Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in de membraaneigenschappen van olfactorische sensorische neuronen te meten als reactie op geurstimuli. Dit wordt bereikt door eerst het olfactorische epitheel te dissekeren en over te brengen naar een perfusiekamer. De tweede stap is het lokaliseren en selecteren van een OSN van belang onder de microscoop.

De dendritische knobbel van de gekozen OSN wordt vervolgens via patch-clamp gefixeerd en geanalyseerd terwijl deze wordt gestimuleerd met geurstoffen. Uiteindelijk karakteriseert geperforeerde patch-clamp van OSN dendritische knobbels de functionele eigenschappen van de OSN op membraanniveau. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de olfactie, zoals het registreren van olfactorische sensorische neuronen die gedefinieerde geurreceptoren tot expressie brengen, evenals patch-clamp registraties.

Verstrek informatie over de membraaneigenschappen van deze neuronen. Bereid de stimulerende pipetten voor uit glas van één millimeter of koop ze voorgestrokken met een vlam. Buig zes pipetten ongeveer één centimeter vanaf de punt in een hoek van 45 graden.

Plaats vervolgens de zes gebogen pipetpunten rond een zevende rechte pipet, waarbij een oogje als gids dient, en wikkel deze in krimpkous. Verwarm de krimpkous aan het andere uiteinde van de pipetten. Breng extra krimpkous aan.

Hiermee wordt een stimulerende pipet met zeven kanalen gemaakt. Trek nu de stimulerende pipet met zeven kanalen uit met behulp van een meerkanaals polar puller. Versterk de assemblage na het trekken met wat witte lijm rond het oogje.

Laat de lijm vervolgens een nacht drogen voordat de benodigde oplossingen worden toegevoegd. De Nystatine-oplossing moet vers worden bereid vlak voor gebruik. Weeg bij behoefte 3 mg Nystatine af en voeg dit toe aan 50 µL DMSO.

Vortex vervolgens het mengsel gedurende 20 seconden. Sonicate daarna het mengsel gedurende twee tot drie minuten om een volledige verdunning te garanderen. Voeg nu 20 µL van het mengsel toe aan vijf milliliter intracellulaire voorraadoplossing.

Vortex de mix gedurende 20 seconden, gevolgd door twee tot drie minuten sonicatie. Koel de werkoplossing vervolgens op ijs en bewaar deze lichtafgeschermd. Op deze manier blijft de werkoplossing enkele uren houdbaar.

Vul een spuit uitgerust met een microfilm met de werkopleossing. Deze is een uur lang bruikbaar nadat deze is klaargemaakt. Bewaar de gevulde spuit echter op ijs.

Trek nu enkele registratie-elektroden met lange halzen en openingen van twee micron. Het doel is om een weerstand van 15 tot 20 mega ohm te verkrijgen zodra ze zijn gevuld met Nystatine-oplossing. Vul tenslotte de stimuleringspipet met geurstof verdund in Ringer-oplossing.

Zorg dat er voor dit protocol muizen beschikbaar zijn in de leeftijd van twee tot vier weken. In deze presentatie worden muizen gebruikt die or IRES tau GFP tot expressie brengen door gebruik te maken van or IS tau GFP-muizen. Alle neuronen die de or van belang tot expressie brengen, zullen worden gelabeld met GFP.

Deze methode kan worden gebruikt voor of uitgedrukt in alle zones. Echter zullen dissecties en opnames eenvoudiger zijn voor OR's die in de dorsale zone tot expressie komen. Begin met het anesthetiseren en vervolgens het onthoofden van een muis.

Het resultaat van dit protocol is afhankelijk van de kwaliteit van de dissectie. Deze dissectiestappen moeten zo kort mogelijk en nauwkeurig zijn. Om de operatie te beginnen, gebruikt u dissectiescharen om een longitudinale snede langs het dorsum te maken.

Trek de huid uit elkaar om deze te verwijderen. Snijd vervolgens langs de onderkaak en maak een coronale snede parallel aan de tanden. Verwijder zo de bovenste snijtanden.

Maak nu een coronale doorsnede rond de kop, achter de ogen, gooi het posterieure deel van de kop weg en breng het anterieure gedeelte over naar ijskoude Ringer-oplossing. Isoleer nu onder een dissectiemicroscoop het septum binnen vijf tot 10 minuten. Begin met een longitudinale incisie langs de ventrale zijde.

Snijd vervolgens de dorsale beenderen longitudinaal langs de dorsolaterale zijde van de neusholte. Verwijder daarna het grootste deel van de beenderen en het palatum. Overbreng het geïsoleerde septum en het vastgehechte epitheel naar een container met gezuursde Ringers-oplossing bij kamertemperatuur.

Maak binnen vijf minuten de laatste voorbereidingen voordat u begint met de registratie. De oplossing mag niet te warm zijn, anders zal de preparaat er beschadigd uitzien. Om toegang te krijgen tot het neuro-epitheel voor de registratie.

Pel eerst het epitheel van het onderliggende septum met een pincet. Knip vervolgens met micro-Vanna scharen het voorste uiteinde van het septum door om het epitheel los te maken. Verwijder nu voorzichtig het vomeronasale orgaan.

Snijd het los op de plek waar het dorsaal is bevestigd. Het geïsoleerde epitheel kan nu naar de registratiekamer worden verplaatst met de slijmzijde naar boven. Gebruik een harp om het weefsel plat te drukken zodra het op zijn plaats ligt.

Kamer de kamer vervolgens over naar een rechtopstaande microscoop. Visualiseer het neuro-epitheel onder een 40 x waterimmersie-objectief terwijl het continu wordt geperfundeerd met verse ringersoplossing bij kamertemperatuur. Begin met het zoeken naar de cellen van belang, die in dit geval EGFP tot expressie brengen, waarbij licht van 480 nanometer wordt gebruikt om te scannen naar cellen die licht emitteren in het bereik van 530 tot 550 nanometer.

De doelorgaan dendritic knobs en osn moeten, wanneer ze bij 80 tot 160 x onder helderveldverlichting worden bekeken, duidelijk te onderscheiden zijn van de ondersteunende cellen. Vul de elektrode nu met een S statin-oplossing. Tik eventuele luchtbellen die ontstaan eruit en bevestig de elektrode aan de houder.

Breng nu enige positieve druk aan. De verwachte weerstand ligt tussen 15 en 20 mega ohm. Breng vervolgens de elektrode naar de cel terwijl de positieve druk gehandhaafd blijft.

Wanneer de weerstand stijgt tot ongeveer 40 mega ohm, laat dan de druk los en breng een lichte negatieve druk aan. Als er een giga-seal is gevormd, moet het membraanpotentiaal worden geklemd op ongeveer negatief 75 millivolt. Nu de cel open is, kan er met het experiment worden voortgegaan.

Pas stimulatie, protocollen en perfusie met farmacologische behandelingen toe waar nodig om te testen met een enkele geurstof. Registreer 200 tot 500 milliseconden aan spontane activiteit. Dien de geurstof gedurende 500 milliseconden toe en meet vervolgens de responsen gedurende maximaal 10 seconden volgens het beschreven protocol.

MOR 23-expresserende neuronen, gelabeld met EGFP, werden gepatcht en gestimuleerd met verschillende concentraties al. In de current clamp-modus is lyal een ligand voor MOR 23. Alternatief werden de cellen gesimuleerd in de voltage clamp-modus.

Bij opnames in voltage-clampmodus werden verschillende kenmerken gemonitord. Om de respons te kwantificeren, zoals klassiek in de elektrofysiologie gebeurt met behulp van de maximale amplituderespons, werd de dosis-responscurve uitgezet met de Hill-vergelijking. Deze resultaten geven informatie over de coderingseigenschappen van elke OSN, waaronder de detectiedrempel, de temporele dynamiek, het dynamisch bereik en het verzadigingsniveau.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan het dissectiegedeelte binnen 10 tot 15 minuten worden voltooid. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de functionele eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen die specifieke geurreceptoren tot expressie brengen in muizen kunt onderzoeken.