläuche</td><td></td><td></td><td>Verbindet den Chip mit dem Fluorpolymer-Schlauch.</td></tr><tr><td>Lüfter</td><td>Multicomp, Leeds, England</td><td>MC19663</td><td></td></tr><tr><td>Funktionsgenerator</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td><td>33220A</td><td></td></tr><tr><td>HF-Verstärker</td><td>ENI, Rochester, NY</td><td>325 LA</td><td>Muss in der Lage sein, Signale von < 1&#160; V im Bereich von 1-2&#160; MHz bis 25&#160; Vpp zum Piezo.</td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>Photometrie, Tucscon, AZ, USA</td><td>CoolSnap HQ</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Zeiss, Oberkochen, Deutschland</td><td>Axiovert S100</td><td></td></tr><tr><td>FITC Filterset</td><td>Chroma Tech, VT, USA</td><td>SP101</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv, 10X</td><td>Zeiss, Oberkochen, Deutschland</td><td>ACHROPLAN</td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td><td>TDS3014B</td><td>Zur Überwachung der Ausgangsspannung durch einen HF-Verstärker</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>Mathworks, Natick, MA, USA</td><td>R2014a</td><td></td></tr><tr><td>Treiberschnittstellensoftware zur Integration der Photometrics-Kamera in die LabVIEW</td><td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td><td>SITK</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Dragon Green Fluoreszierend 5,76 oder 7,32&#160; &Mikro; m Beads</td><td>Bangs Laboratory, IN, USA</td><td>FS06F</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Zusätzliche Materialien, die für Schritt 5 benötigt werden: Automatisierte Trennung</td></tr><tr><td>Mehrwegeventile</td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>C25Z-3180EUHA</td><td>In der aktuellen Konfiguration werden 4 Ventile benötigt</td></tr><tr><td>Durchflusssensoren</td><td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td><td>SLI-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorpolymer-Schlauch, .01 und .03" ID</td><td>IDEX, Eiche Harbor, WA, USA</td><td>1902L und 1912L</td><td>Hochreine PFA-Vorzugsmutter</td></tr><tr><td></td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>ZN1PK-10</td><td>Wird mit Aderendhülse verwendet, um Verbindungen zwischen Rohren und Ventilen herzustellen. Alternative Teilenummern: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td></tr><tr><td>Aderendhülse</td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>ZGF1PK-10</td><td>Wird mit Mutter verwendet, um Verbindungen zwischen Schläuchen und Ventilen herzustellen. &nbsp;</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, Austin, TX, USA</td><td>LabVIEW Professional Development System</td><td>Laborautomatisierungssoftware</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Teknova, Hollister, CA, USA</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Raji Cells</td><td>ATTC, Manassas, VA, USA</td><td>CCL86</td><td></td></tr><tr><td>Boa-Zellen</td><td></td><td></td><td>Mit freundlicher Genehmigung des DeRisi Laboratory an der UCSF</td></tr><tr><td>GGV</td><td></td><td></td><td>Mit freundlicher Genehmigung des DeRisi Laboratory an der UCSF</td></tr><tr><td>DENV</td><td></td><td></td> Mit <td>freundlicher Genehmigung von Jose Pena am LLNL</td></tr><tr><td>Coulter Counter Z2</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td>Z2</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td><td>0267151B</td><td></td></tr></tbody></table>

einem mikrofluidischen plattform für präzisions-kleinvolumen probenbearbeitung und seine verwendung zur größe separate biologische partikel mit einem acoustic microdevice

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

Ein großer Vorteil der mikrofluidischen Systemen ist die Fähigkeit, kleine Probenvolumina zu manipulieren, damit Reagenz Abfälle reduzieren und die Erhaltung wertvollen Probe. Allerdings ist eine robuste Probenmanipulation zu erzielen es notwendig, die Geräteintegration mit dem Makroumfeld anzugehen. Wiederholbare, sensible Partikelabscheidung mit mikrofluidischen Systemen zu realisieren, stellt dieses Protokoll eine komplette automatisierte und integrierte mikrofluidische Plattform, die präzise Verarbeitung von 0,15 bis 1,5 ml Proben unter Verwendung von mikrofluidischen Bauteilen ermöglicht. Wichtige Aspekte dieses Systems sind modulare Geräte Layout und robuste Vorrichtungen was zu zuverlässigen und flexiblen Welt, um Verbindungen Chip und vollautomatische Fluid Handling, die Closed-Loop-Probensammlung, System Reinigung und Grundierung Schritte zur wiederholbaren Betrieb zu gewährleisten erreicht. Unterschiedliche Mikrofluidvorrichtungen können austauschbar mit dieser Architektur verwendet werden. Hier übernehmen wir eine acoustofluidic Gerät, Detail ihrer dadurch gekenn¬ zeichnetation, Performance-Optimierung, und zeigen ihre Verwendung für Größe-Trennung von biologischen Proben. Durch die Verwendung von Echtzeit-Feedback während der Trennung Experimenten wird Probensammlung optimiert, um zu erhalten und zu konzentrieren Probe. Obwohl die Integration von mehreren Geräten erfordern, Vorteile dieser Architektur umfassen die Fähigkeit, unbekannte Proben ohne zusätzliche Systemoptimierung, einfache Geräteaustausch und exakte, robuste Probenverarbeitung verarbeiten.

Schlüsselmerkmale des akustischen mikrofluidischen Vorrichtungskonstruktion sind in Abbildung 1 15 markiert ist, und an anderer Stelle beschrieben ist. Kurz gesagt, zwei Fluidströme Strömungsseite-an-Seite in einen Trennkanal, von einem parallelen Bypasskanal von einer dünnen Siliziumwand getrennt. Da die primäre Strahlungskraft Magnitudenskalen mit Partikelvolumen wandern große Partikel aus der Mischprobe Eingangsstroms in Richtung auf die Schalldruckknoten in den benachbarten Rückgewinnungsfluidstrom entfernt, während die kleinen Teilchen in der Ausgangsstrom (1B, C) ​​zu bleiben. Die unterteilten Zweikanal-Architektur verbessert Partikeltrennung 17 und ermöglicht die Einstellung der Knotenposition durch die Verwendung unterschiedlicher Bypasskanal Flüssigkeiten. 16 Die fluidischen Steckbrett und Armaturen bietet eine robuste Plattform für die Welt, um Verbindungen Chip und der modulare Aufbau ermöglicht einen schnellen Wechsel zwischen fluidischen Chips (Abbildung 2). Dies cONFIGURATION ermöglicht ebenfalls reversible Fluidverbindungen, die Dichtung bis zu 1000 psi, um schnell und zuverlässig (2B, E) hergestellt werden. Die Resonanzfrequenz f res eines Chips mit einfachen 1D analytischen Berechnungen geschätzt werden (siehe Schritt 1.1.1). Aus einer vollständigeren 2D Finite-Elemente-Modells der Vorrichtung im Querschnitt, 16 die erwartete Brennpunktposition für 2-Knoten-Resonanz 225 um von der Wand und der erwarteten Frequenz 1,68 MHz. Jedoch kann f res reale Geräte von ± 100 kHz variieren, abhängig von der Betriebstemperatur und Kopplung der Längs- und Querresonanzen. Deshalb wird nach Gerätemontage, f res muss empirisch relevanten Flussraten und Piezo-Antriebsspannungen überprüft werden, wie in Schritt 4 des Protokolls beschrieben. 3 zeigt repräsentative Frequenz-Scans bei 200 &amp; mgr; l / min aufgenommen,<html> mit Wasser in den Haupt- und Bypasskanäle und 20 V pp zugeführt, um das piezo. Beim Koppeln zwischen dem piezo und Mikrofluidik-Vorrichtung gut ist, wird Partikel dicht bei der Resonanzfrequenz zu konzentrieren, was zu einem klaren Peak in der Fluoreszenzintensität und Migration auf die erwartete Brennpunktposition (3A). Im Gegensatz dazu, wenn es schlechte Kopplung Teilchen nicht gut konzentrieren, und die Frequenz-Scan-Ergebnisse ähnlich auf 3B werden. Bei derartigen Vorrichtungen muss der Piezo-Wandler erneut montiert werden kann, wenn eine reversible Klebstoff verwendet wurde; Ansonsten ist diese Vorrichtung ungeeignet, wenn hochwertige Fokussierung oder schnelle Strömung kritisch für die gewünschte Anwendung geeignet sind. Die Daten in Abbildung 3 informiert die Wahl der Betriebsfrequenz für nachfolgende Experimente und die Spannungs- und Strombereich für eine effiziente Partikel Trennung zur Verfügung. Dateien / ftp_upload / 53.051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Automatisierte Probenverarbeitung. (A) Schematische Darstellung der Probe in der Probenspule geladen. (B) Repräsentative Strömungsprofil für eine erfolgreiche Trennung Experiment. (C) Durchflussprofil von einer Trennung führen, während der der SPO Auslass an etwa 220 sec verstopft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Nach dem Identifizieren Chips, die wirksam Separatoren sind, werden sie in der in Figur 4 dargestellten Systems integriert. Gesamtsystem Hubvolumen durch Verwendung Rohr mit 0,01 &quot;Innendurchmesser entlang der Hauptströmungspfad minimiert (blaue Linie). 5A zeigt das Make-up einer typischen Probe Stecker durch das System infundiert. Eine kleine Menge von &quot;führende Puffer&quot; (~ 35 &amp; mgr; l) ist erforderlich, um Precede die Probe in dem Fluss zu Stromschwankungen zu beseitigen, während die Probe durch die Trenn Chip bewegt. 5B zeigt Flussdaten von einer erfolgreichen automatischen akustische Trennung Experiment ergibt. Hauptmerkmale einer erfolgreichen Lauf umfassen: (1) ein vorübergehender Anstieg der Strömungsgeschwindigkeit sowohl in der LPO und SPO als Druck aufbaut und Flüssigkeit beginnt, durch das System fließen, (2) eine scharfe Spitze, die den Durchgang einer Luftblase (die Einschub zeigt ein erweitertes Profil einer einzelnen Blase), die die SPÖ vor dem LPO erreichen sollte aufgrund der ungleichen Fluss aus den beiden Auslässen, (3) stabile Strömung durch beide Auslässe zwischen den beiden Luftblasen wie die Probe bewegt sich durch das System, und (4) eine stufenweise Verringerung der Fließgeschwindigkeit in beiden Auslässen, nachdem die volle Probenvolumen wird dem System zugeführt. Problematisch Läufe von Strömungsprofilen ähnlich 5C, wo es scheint, dass die SPO wurde nach etwa 220 Sekunden verstopft Abbildung sofort ersichtlich. In thi<html> s Fall wird ein Reinigungsverfahren ähnlich wie in Schritt 5.3 beschrieben ausgeführt werden soll, um den Kanal zu reinigen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Abbildung 6. Vorrichtung Abstimmbarkeit: Teilchengröße und Spannungseffekte. Prozent Polystyrol-Mikrokügelchen in der LPO extrahiert, hängt von der Partikelgröße und Spannung an das piezokeramische geliefert. Jede Zeile entspricht einer anderen Betriebsspannung bei der Resonanzfrequenz, bestimmt, wie in Schritt 4. Gesamtdurchsatz durch die Vorrichtung beschrieben wird, ist 200 &amp; mgr; l / min, mit der angelegten Antriebs Frequenzen zwischen 1,62 und 1,64 MHz. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von mindestens drei getrennten Experimenten. Reproduziert und mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry aus http://pubs.rsc.org / en / Content / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j modifiziert.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Figur 6 zeigt die zusammenTrennErgebnisse unter Verwendung verschiedener Polystyrolpartikelgrößen und Piezotreiberspannungen, die die Betriebsparameter für eine wirksame Trennung notwendig zu demonstrieren. Im allgemeinen werden höhere Spannungen (dh mehr akustische Kräfte) erforderlich, um kleinere Teilchen zu extrahieren, wie erwartet. Antriebsspannungen kann nicht unbegrenzt erhöht werden, jedoch aufgrund der größeren Wärmeableitung und zunehmender Wirkung von akustischen Streaming. 13 Das Grundstück dient als allgemeine Richtlinie zur Partikelabscheidung-Partikelgrößen, die deutlich unterschiedliche Recovery zu einem bestimmten Steuerspannung (zB 10- zeigen und 2-um-Teilchen bei 8,8 V pp) wird gut trennen. Allgemeiner Partikelpopulationen mit einem großen Grßenunterschied wie Viren (~ 100 nm) und Zellen (~ 10 &amp; mgr; m) kann schnell und wirksam getrennt werden, wie auch Zellen diffErent Größen (beispielsweise 6-8 &amp; mgr; m scheibenförmigen Erythrozyten und 8-15 &amp; mgr; m Leukozyten). Die erforderlich ist, um mit anderen Zelltypen funktionieren spezifischen Bedingungen müssen empirisch bestimmt werden, da die Zellform, Dichte und Kompressibilität auswirken seiner akustischen Kontrast zusätzlich zu Zellgröße. Zu diesem Zweck sind die Verfahren in Schritt 4 zur Bestimmung verwendbaren Trennbedingungen für jede neue Zelle oder Partikeltyp und nicht nur für die Beurteilung der Qualität einer bestimmten acoustophoresis Gerät. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> Abbildung 7. Trennleistung der Handy-Virus dotierter Proben. Die Trennung resultiert aus (A) Raji-Zellen mit Dengue-Virus (DENV) und (B) Raji-Zellen und Boa Nierenzellen mit Golden Gate Virus (GGV) versetzt versetzt. Prozentsätze werden gesammelt als die Fraktion von Viren oder Zellen zum Beenden eines bestimmten definiertenAuslass im Vergleich zu der Gesamtmenge Verlassen des Chips. Die Fehlerbalken für (A) sind die Standardabweichung von 3 Versuchen, während die Proben (B) wurden nur einmal wegen der geringen Mengen verarbeitet. 1x PBS wurde als Probenpuffer und Wiederherstellungsflüssigkeit in den Bypass-Kanal für alle Experimente verwendet wird, mit Wasser. Chip-Betriebsfrequenzen lagen zwischen 1,60 und 1,64 MHz, mit Antriebsspannungen zwischen 16 und 20 V pp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Um die Nützlichkeit dieser Plattform für biologische Partikeltrennung zu demonstrieren, haben wir zum ersten Mal verwendet es, um gut charakterisierte biologische Proben zu verarbeiten: menschliche Raji-Zellen (10 5 Zellen / ml, mittlerer Durchmesser 8-10 &amp; mgr; m 25), versetzt mit Dengue-Virus (DENV, 10 5 pfu / ml, ungefähren Durchmesser 50 nm 26). Abbildung 7A zeigt den Prozentsatz an Raji Zellen und DENV sowohl im SPO LPO gesammelt (definiert als Anteil der jede Teilchenart aus jedem Auslass im Vergleich zu der Gesamtmenge von jedem von dem Chip gesammelt Teilchen gesammelt). Das Experiment wurde dreifach wiederholt, und Raji-Zellen wurden unter Verwendung eines Coulter-Zählers quantifiziert, während DENV wurde unter Verwendung einer Umkehrtranskriptions quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) quantifiziert. Als nächstes wurde die Leistungsfähigkeit des Systems in einem Szenario, die realistischer für die Verarbeitung von klinischen Proben, in denen die exakte physikalische Eigenschaften der Partikel kann unbekannt sein wird geprüft, und die verfügbaren Probenmengen geringer sind. Hier untersuchten wir die Trennung des kürzlich identifizierten golden gate-Virus (GGV), eine Schlange Erreger infizieren Boa constrictor Nierenzellen. 27 Die Größe der GGV Viruspartikel noch nicht gemessen worden, aber da GGV gehört zur Familie Arenaviridae, es wahrscheinlich von einemähnlicher Größe zwischen 100 und 150 nm. 28. Wir verarbeiteten Proben mit GGV in Raji menschlichen Zellen (keine Infektion Ziel für das virus) und boa Nierenzellen (Infektion Ziel GGV ungefähren Größe 10 Spike (10 4 pfu / ml) &amp; mgr; m 27), wobei beide Zellarten bei 10 4 Zellen / ml. Da diese Proben in geringen Mengen waren, sind Trennergebnisse aus nur einer Versuchsreihe in dieser Arbeit berichtet. 7B zeigt den Prozentsatz der Raji-Zellen, Boa Zellen und GGV von der SPO und LPO gesammelt. Zellen wurden in diesen Experimenten durch Zählen auf einem Hämozytometer quantifiziert und Viren wurden durch RT-qPCR quantifiziert.

Dieses Protokoll beschreibt eine Systemarchitektur für die Durchführung automatisierter Partikeltrennungen mit kleinen Volumina (0,15–1,5 ml) unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts und diskutiert Methoden zur Optimierung der Leistung und des Betriebs von akustofluidischen Geräten.

Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, automatisierte Trennungen von kleinen Partikelvolumina mithilfe einer mikrofluidischen photischen Vorrichtung durchzuführen. Diese Methode kann wichtige Verfahren im Bereich der biomedizinischen Technik ermöglichen, einschließlich der robusten Aufbereitung und Trennung von Proben für Anwendungen in der Bio-Detektion und klinischen Forschung. Die Hauptvorteile dieser Technik sind Modularität, Präzision, Robustheit und Automatisierung, wodurch sie nicht nur für die Retic-Trennung, sondern auch für eine Vielzahl von Durchfluss-mikrofluidischen Trennvorrichtungen anpassbar und flexibel ist.Wir erkannten zunächst die Notwendigkeit dieser Fähigkeit, Trennungen an biologischen Probenmengen im Submillimeterbereich routinemäßig und zuverlässig durchzuführen, ohne dass es zu einer erheblichen Verdünnung oder zu einem Analytverlust kommt. Die Integration der Probenmesstechnik und der automatisierten Weiterleitung von der Quelle zu den Sammelgefäßen zusammen mit den Standardoperationen der Spritzenpumpe ist entscheidend, um im Mikromaßstab erfolgreich arbeiten zu können. Beginnen Sie mit der Konstruktion des akustischen Retic-Geräts und der Gestaltung der beiden Fotomasken, wie in Abschnitt eins des begleitenden Textprotokolls beschrieben.Danach die Fluidanschlüsse auf der Rückseite auf einen doppelseitig polierten Siliziumwafer mit der Orientierung 1 0 0 strukturieren. Mithilfe der Standard-Photolithographie mit positivem Resist diese Geometrie mittels tiefer reaktiver Ionenätzung auf eine Tiefe von 350 bis 400 Mikrometern ätzen. Anschließend den Wafer umdrehen und die Geometrie der Fluidkanäle auf der Vorderseite strukturieren.Erneut unter Verwendung der Standard-Positivresist-Photolithographie wird der strukturierte Wafer auf einen zweiten unstrukturierten Silizium-Trägerwafer montiert. Mit dem Fotolack werden nun die freigelegten Kanäle bis zu einer Tiefe von 200 Mikrometern geätzt. Mithilfe des Tiefen-Reaktivionsätzverfahrens wird der Bauelementewafer anschließend in einer Resist-Abbeizlösung getaucht, um ihn vom unstrukturierten Siliziumwafer zu lösen.Als Nächstes reinigen Sie die Gerätewafer und eine strukturlose 0,5 Millimeter dicke Borosilikatglaswafer mit Piranha-Lösung. Versiegeln Sie anschließend die Fluidkanäle durch ionische Bindung der Glas- und Siliziumwafer unter Verwendung der hier gezeigten Bedingungen. Schneiden Sie abschließend die einzelnen Chips mit einer Diamantklinge auf einer Trennsäge aus einem Zweikomponenten-Epoxidharz mit niedriger Viskosität voneinander ab.Wiegen Sie das empfohlene Verhältnis beider Komponenten ab und mischen Sie diese gründlich. Anschließend platzieren Sie das bleihaltige Zirkonat-Titanat oder das PCT-Piezokeramik in einer geeigneten Halterung und verteilen mithilfe einer Pipette etwa 10 Mikroliter der Epoxymischung gleichmäßig darauf, um eine dünne, homogene Schicht zu erzeugen. Danach setzen Sie den Chip in die Halterung ein und richten die mit Epoxid beschichtete Seite des Piezokeramiks mit dem mikrofluidischen Chip aus.Es kann notwendig sein, den Chip mit Klebeband festzukleben, um ihn während der Ausrichtung an Ort und Stelle zu halten. Klemmen Sie die Baugruppe in einen Schraubstock ein und achten Sie darauf, dass keine der Komponenten bricht; härten Sie anschließend gemäß den vom Hersteller des Epoxids empfohlenen Temperatur und Dauer aus. Nach dem Aushärten des Epoxids verwenden Sie ein feines Lötkolbengeschirr, um dünne Drahtleitungen an jeder Seite der piezoelektrischen Keramik anzulöten.Falls erforderlich, verwenden Sie das geeignete Lot, um die Pizo-Oberfläche vorzubereiten. Achten Sie darauf, den Kontakt mit dem Pizo so kurz wie möglich zu halten, um eine thermische Entpolung zu vermeiden. Befestigen Sie den Chip mithilfe von Klemmhalterungen an einer fluidischen Grundplatte.Befestigen Sie außerdem einen Kühlventilator an der Lochrasterplatine, um die Temperatur während akustischer Experimente zu regulieren. Danach schrauben Sie den Chip-zu-Welt-Verbinder ein. Montieren Sie die Lochrasterplatine auf den Mikroskopständer und verbinden Sie die Welt-zu-Chip-Verbinder an den Einlässen und Auslässen mit zusätzlichen Schläuchen.Unter Verwendung von standardmäßigen Viertelzoll-28-Gewindeverbindungen. Für ein 1/16-Zoll-Schlauchsystem verbinden Sie den mikrofluidischen Chip mit der Spritzenpumpe, computerkontrollierten Multiventil-Auswahlventilen, PC-gekoppelten Durchflussmessgeräten und Schläuchen, wie hier dargestellt und in Abbildung vier des begleitenden Textprotokolls beschrieben. Bevor die Trennung durchgeführt wird, füllen Sie die Reinigungsreagenzreservoirs und spülen Sie die entsprechenden Fluidleitungen vor. Stellen Sie außerdem die Ventile drei und vier an den Chip-Ausgängen so ein, dass die Flüssigkeit zunächst in die Abfallreservoirs fließt. Schalten Sie als Nächstes den Kühlventilator ein. Verbinden Sie die Leitungen der piezoelektrischen Keramik mit dem Leistungsverstärker und stellen Sie den Funktionsgenerator auf die Resonanzfrequenz des verwendeten akustischen Chips ein.Stellen Sie den Spannungssollwert am Funktionsgenerator so ein, dass der HF-Verstärker zwischen 12 und 25 Volt Spitze-zu-Spitze ausgibt, je nach gewünschter Trennung. Anschließend schließen Sie die geeigneten Sammelgefäße und das Pufferzulaufgefä&szlig; an das System an. Verwenden Sie den Probepuffer, der für die zu trennenden Zellen oder Partikel geeignet ist, oder wie er durch den nach der Trennung verwendeten Analyse-Test erforderlich ist.Laden Sie anschließend die Steuersoftware und verwenden Sie diese, um die Ventile, Durchflusssensoren und die Pumpe zur Durchführung der vollautomatischen Spül- und Trennprozedur zu steuern. Unmittelbar vor Beginn der Trennprozedur wirbeln Sie das Probenfläschchen kurz an, um eventuell abgesetzte Partikel erneut zu suspendieren. Alternativ pipettieren Sie die Probe 10-mal auf und ab, um biologische Proben, die durch Wirbeln leicht beschädigt oder verklumpt werden können, zu mischen.Befestigen Sie dann das Probenfläschchen an der Zuleitung und leiten Sie unverzüglich die Spülroutine und Trennprozedur ein. Beginnen Sie damit, mithilfe der Software den Luftzulauf der Ventile eins und zwei zu spülen, um sicherzustellen, dass sich keine Flüssigkeit in den Schläuchen befindet. Spülen Sie gleichzeitig die Schläuche, die das Puffer-Eingangsfläschchen mit Ventil zwei und das Proben-Eingangsfläschchen mit Ventil eins verbinden.Lassen Sie die Spritzenpumpe etwa 15 Mikroliter aus beiden Vials ziehen, um die Schläuche vollständig zu füllen, und verbinden Sie diese mit den Ventilen. Schalten Sie anschließend die Ventile eins und zwei auf Abfall, um überschüssige Flüssigkeit oder eingeschlossene Luft aus der Ladespule zu entfernen. Richten Sie danach das Programm zum Beladen der ProbenSpule ein, indem Sie zunächst 25 Mikroliter Luft mit einer Geschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Minute ansaugen.Danach 250 Mikroliter Probe mit 200 Mikrolitern pro Minute aufladen, gefolgt von 35 Mikrolitern Leitpuffer mit 200 Mikrolitern pro Minute und schließlich weiteren 25 Mikrolitern Luft mit 50 Mikrolitern pro Minute. Anschließend die Spritzenpumpen so einstellen, dass die geladenen Flüssigkeitssegmente mit 100 Mikrolitern pro Minute infundiert werden, und die Durchflussraten an den Auslässen für kleine und große Partikel mithilfe von Durchflusssensoren überwachen. Das geeignete Durchflussverhältnis kann wie in der begleitenden Textanleitung beschrieben bestimmt werden.Wenn die Durchflusssensoren einen Anstieg der Durchflussrate erkennen, der auf das Passieren der ersten Luftlücke hinweist, schalten Sie das entsprechende Auslassventil von der Abfallflasche auf eine Probenahmeflasche um. Stellen Sie anhand der Messwerte der Durchflusssensoren sicher, dass der Durchfluss stabil ist, während die Probe das Chip durchläuft und separiert wird. Während die Probe durch den Chip fließt, werden die getrennten Fraktionen an den Auslassventilen gesammelt.Am Ende des Probenstaus den Flusssensor beobachten und die zweite Luftlücke detektieren. Zu diesem Zeitpunkt die Auslassventile wieder auf Abfall umschalten. Nachdem das volle Volumen abgegeben wurde, die Spritzenpumpe stoppen und die Automatisierungsroutine beenden.Nach Abschluss des Trennversuchs die Sammelgefäße für die kleinen und großen Partikel trennen und zur anschließenden Analyse entsprechend lagern. Den Probennahmeschlauch in leere Gefäße sichern, um überschüssige Reinigungslösungen aufzufangen, die durch die Schläuche gespült werden. Anschließend die automatisierte Systemreinigungsroutine starten, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.Während dieses Vorgangs steuert das Programm die Ventile und die Spritzenpumpe, um die Haltespule nacheinander mit Reinigungsreagenzien zu beladen und diese durch das System zu spülen. Nach Abschluss des automatisierten Reinigungs- und Dekontaminationsvorgangs entsorgen Sie die überschüssigen Spüllösungen und die Gefäße, in denen sie gesammelt wurden, gemäß den geeigneten Verfahren für die Entsorgung biologischer oder chemischer Abfälle. Hier ist ein repräsentativer Frequenzscan von einem gut gekoppelten Piezo- und mikrofluidischen Gerät dargestellt.Wenn die Kopplung zwischen dem Piezo und dem mikrofluidischen Gerät gut ist, fokussieren sich die Partikel bei der Resonanzfrequenz stark, was zu einem deutlichen Peak in der Fluoreszenzintensität und einer Migration in die erwartete Fokussierposition führt. Im Gegensatz dazu fokussieren sich Partikel bei schlechter Kopplung nicht gut, und das Gerät ist ungeeignet, wenn eine hochwertige Fokussierung oder eine schnelle Strömung für die gewünschte Anwendung entscheidend sind. Jede Linie in diesem Diagramm stellt Trennungsergebnisse unter Verwendung verschiedener Polystyrol-Partikelgrößen und Piezo-Ansteuerspannungen dar.Im Allgemeinen sind höhere Spannungen erforderlich, um kleinere Partikel zu extrahieren. Trockene Spannungen können jedoch nicht beliebig erhöht werden, da die Wärmeabgabe größer wird und die Effekte des akustischen Strömungsverhaltens zunehmen. Um die Eignung dieser Plattform für die Trennung biologischer Partikel zu demonstrieren, wurden humane Raji-Zellen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von acht bis 10 Mikrometern mit dem Dengue-Virus, das einen ungefähren Durchmesser von 50 Nanometern aufweist, versetzt und anschließend mithilfe der akustischen mikrofluidischen Vorrichtung getrennt.Wenn ein solches System einmal zusammengebaut und programmiert ist, können Trennungen routinemäßig in etwa fünf Minuten durchgeführt werden. Etwa drei Proben pro Stunde können mit vollständiger Reinigung und Entkontaminierung zwischen den Proben verarbeitet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zellzählung, Western Blotting oder Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt werden, um die Reinheit der Trennung zu bestätigen und die biologische Bedeutung aufzuklären.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein typisches mikrofluidisches Trenngerät herstellt. Verwenden Sie World-to-Chip-Verbindungen, um mit der Hardware zu kommunizieren und ein automatisiertes Trennverfahren präzise und robust durchzuführen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit infektiösen Materialien äußerst gefährlich sein kann und nur von entsprechend geschultem Personal unter Verwendung der institutionell vorgeschriebenen Ausrüstung und Verfahren für den biologischen Sicherheitsstandard durchgeführt werden darf.

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Quelle: Choi, H. J., et al. Mikrofluidische Akustophorese zur Durchflusstrennung von gramnegativen Bakterien mit Hilfe von Aptamer-Affinitätsperlen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Methode zur selektiven Trennung von gramnegativen Bakterien aus einer gemischten Bakterienprobe unter Verwendung von Aptamer-beschichteten Mikrokügelchen und akustischen Kräften innerhalb eines mikrofluidischen Chips.

Aptamer-assistierte Akustophorese zur mikrofluidischen Trennung gramnegativer Bakterien

In diesem Video beschreiben wir zunächst Fertigung und Operationsverfahren eines akustischen Oberflächenwellen (SAW) akustische Gegenstrom-Gerät. Wir zeigen dann einen Versuchsaufbau, der sowohl für qualitative und quantitative Visualisierung Flow Analyse von komplexen Strömungen innerhalb des SAW Pumpen Gerät ermöglicht.

Fabrication, Operation and Flow Visualization in Oberflächenschallwellen-wave-driven Acoustic-Gegenstrom Mikrofluidik

In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Hier demonstrieren wir eine einfache Produktionsmethode für größensteuerbare, monodisperse Wasser-in-Öl (W/O) Mikrotröpfchen unter Verwendung eines kapillarbasierten zentrifugalen mikrofluidischen Geräts. Diese Methode benötigt nur ein geringes Probenvolumen und ermöglicht eine Produktion mit hoher Ausbeute. Wir gehen davon aus, dass diese Methode für schnelle biochemische und zelluläre Analysen nützlich sein wird.

Kapillar-basierten Kreisel Mikrofluidik-Vorrichtung zur Größe steuerbare Bildung von monodispersen Mikrotröpfchen

Acoustofluidic Geräte verwenden Ultraschallwellen in mikrofluidischen Kanälen zu manipulieren, zu konzentrieren und suspendierten Mikro- und nanoskopische Einheiten zu isolieren. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und den Betrieb einer solchen Vorrichtung bulk acoustic stehenden Wellen tragenden Teilchen in einem zentralen Strömungslinie zu konzentrieren, ohne die Hilfe von Mantelflüssigkeiten.

Herstellung und Betrieb von Acoustofluidic Devices Unterstützung Bulk-Acoustic-Standing Waves für sheathless Fokussierung der Partikel

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung einzelner Zellen mit einer mikrofluidischen Plattform, die ein neues Mikrotiter-Designkonzept verwendet, um eine hocheffiziente Einzelzellisolierung und eine langfristige klonale Kultur zu ermöglichen.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Wir zeigen, eine mikrofluidische Plattform mit einem Elektrodennetz integriert Oberfläche, die resistive Pulserfassungs kombiniert (RPS) mit Codemultiplex-Vielfachzugriff (CDMA), Auffinden und Ausmessen von Partikeln in mehrere mikrofluidische Kanäle zu multiplexen.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Ein Protokoll für die Manipulation der Mikropartikel in einem mikrofluidischen Kanal mit einem Zweifrequenz-Erregung wird vorgestellt.

Mikropartikel Manipulation durch ständigen akustischen Oberflächenwellen mit Zweifrequenz-Erregungen

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und Betrieb eines kostengünstigen akustofluidischen Geräts für die schnelle molekulare Abgabe an Zellen durch Sonoporation, die durch Ultraschallkontrastmittel induziert wird.

Aufbau und Betrieb eines akustofluidischen Geräts zur verbesserten Abgabe molekularer Verbindungen an Zellen

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung und den Betrieb von mikrofluidischen akustophoretischen Chips unter Verwendung der mikrofluidischen Akustophorese-Technik und Aptamer-modifizierten Mikroperlen, die zur schnellen und effizienten Isolierung gramnegativer Bakterien aus einem Medium verwendet werden können.

Mikrofluidische Akustophorese zur Durchflusstrennung gramnegativer Bakterien mittels Aptamer Affinity Beads

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine pneumatische mikrofluidische Plattform, die für eine effiziente Mikropartikelkonzentration verwendet werden kann.

Pneumatisch angetriebene mikrofluidische Plattform für die Mikropartikelkonzentration

Erfahren Sie die automatisierte Partikeltrennung in kleinen Volumina mit einer akustischen Mikrofluidik-Plattform. Diese Methode ermöglicht präzise biomedizinische Probenverarbeitung ohne Verlust von Analyten.

Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice (Video) | JoVE Journal

Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

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