Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, automatisierte Partikeltrennungen mit kleinen Volumen mit Hilfe eines mikrofluidischen photischen Geräts durchzuführen. Diese Methode kann Schlüsselverfahren im Bereich der Biomedizintechnik ermöglichen, einschließlich der robusten Verarbeitung und Trennung von Proben für den Bionachweis und klinische Forschungsanwendungen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind Modularität, Präzision, Robustheit und Automatisierung, wodurch sie nicht nur für die retische Trennung, sondern auch für eine Vielzahl von Strömungen durch mikrofluidische Trennvorrichtungen anpassungsfähig und flexibel ist.

Wir erkannten zuerst die Notwendigkeit dieser Fähigkeit, um routinemäßig und zuverlässig Trennungen an biologischen Probenvolumina im Submillimeterbereich durchzuführen, ohne dass es zu einer signifikanten Verdünnung oder einem signifikanten Verlust des Analyten kommt. Die Integration der Probendosierung und des automatisierten Routings von der Quelle zu den Entnahmedateien zusammen mit dem Standardbetrieb der Spritzenpumpen ist entscheidend für die erfolgreiche Arbeit in dieser Größenordnung. Beginnen Sie mit dem Entwurf des akustischen Retikgeräts und des Layouts für die beiden Fotomasken, wie im ersten Abschnitt des begleitenden Textprotokolls beschrieben.

Strukturieren Sie dann die Fluidanschlüsse auf der Rückseite auf einem doppelseitig polierten 1 0 0 Siliziumwafer. Mit Standard-Positivlack-Photolithographie Ätzen Sie diese Geometrie durch tiefes reaktives Ionenätzen bis zu einer Tiefe von 350 bis 400 Mikrometern. Drehen Sie als Nächstes den Wafer um und modellieren Sie die Geometrie des Fluidkanals auf der Vorderseite.

Auch hier wird die Standard-Positivlack-Photolithographie verwendet, und montieren Sie dann den strukturierten Wafer auf einen zweiten leeren Silizium-Trägerwafer. Ätzen Sie nun mit Fotolack die belichteten Kanäle bis zu einer Tiefe von 200 Mikrometern. Weichen Sie den Bauteilwafer mit Hilfe des Tiefenreaktionsionenätzens in einer Resist-Stripping-Lösung ein, um ihn vom blanken Siliziumwafer zu lösen.

Reinigen Sie als Nächstes den Gerätewafer und einen strukturlosen, 0,5 Millimeter dicken Boro-Silikatglaswafer mit Piranha-Lösung. Versiegeln Sie nach der Reinigung die Kanäle, die das Glas und den Siliziumwafer ionisch verbinden, unter den hier gezeigten Bedingungen. Zum Schluss schneiden Sie die einzelnen Späne mit einer Diamanttrennscheibe auf einer Würfelsäge aus einem Zweikomponenten-Epoxidharz-Kit mit niedriger Viskosität auseinander.

Wiegen Sie das empfohlene Verhältnis beider Komponenten ab und mischen Sie sie gründlich. Legen Sie dann die Blei-, Zirkin-, Acht-Titanat- oder PCT-Piezokeramik in eine geeignete Vorrichtung und verteilen Sie mit einer Pipette etwa 10 Mikroliter des Epoxidgemisches gleichmäßig darauf, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu erhalten. Platzieren Sie als Nächstes den Chip in der Vorrichtung und richten Sie die Epoxidseite der Pizo-Keramik mit dem mikrofluidischen Chip aus.

Es kann erforderlich sein, den Chip mit Klebeband festzuheften, um ihn beim Ausrichten an Ort und Stelle zu halten. Klemmen Sie die Baugruppe in einen Schraubstock und achten Sie darauf, dass keines der Komponenten reißt und die Temperatur und Dauer aushärtet, die vom Epoxidhersteller empfohlen werden. Nachdem das Epoxidharz ausgehärtet ist, befestige mit einem Lötkolben mit feiner Spitze feine Drahtkabel an jeder Seite der Pizo-Keramik.

Verwenden Sie bei Bedarf das entsprechende Flussmittel, um die Pizo-Oberfläche vorzubereiten. Achten Sie darauf, den Pizo so kurz wie möglich zu berühren, um eine thermische Depolarisation zu vermeiden. Befestigen Sie den Chip mit Hilfe von Klemmvorrichtungen an einem fluidischen Steckbrett.

Befestigen Sie außerdem einen Lüfter an dem Steckbrett, um die Temperatur während akustischer Experimente zu regulieren. Schrauben Sie als Nächstes den Chip an die Weltanschlüsse an. Montieren Sie das Steckbrett auf dem Mikroskoptisch und verbinden Sie die Welt mit Chip-Anschlüssen an zusätzlichen Schläuchen an den Ein- und Ausgängen.

Unter Verwendung von Standard-Gewindeverschraubungen mit Viertel-28. Für einen 16. Zoll Schlauch verbinden Sie den Mikrofluidik-Chip mit der Spritzenpumpe, den computergesteuerten Mehrwege-Auswahlventilen, den PC-verbundenen Durchflussmessern und den Schläuchen, wie hier gezeigt und in Abbildung vier des begleitenden Textprotokolls beschrieben. Füllen Sie vor dem Ausführen der Trennung die Reinigungsreagenzbehälter und entleeren Sie die entsprechenden Flüssigkeitsleitungen.

Stellen Sie außerdem die Ventile drei und vier an den Späneauslässen so ein, dass sie zunächst zu den Abfallbehältern fließen. Schalten Sie anschließend den Lüfter ein. Schließen Sie die pizo-Keramikkabel an die Endstufe an und stellen Sie den Funktionsgenerator auf die Resonanzfrequenz des verwendeten Akustikchips ein.

Stellen Sie den Spannungssollwert am Funktionsgenerator so ein, dass der HF-Verstärker zwischen 12 und 25 Volt Spitze zu Spitze ausgibt, je nach gewünschtem Abstand. Schließen Sie dann die entsprechenden Auffangfläschchen und das Puffereingangsfläschchen an das System an. Verwenden Sie den Probenpuffer, der für die zu trennenden Zellen oder Partikel geeignet ist oder wie es der Analyseassay erfordert, der nach der Trennung verwendet werden soll.

Laden Sie als Nächstes die Steuerungssoftware und verwenden Sie sie, um die Ventile, Durchflusssensoren und die Pumpe zu steuern, um die vollautomatische Ansaug- und Trennroutine durchzuführen. Unmittelbar vor Beginn des Trennvorgangs das Probenfläschchen kurz vortexen, um eventuell abgesetzte Partikel wieder zu suspendieren. Alternativ können Sie die Probe 10 Mal auf und ab pipettieren, um biologische Proben zu mischen, die anfälliger für Beschädigungen oder Verklumpungen durch Vortexen sind.

Schließen Sie dann das Probenfläschchen an die Eingangsleitung an und starten Sie unverzüglich die Prime- und Trennroutine. Beginnen Sie damit, die Software zu verwenden, um den Lufteinlass der Ventile eins und zwei zu entlüften, um sicherzustellen, dass der Schlauch keine Flüssigkeit enthält. Entlüften Sie gleichzeitig den Schlauch, der das Puffereingangsfläschchen mit dem zweiten Ventil und das Probeneingangsfläschchen mit dem ersten Ventil verbindet.

Lassen Sie die Spritzenpumpe etwa 15 Mikroliter aus beiden Durchstechflaschen entnehmen, um die Schläuche vollständig zu füllen und sie mit den Ventilen zu verbinden. Schalten Sie schließlich die Ventile eins und zwei auf Abfall, um überschüssige Flüssigkeit oder Luft, die in die Ladespule eingedrungen ist, auszustoßen. Richten Sie als Nächstes das Programm so ein, dass die Probenspule geladen wird, indem Sie zunächst 25 Mikroliter Luft mit 50 Mikrolitern pro Minute absaugen.

Dann werden 250 Mikroliter Probe mit 200 Mikrolitern pro Minute geladen, gefolgt von 35 Mikrolitern Bleipuffer mit 200 Mikrolitern pro Minute und schließlich weitere 25 Mikroliter Luft mit 50 Mikrolitern pro Minute. Stellen Sie dann die Spritzenpumpen so ein, dass sie die geladenen Flüssigkeitsstopfen mit 100 Mikrolitern pro Minute infundieren und überwachen Sie die Durchflussraten an den kleinen und großen Partikelauslässen mit Durchflusssensoren. Das geeignete Durchflussverhältnis kann wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben bestimmt werden.

Wenn die Durchflusssensoren einen Anstieg der Durchflussrate erkennen, der den Durchgang des ersten Luftspalts anzeigt, schalten Sie das entsprechende Ausgangsventil vom Abfallfläschchen auf ein Probenentnahmefläschchen. Stellen Sie sicher, dass der Durchfluss stabil ist, während die Probe den Chip durchläuft und durch Beobachtung der Durchflusssensormesswerte getrennt wird. Während die Probe den Chip passiert, werden die abgeschiedenen Fraktionen an den Auslassventilen gesammelt.

Beobachten Sie am Ende des Probenstopfens den Durchflusssensor und erkennen Sie den zweiten Luftspalt. Schalten Sie zu diesem Zeitpunkt die Ausgangsröhren wieder auf Abfall. Nachdem das volle Volumen abgegeben wurde, stoppen Sie die Infusion der Spritzenpumpe und beenden Sie die Automatisierungsroutine.

Trennen Sie nach Abschluss des Trennexperiments die kleinen und großen Probenentnahmefläschchen für kleine und große Partikelproben und lagern Sie sie für die nachfolgende Analyse entsprechend. Sichern Sie das Probenaufnahmeröhrchen in leeren Fläschchen, um überschüssige Reinigungslösungen aufzufangen, die durch die Röhrchen gespült werden. Starten Sie dann die automatisierte Systemreinigungsroutine, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben.

Während dieses Prozesses steuert das Programm die Ventile und die Spritzenpumpe, um die Halteschlange nacheinander mit Reinigungsreagenzien zu beladen und durch das System zu spülen. Sobald der automatisierte Reinigungs- und Dekontaminationsprozess abgeschlossen ist, entsorgen Sie die überschüssigen Spüllösungen und die Fläschchen, in denen sie sich angesammelt haben, indem Sie geeignete Verfahren für den Umgang mit biologischen oder chemischen Abfällen befolgen. Hier ist ein repräsentativer Frequenzscan von einem gut gekoppelten Pizo- und Mikrofluidikgerät gezeigt.

Wenn die Kopplung zwischen dem Pizo und dem mikrofluidischen Gerät gut ist, fokussieren die Partikel eng auf die Resonanzfrequenz, was zu einem deutlichen Peak in der Fluoreszenzintensität und einer Migration in die erwartete Fokussierungsposition führt. Im Gegensatz dazu werden bei schlechter Kopplung die Partikel nicht gut fokussiert und das Gerät ist ungeeignet, wenn eine qualitativ hochwertige Fokussierung oder eine schnelle Strömung für die erforderliche Anwendung entscheidend sind. Jede Linie in diesem Diagramm stellt die Trennergebnisse unter Verwendung verschiedener Polystyrol-Partikelgrößen und Pizo-Treiberspannungen dar.

In der Regel sind höhere Spannungen erforderlich, um kleinere Partikel abzusaugen. Trockenspannungen können jedoch aufgrund der größeren Wärmeableitung und der zunehmenden Auswirkungen der akustischen Strömung nicht unbegrenzt erhöht werden. Um den Nutzen dieser Plattform für die biologische Partikeltrennung zu demonstrieren, wurden menschliche Raji-Zellen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von acht bis 10 Mikrometern mit Dengue-Viren mit einem Durchmesser von etwa 50 Nanometern aufgespießt und dann mit dem akustischen Mikrofluidikgerät getrennt.

Sobald ein solches System zusammengebaut und programmiert ist, können Trennungen routinemäßig in etwa fünf Minuten durchgeführt werden. Etwa drei Proben pro Stunde können verarbeitet werden, wobei zwischen den Proben eine vollständige Reinigung und Dekontamination durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zellzählung, Western Blotting oder Next Generation Sequencing durchgeführt werden, um die Reinheit der Trennung zu bestätigen und die biologische Bedeutung aufzuklären.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein typisches mikrofluidisches Trenngerät herstellt. Nutzen Sie World-to-Chip-Verbindungen, um eine Schnittstelle zur Hardware herzustellen und ein automatisiertes Trennverfahren präzise und robust durchzuführen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infektiösen Materialien äußerst gefährlich sein kann und nur von entsprechend geschultem Personal unter Verwendung der entsprechenden institutionell vorgeschriebenen Geräte und Verfahren für die biologische Sicherheit durchgeführt werden darf.