Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neurale Stammzellen aus der paraventrikulären Region der adulten Ratte oder des menschlichen Rückenmarks zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Rückenmark mittels Laminektomie entnommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Rückenmark quer in ein Zentimeter große Segmente zu schneiden und die paraventrikuläre Region von jedem Segment des Rückenmarks zu präparieren.

Anschließend wird das zerkleinerte Gewebe in einen Millimeter große Stücke geschnitten und anschließend enzymatisch dissoziiert. Der letzte Schritt besteht darin, intakte Zellen durch Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Dichtegradienten zu trennen und die Zellsuspension zu plattieren. Letztendlich können die Bildung der Neurosphäre und das Wachstum von Neurostammzellen mit Hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht werden.

Heute zeige ich, wie man neurale Stammzellen aus der paraventrikulären Region des Rückenmarks der adulten Ratte isoliert. Diese Zellen können dann verwendet werden, um wichtige Fragen im Bereich der neuralen Stammzellen zu beantworten, z. B. welche exogenen Faktoren die Einschränkung der Abstammungslinie fördern oder wie diese Zellen auf verschiedene Reize oder Stress reagieren. Bereiten Sie zunächst die Kultur-, Medien- und Sezierpuffer vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Sterilisieren Sie anschließend nach einer Überdosis Betäubungsmittel die Haut der Ratte und verwenden Sie eine große Präparierschere, um die Rückenfläche zu entfernen und die Wirbelsäule freizulegen. Halten Sie die Präparierschere senkrecht zur Rückenfläche und quer. Schneiden Sie die Wirbelsäule über den Hintergliedmaßen durch.

Schneiden Sie dann mit einer kleineren Schere den über der Wirbelsäule liegenden Rückenmuskel in rostraler Richtung in Längsrichtung ab, um die Dornfortsätze beginnend am freiliegenden Coddle freizulegen. Führen Sie ein kleines stumpfes Knochenschneidinstrument extraoral in die laterale Seite des Wirbelkanals in den Raum zwischen Rückenmark und Wirbelsäule ein. Platzieren Sie die Klinge flach und parallel zur Schnur.

Machen Sie dann kleine Schnitte in die Lamina und schälen Sie die Lamina vorsichtig ab, um das Rückenmark freizulegen. Dieser Winkel verhindert eine Schädigung des darunter liegenden Rückenmarks. Fahren Sie fort, die Lamina in rostraler Richtung zu entfernen.

Um das thorakale und zervikale Rückenmark mit einer stumpfen Gewebezange freizulegen, heben Sie das Rückenmark vorsichtig von der Wirbelsäule an und durchtrennen Sie die Wurzeln mit einer Mikroschere. Um das Rückenmark zu lösen, legen Sie das herausgeschnittene Rückenmark in eine Petrischale mit eiskaltem, sterilem Rattendissektionspuffer. Spülen Sie das Gewebe mit dem eiskalten Präparierpuffer aus und schneiden Sie das Rückenmark mit einer Schere quer in einen Zentimeter großen Segment. Verwenden Sie für jedes Gewebesegment eine feine Pinzette, um das Gewebe mit einer Hand zu halten, und verwenden Sie mit der anderen Hand eine Mikroschere, um die weiße Substanz zusammen mit dem größten Teil der grauen Substanz vorsichtig zu entfernen, so dass nur die periventrikuläre Region des Rückenmarks übrig bleibt.

Ziehen Sie das präparierte periventrikuläre Gewebe in eine 10 Zentimeter sterile Petrischale, die eiskalten Rattendissektionspuffer enthält. Um mit der Isolierung von neuralen Stammzellen von Ratten zu beginnen, zerkleinern Sie das präparierte Gewebe pro Ventrikel mit einer Mikroschere in ein Kubikmillimeter große Stücke. Bereiten Sie als Nächstes den enzymatischen Dissoziationspuffer vor, indem Sie zunächst fünf Milliliter Earls ausgewogene Salzlösung in ein Fläschchen Papain aus einem Papain-Dissoziationskit geben.

Stellen Sie das Fläschchen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf, so dass sich das Papain vollständig aufgelöst hat und die Lösung klar erscheint. Geben Sie als Nächstes 500 Mikroliter Earls ausgewogene Salzlösung in das Fläschchen mit DNAs aus dem Dissoziationskit. Und vorsichtig mischen, 250 Mikroliter der DNA-Lösung in das Fläschchen mit Papain geben und vorsichtig mischen.

Geben Sie dann das gehackte Gewebe etwa 0,2 Gramm in das Fläschchen und stellen Sie das Fläschchen für 45 Minuten bis eine Stunde bei 37 Grad Celsius auf eine Wippplattform. Nach der Inkubation wird die Mischung mit einer 10-Milliliter-Pipette tri bewertet, um alle verbleibenden Gewebestücke zu dissoziieren und eine trübe Zellsuspension zu erhalten. Die Zellsuspension in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführen und fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugieren.

Bereiten Sie die OVO-Moid-Lösung bei Raumtemperatur während der Zentrifugation vor, indem Sie 2,7 Milliliter Earl's Balance Salzlösung mit 300 Mikrolitern der rekonstituierten Albumin-OVO-MOID-Inhibitorlösung mischen. In einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen werden 150 Mikroliter der zuvor hergestellten DNA-Lösung zu der ovalen Dicksaftlösung hinzugefügt und durch Umdrehen des Röhrchens gemischt, der Überstand aus den pelletierten Zellen verworfen und das Zellpellet in der verdünnten DNA-Albumin-Inhibitor-Mischung sofort wieder aufgehängt. Als nächstes bereiten Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten vor, indem Sie fünf Milliliter Albumininhibitorlösung in ein 15-Milliliter-Röhrchen geben und mit einer Fünf-Milliliter-Pipette die Zellsuspension vorsichtig und langsam auf die Albumininhibitorlösung schichten.

Zentrifugieren Sie die Probe bei 70 g sechs Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn alles fertig ist, verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter vorwarmem Ratten-EFH-Medium, das wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben hergestellt wird. Zählen Sie die Dichte lebender Zellen mit einem Hämozytometer und plättieren Sie die Zellen in einen T 25-Kulturkolben mit einer Dichte von 10 Zellen pro Mikroliter in EFH.

Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid und lassen Sie die Kulturen eine Woche lang ungestört wachsen, um eine Ansammlung von Kugeln zu vermeiden. Hier ist ein Querschnitt des Rückenmarks der Ratte zu sehen, der mit Luxal Fast Blue sowie Hämatin und Eoin gefärbt wurde, um die Grenzen zwischen weißer und grauer Substanz zu zeigen. Der gestrichelte Umriss kennzeichnet das präparierte verbleibende periventrikuläre Gewebe, das in diesem Protokoll aus dieser Region isoliert wurde.

Neurosphären, wie die hier gezeigten, wachsen in Suspensionskultur bei hoher Vergrößerung frei schwebend. Es sind Mikro-Spikes zu sehen, die aus den Neurosphären herausragen, Neurosphären proliferieren, wie die KI 67-Positivfärbung zeigt, bei der Neurosphären dissoziiert und auf Matrigel-beschichteten Vertiefungen plattiert wurden. Darüber hinaus exprimieren sie hauptsächlich Nester, in denen sich ein Marker für neuronale Vorläuferzellen befindet.

Nach diesem Verfahren können den kultivierten Zellen exogene Faktoren zugesetzt werden, um die Differenzierung zu fördern. Die adulten neuralen Stammzellen oder ihre Nachkommen können auch in verschiedene Tiermodelle transplantiert werden, um ihre Fähigkeit zur regenerativen Reparatur zu beurteilen. Ich hoffe, Sie finden dieses Video nützlich und viel Glück bei Ihren Experimenten.