Name: Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Lernen Sie die Isolierung neuraler Stamm-/Vorläuferzellen aus der periventrikulären Region des erwachsenen Rückenmarks von Ratte und Mensch. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von Neurosphären für die regenerative Medizinforschung.

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Die Autoren möchten sich für die Unterstützung von Spinal Cord Injury Ontario, dem Ontario-China Research and Innovation Fund, der Toronto General and Western Hospital Foundation und der Physicians' Services Incorporated Foundation bedanken. Die Autoren danken Dr. Tasneem Zahir für ihre fachkundige Beratung in der NSPC-Kultur des menschlichen Rückenmarks und Dr. Cindi Morshead und Dr. Iris Kulbatski für ihre fachkundige Beratung bei der NSPC-Isolierung des Rückenmarks von Ratten.

Alle Tierverfahren werden von der Animal Care Committee der Universität Health Network, Toronto ON Kanada zugelassen, in Übereinstimmung mit den Richtlinien im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durch die Canadian Council on Animal Care vorbereitet etabliert. Für die Ernte der menschlichen Rückenmarksgewebe, wurde die Genehmigung der University Health Network Research Ethics Verwaltungsrat und von der Trillium-Gift of Life Foundation, die Organspende in Ontario, Kanada beaufsichtigt erhalten. 1. Herstellung von Dissection Puffer und Kultur Medien <ol><li> Für die Isolierung von Rattenrückenmark, bereiten 100 ml Dissektion Puffer (1x PBS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) und im Kühlschrank lagern. Für den menschlichen Rückenmark vorbereiten 100 ml Dissektion Puffer (1x HBSS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) und im Kühlschrank lagern. </li><li> Vorbereitung 100 ml serumfreies Medium (SFM) und warm bei 37 ° C. Um SFM vorzubereiten, fügen Sie 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml Penicillin-Streptomycin, 2% B27 und 10% Hormon Mix Neurobasal-A-Medium. Hormon-Mix anzusetzen, stellen eine 1: 1 DMEM / F12-Medium, das 0,6% Glucose, 3 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, 25 ug / ml Insulin, 100 ug / ml Apo-Transferrin, 10 &amp; mgr; M Putrescin, 30 nM Selen, und 20 nM Progesteron. </li><li> Bereiten Sie die EFH Wachstumsfaktor-angereicherten Plattenmedien (zum SFM mit 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF und 2 ug / ml Heparin) und warm bei 37 ° C. Stellen Sie sicher, dass die menschliche EFH enthält humanen rekombinanten Wachstumsfaktoren (siehe Tabelle der Materialien). </li></ol> 2. Holzernte und Dissektion der erwachsenen Ratte Periventrikuläre Rückenmarksgewebe <ol><li> Sterilisieren Sezieren Instrumente in Ethanol und spülen in steriler Kochsalzlösung oder Autoklav Instrumente im Voraus. Geben rat (6-8 Wochen alt) eine tödliche Injektion von Natriumpentobarbital (1 cc bei 65 mg / ml) oder Überdosierung von Narkose (dh 4% Isofluran) nach einem Institut des genehmigten Tier Protokoll. DOuse die Rückseite der Ratte mit 70% Ethanol und entfernen Sie die Haut an der dorsalen Oberfläche mit großen Dissektion Schere. </li><li> Halten der Schere senkrecht zur dorsalen Fläche quer geschnitten die Wirbelsäule über die Hinterbeine. Verwenden Sie kleinere Schere längs geschnitten die Rückenmuskel über der Wirbelsäule in einem rostral Richtung, um die Dornfortsätze aus. </li><li> Beginnend an der exponierten kaudalen Ende, legen Sie Rongeure oder eine kleine stumpfe Knochenschneidinstrument extradural in der lateralen Seite des Spinalkanals in den Raum zwischen dem Rückenmark und Wirbelsäule. Machen Sie kleine Schnitte in die Lamina (knöcherne Bogen nach links und rechts von den Dornfortsätzen auf jeder Seite der Wirbel) und vorsichtig abziehen der Lamina des Rückenmarks (1A-D) aus. Stellen Sie sicher, der Winkel der Flügel flach ist und parallel zu der Schnur so die zugrunde liegende Rückenmark nicht beschädigt wird. </li><li> Weiter Laminektomie im rostralen Richtung Ausstellungene die Brust- und Halsmark. </li><li> Auszuschneiden vorsichtig das Rückenmark von der Wirbelsäule mit stumpfen Pinzette Gewebe und Nutzung Mikroschere, sorgfältig zu trennen, die Wurzeln, um das Kabel zu lösen. Legen Sie die ausgeschnittenen Rückenmark in eine Petrischale mit 4 ° C sterile Ratten Dissektion Puffer (oben in 1.1 beschrieben). Spülen Sie das Gewebe in frisch zubereiteten 4 ° C Sezieren Puffer und mit einer Schere schneiden das Rückenmark in Querrichtung in 1 cm Segmente (1E). </li><li> Für jedes Segment des Gewebes, mit einer Hand, um das Gewebe mit einer feinen Pinzette zu halten. Mit der anderen Hand, verwenden Mikroschere, um vorsichtig die darüberliegenden Hirnhäute, weiße Substanz, und die meisten von der grauen Substanz mit Hilfe einer Binokular. Alternativ können Sie feinen Pinzette (Dumont # 4), die meisten der grauen und weißen Substanz abziehen, so dass nur die periventrikuläre Region des Rückenmarks, die das Ependym und eine kleine Menge des umgebenden grauen Substanz (1F-H) umfasst.</li><li> Pool Der seziert periventrikuläre Gewebe in eine 10 cm sterile Petrischale mit kaltem Ratte Dissektion Puffer. </li></ol> 3. Ernte und Dissektion der erwachsenen Menschen Periventrikuläre Rückenmarksgewebe Hinweis: Human Rückenmarksgewebe von erwachsenen Organtransplantation Spender geerntet (Spender waren im Alter von 2 bis 60 Jahre), nachdem die anderen Organe für Organtransplantation entfernt. Das Trillium-Gift of Life Programm erhält Zustimmung für die Entfernung von Gewebe für Forschungszwecke aus der Familie des Patienten und teilt unsere Ernteteam rechtzeitig, so dass wir in der Lage, um die Kabel innerhalb von 2 Stunden nach der Aorta Querspann ernten. Männlichen und weiblichen erwachsenen Spendern mit negativer Serologie und keine Infektionen werden akzeptiert. <ol><li> Ernte-Gewebe steril in den OP-Saal durch einen ventralen Zugang unter Verwendung der gleichen vorderen Exposition bereits für Organentnahme von der Orgel transp seziertlant Ernteteam. </li><li> Setzen die vordere Wirbelsäule durch Abfahren mit großen Rippenverteiler und große Paddel Retraktoren der übrigen Gewebe und Organe, einschließlich der großen Blutgefäße. </li><li> Verwenden eine Brustbeinsäge mit einer langen Klinge, um durch die Bandscheiben in den rostralen und kaudalen Enden der gewünschten Länge der Wirbelsäule geschnitten zu resezierenden montiert. Angle die Säge etwa 45 ° nach medial um eine dreieckige Trog von der Seitenteil der Wirbelkörper bis kurz vor den Wirbelkanal zu schneiden. </li><li> Entfernen Sie en bloc die medialen Aspekte der Wirbelkörper der gewünschten Segmente mit Hilfe von gekrümmten Osteotome und Hammer wobei darauf zu vermeiden, schneiden durch die Dura. Heben Sie dann vorsichtig die Dura gedeckt Rückenmark mit Zahnzange und scharf einzuschneiden rostralen und kaudalen Enden der Schnur. Verwenden Sie lange Schere und Pinzette auf bilateraler Ebene durchschneiden die einzelnen Wurzeln. </li><li> Legen Sie das ausgeschnittene Segment des Rückenmarks in 4 °; C sterile Puffer (1x HBSS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) in einem großen Teströhrchen für den Transport zum Zellkulturraum. </li> <li> Hinweis: Im Allgemeinen wird eine 3-6 cm Segment des Rückenmarks von der oberen Brust- und / oder mittleren bis niedrigen Niveau des Brustraums wird im Operationssaal unter sterilen Bedingungen entfernt so schnell wie möglich nach Beendigung der Durchblutung und in kalten sterilen Puffer abgelegt . Die Zeit zwischen der Einstellung der Zirkulation und Entfernung des Rückenmarks verstrichenen Zeit variiert mit der Zeit, die erforderlich, um die gezielte Spenderorgane ernten und ist von 45 Minuten bis 2 Stunden reicht. Wenn das Herz und die Lungen wurden ebenfalls entfernt wurde, kann die Dissektion weit rostral genommen, um einen Teil des unteren Halsmark sowie zu ernten. </li><li> Sezieren des menschlichen Rückenmarksgewebe so bald wie möglich nach der Ernte in der Regel innerhalb von 3 Std. Entfernen Sie die Dura und andere Hirnhäute mit einer Pinzette. Spülen Sie die Rückenmarksgewebe in frisch zubereiteten 4 ° C Dissektion Puffer undSchnitt quer in 1 cm Segmente. </li><li> Mit Hilfe eines Binokular, Verbrauchs der darüberliegenden Hirnhäute, weiße Substanz, und die meisten von der grauen Substanz unter Verwendung von Gewebezange, feinen Pinzette und Mikroschere für jede Gewebesegment. Pool Der seziert periventrikuläre Gewebe, das Ependym und eine kleine Menge von umliegenden grauen Substanz, in eine sterile 10 cm Petrischale mit kaltem menschlichen Dissektion Puffer enthält. </li></ol> 4. Isolierung und Kultivierung von adulten Ratten und Human Spinal Cord NSPC <ol><li> Führen Sie folgende Schritte unter aseptischen Bedingungen in einer Steril. <ol><li> Blatt vor den seziert Ratte oder des Menschen periventrikuläre Gewebe in 1 mm 3 Stück mit Mikroschere. </li><li> Enzymatisch dissoziiert des zerkleinerten Gewebes mit proteolytischen Enzymen unter Verwendung des Papain-Dissoziierung Kit wie in der Tabelle von Materialien / Reagenzien angegeben. Hinweis: Reagenz Komponenten umfassen 4 Durchstechflaschen; Vial 1: Earles Balanced Salt Solution (EBSS), Vial 2: Papain mit deg L-Cystein und EDTA, Vial 3: Deoxyribonuclease I (DNase), Vial 4: Ovomucoid Proteaseinhibitor mit Rinderserumalbumin (BSA). Hinweis: Hinweis: Papain ist ein Sulfhydryl-Protease, die breite Spezifität für Proteinsubstrate hat. Die Papain hier wird aus dem Latex aus der Carica papaya Pflanze gewonnen und verschlechtert die meisten Proteinsubstraten umfangreicher als Pankreas-Proteasen. Während der Dissoziation Prozess gibt es einige Zellschäden verursachen DNA in die Dissoziation Medium, Viskosität zu erhöhen und machen Pipettieren schwierig erscheinen. Somit wird DNase in der Zellisolierungsverfahren eingeschlossen, um die DNA, ohne die intakten Zellen zu verdauen. Ovomucoide sind Glykoprotein-Protease-Inhibitoren verwendet, um die Papain-Aktivität nach der Dissoziation Schritt hemmen. </li></ol></li><li> Beim ersten Gebrauch rekonstituieren das Albumin Ovomucoid Inhibitormischung (Fläschchen 4) mit 32 ml EBSS (Flasche 1), und dann bei 4 ° C und verwenden Sie für die anschließende Isolierungen.Anmerkung: Dies ergibt eine Lösung mit einer wirksamen Konzentration von 10 mg Ovomucoid-Inhibitor und 10 mg Albumin pro ml. </li><li> 5 ml EBSS (Gefäß 1) zu einer Papain Fläschchen (Ampulle 2), wodurch man eine Lösung mit 20 Einheiten Papain / ml in 1 mM L-Cystein mit 0,5 mM EDTA. Prüfen, ob der Papain-Lösung klar erscheint, wenn vollständig gelöst ist, da sonst die Küvette in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten, bis das Papain vollständig gelöst ist, um volle Aktivität des Enzyms zu gewährleisten. </li><li> Fügen Sie 500 ul EBSS (Flasche 1) zu einer DNase Fläschchen (Fläschchen 3) und vorsichtig mischen, wie DNase ist empfindlich gegenüber Denaturierung zu scheren. Man 250 ul der DNase-Lösung in das Fläschchen, das die Papain, was zu einer Endkonzentration von etwa 20 Einheiten / ml Papain und 0,005% DNase. Speichern Sie die Balance des DNase Fläschchen für die spätere Verwendung. </li><li> Legen Sie die gehackte Ratte oder menschlichen Gewebe in der Papain-Lösung, wie in Schritt 4.4 oben hergestellt. Für das menschliche Gewebe Isolierung, teilen Sie die zerkleinerte Gewebe gleichmäßig zwischen zweiPapain Fläschchen (etwa 0,2 g / Fläschchen). </li><li> Inkubieren bei 37 ° C unter konstantem Rühren auf einer Schüttelplattform, um das Gewebe in der aktivierten Papainlösung dissoziieren. Inkubieren Rattengewebe für 45 min bis 1 h und menschlichem Gewebe für 1 bis 2 Stunden in Abhängigkeit von der Menge an zerkleinertem Gewebe, etwa 0,2 bis 0,4 g. </li><li> Verreiben des Gemisches mit einer 10 ml-Pipette, um alle verbleibenden Gewebestücke zu trennen, um eine trübe Zellsuspension zu ergeben. Übertragen der Zellsuspension (keine Stücke undissoziierten Tissues) in einen sterilen 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Resuspendieren der pelletierten Zellen in Medium, das Ovomucoid, eine Papain-Inhibitor. <ol><li> Vorbereiten des Ovomucoids durch Mischen von 2,7 ml EBSS (Gefäß 1) mit 300 ul des rekonstituierten Albumin-Ovomucoid-Inhibitor (Fläschchen 4) in einem 15 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie 150 ul DNase-Lösung (Fläschchen 3) in Schritt 4.4 oben gespeichert. </li><li> Überstand verwerfen ausDie pelletierten Zellen und unmittelbar Zellpellet im verdünnten DNase albuminInhibitorGemisch. </li></ol></li><li> Separate intakten Zellen aus Zellmembranen durch Zentrifugation durch einen einzigen Schritt diskontinuierlichen Dichtegradienten. <ol><li> Vorbereitung der diskontinuierliche Dichtegradient durch Zugabe von 5 ml Albumin-Inhibitorlösung (Flasche 4) in ein 15 ml-Röhrchen und unter Verwendung einer 5 ml-Pipette vorsichtig und langsam Schicht der Zellsuspension (hergestellt wie oben in Stufe 4.8 beschrieben) auf der Oberseite das Albumin-Inhibitorlösung. </li><li> Zentrifugieren bei 70 × g für 6 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Anmerkung: Die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten des Gradienten leicht sichtbar zu sein, aber nur minimale Vermischung an dieser Grenze wirkt sich nicht auf das Ergebnis. Membranfragmente verbleiben an der Grenzfläche und dissoziierte Zellen Pellet am Boden des Röhrchens. </li></ol></li><li> Für Rattenzellen, den Überstand verwerfen und Zellpellet in 1 ml Ratten EFH Medium (bei 37 ° C vorgewärmt).Graf Lebendzelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in einen T25 Kulturflaschen in einer Dichte von 10 Zellen / ul in EFH. Die typische Ausbeute an Zellen von Rattengewebe ist ungefähr 2 × 10 6 Zellen mit etwa 80% viability.If klonalen Kulturen erwünscht, Samenzellen in einer Dichte von weniger als 10 Zellen / ul. Die Kolben werden bei 37 ° C in 5% CO 2 und damit die Kulturen wachsen ungestört für 1 Woche, um die Aggregation von Kügelchen zu vermeiden. </li><li> Für menschliche Zellen, den Überstand verwerfen und Zellpellet in 10 ml menschlichen EFH Medium (bei 37 ° C vorgewärmt). Filtern der Zellsuspension durch ein 40 um Nylon Zellsieb anschließend mit 30 ml EFH Myelin und Zellmembranfragmente zu entfernen. Zentrifuge bei 300 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml EFH Medium. </li><li> Graf Lebendzelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die menschlichen Zellen in 6-Well-Kulturplatten in einer Dichte von 10 5 Zellen / Vertiefung in einem Gesamtvolumenvon 5 ml EFH / well. Die typische Ausbeute von Zellen, die aus menschlichem Gewebe beträgt ungefähr 1 × 10 6 Zellen mit ca. 70% Lebensfähigkeit. Vorstrich Vertiefungen mit einer haftenden Substrat, wie Matrigel (siehe Anmerkung unten). Verdünne in einem Verhältnis von 40 ul Matrigel: 1 ml SFM. </li><li> Anmerkung: Alternativ können andere adhärente Substrate, wie Poly-D-Lysin / Laminin, Fibronectin oder Kollagen verwendet werden. </li><li> Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C in 5% CO 2 und damit die Kulturen für 1 Woche ungestört wachsen. </li></ol> 5. Passagieren von Adult Ratte und Mensch Rückenmark NSPC <ol><li> Rat NSPC werden kleine Neurosphären etwa 70 &amp; mgr; m im Durchmesser innerhalb 1 Woche nach anfänglichen Aussaat zu bilden; Passage Ratte NSPC wöchentlich durch das Sammeln der Zellsuspension, Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min, und mechanisch Verreiben des Zellpellet, um die Neurosphären dissoziieren. </li><li> Samen der dissoziierten Zellen in T25-Kolben mit frischem Ratten EFH Medium. Alternativverwenden 50% konditioniert Ratte Medium für Passagieren. Die typische Ausbeute aus Ratten NSPC bei Passagierung etwa 5 x 10 6 Zellen, die exponentiell mit der Durchlaufhäufigkeit steigt. </li><li> Für die menschlichen Kulturen, eine Woche nach der ersten Beschichtung, ersetzen die Hälfte des Kulturmediums mit frischen EFH zweimal wöchentlich, um damit die Zellen an dem Substrat haften. Im Allgemeinen 1-2 Wochen später, wenn die Zellen an dem Substrat befestigt, ersetzen Sie das gesamte Volumen des Kulturmediums zweimal pro Woche mit frischen EFH. </li><li> Subculture Zellen vor Erreichen der Konfluenz zwischen 4 - 8 Wochen. <ol><li> Subkultur-Zellen durch Ablösen Zellen aus dem Substrat enzymatisch (siehe Tabelle der Materialien) mit 2 ml Enzym pro Well für ca. 10 min bei 37 ° C inkubiert. Sammeln Zellsuspension, Zentrifuge bei 300 xg für 5 min, und sanft Zellpellet in 1 ml frisch zubereitete EFH Medium. </li><li> Graf lebende Zellen mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in 6-Well-Kulturplatten (pre-coATED wie oben in Schritt 4.12) in einer Dichte von 10 5 Zellen / Well in einem Gesamtvolumen von 5 ml EFH / Vertiefung. Die typische Ausbeute an Human NSPC bei Passagierung etwa 2 x 10 6 Zellen und in der Regel wird dies mit dem Durchgang zu verdoppeln. Im Allgemeinen halten die Kulturen mit 50% konditioniertem Medium EFH 2-3 mal pro Woche zwischen Passagieren. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Während der Präparation des Rattenrückenmarksgewebe sollte darauf geachtet nicht zu beschädigen das Rückenmark während der Durchführung der Laminektomie werden. Es ist einfacher, die periventricular Gewebe zu isolieren, wenn die Rückenmarksegmente intakt sind. Die Gewebesegmente sollten in Dissektion Puffer vollständig eingetaucht werden, und die darüberliegenden Hirnhaut und weißen Substanz weg als Längsstreifen mit Mikroschere geschnitten werden. Alternativ können feine Gewebe-Zange benutzt, um die weiße Substanz ablö...

NSPC sind multipotente Zellen in das neuronale Abstammungslinie, die sich selbst erneuern kann und leicht in vitro auszuweiten. Wir bezeichnen diese Zellen als eine gemischte Population von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, da sie Eigenschaften von sich selbst erneuernden multipotenten Stammzellen und Vorläuferzellen beschränkt anzuzeigen. NSPC sowohl in der fötalen und adulten Gehirn und Rückenmark 1,2 gefunden. Beim Erwachsenen sind NSPC normale ruhende und aufzuhalten, in bestimmten Nischen einschließlich der Subventrikularzone entlang der Seitenventrikel 2-4, und der periventrikulären Region um den Zentralkanal des Rückenmarks 5,6. Typischerweise werden NSPC als freischwebende Neurosphären oder als adhärente Monolagen in serumfreien Medium mit EGF und bFGF supplementiert, Mitogene, die für die Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen durch kultiviert. Neurosphäre Assay ursprünglich von Reynolds und Weiss 2 entwickelt, wird am häufigsten verwendet, und die KulturErweitern neuralen Stammzellen. NSPC zeigen Multipotenz, wenn sie in Wachstumsfaktor-haltigen serumfreien Medium ausplattiert, sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Multi kann selbst erneuernden NSPC isoliert und kultiviert werden vom erwachsenen Nager Rückenmarks, wenn das gezüchtete Gewebe umfasst Regionen des Zentralkanals 6,7. Ein potentieller Vorteil der Verwendung NSPC des Erwachsenen Rückenmark und nicht zur Erstellung Zellen aus anderen Regionen erzeugt ist, dass diese gewebespezifischen Zellen am ähnlichsten Zellen im Rückenmark, die verloren gehen oder beschädigt werden, nach einer Verletzung oder Krankheit. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Neurosphären aus adulten menschlichen Rückenmark abgeleiteten nicht langfristig vermehrt oder passagiert, um eine ausreichende Anzahl von Zellen 8,9 erzeugen. Jedoch mit Modifikationen in Kultivierungsbedingungen berichteten wir über die Ausdehnung und die Transplantation von adulten menschlichen Rückenmark stamm NSPC, was zeigt, dass selbst erneuerndenund multi NSPC aus erwachsenen menschlichen Rückenmark von Organtransplantation Spender 10 isoliert werden. In erster Linie die Entfernung des größten Teils der weißen Substanz bei der Präparation und Kultivierung dieser Zellen auf einem haftenden Substrat in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium für proliferierende menschliche Wirbelsäule NSPC Erwachsenen gewählt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Ernte des Rückenmarks von erwachsenen Ratte und aus menschlichen Organtransplantation Spender, Dissektion der periventrikuläre Gewebe und der Isolierung, der Kultur und den Ausbau der NSPC.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>#10010023</td><td>Dissektionspuffer</td></tr><tr><td>1x HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>#14175095</td><td>Dissektionspuffer</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td># G-6152</td><td>30%ige Glukosestammlösung für Dissektionspuffer und Hormonmischung</td></tr><tr><td>vorbereiten Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>#15140-148</td><td>Dissektionspuffer und Kulturmedium</td></tr><tr><td>Neurobasal-A&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>#10888-022</td><td>Nährmedium</td></tr><tr><td>L-Glutamin, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081</td><td>Nährmedium</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>#12587010</td><td>Nährmedium</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>#11885084</td><td>Hormonmix</td></tr><tr><td>F12</td><td>Life Technologies</td><td>#21700-075</td><td>Hormonmix</td></tr><tr><td>NaHCO 3</td><td>Sigma</td><td># S-5761</td><td>7,5 % NaHCO3 Stammlösung für die Hormonmischung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td> herstellen<td>#H9136</td><td>1M HEPES-Stammlösung für die Hormonmischung</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>#I-5500</td><td>Hormonmischung</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma</td><td>#T-2252</td><td>Hormonmischung</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td># P7505</td><td>Hormon Mischung</td></tr><tr><td>Selen</td><td>Sigma</td><td>#S-9133</td><td>Hormonmischung</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>#P-6149</td><td>Hormonmischung</td></tr><tr><td>EGF, Maus</td><td>Sigma</td><td>#E4127</td><td>Vorbereiten 100 μmu; g/ml-Bestände in B27 und aliquot; EFH Medium</td></tr><tr><td>EGF, humanes rekombinantes</td><td>Sigma</td><td>#E9644</td><td>Präparat 100 μmu; g/ml-Bestände in B27 und aliquot; EFH Medium</td></tr><tr><td>bFGF, humanes rekombinantes</td><td>Sigma</td><td>#F0291</td><td>Präparat 100 &mu; g/ml-Bestände in B27 und aliquot; EFH mittel&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin, 10.000 U</td><td>Sigma</td><td>#H3149</td><td>Bereiten Sie 27,3 mg/ml Brühen in Hormonmischung und Aliquot vor; EFH-Medium</td></tr><tr><td>Papain-Dissoziationskit</td><td>Worthington Biochemicals</td><td>#LK003150</td><td>Enthält EBSS, Papain, DNase, Ovomucoid-Protease-Inhibitor mit</td>BSA-Natrium-Pentobarbital-Bimeda</tr><tr><td></td><td>&ndash; MTC Animal Health Inc</td><td>DIN 00141704</td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange: Addisons</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11006-12&nbsp;</td><td>Gezahnte Standardspitze, auch Mikrospitze erhältlich</td></tr><tr><td>Feine Pinzette: Dumont #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>#15024-10</td><td>Vannas</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Bausch & 10 Rundgriff Lomb</td><td>N1430</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Petrischale&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kulturflaschen</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Nylon-Zellsieb</td><td>VWR</td><td>CA21008-949</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Nunc</td><td>CA73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Wachstumsfaktor reduziert (100x)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Auftauen gemäß den Anweisungen und Einfrieren der Aliquote; Verwendung verdünnt im Verhältnis von 40 &mu; l Matrigel: 1 ml SFM</td></tr></tbody></table>

isolierung von neural stamm- / vorläuferzellen aus dem periventrikuläre region der erwachsenen ratte und human spinal cord

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Erwachsenen Ratte und menschlichen Rückenmarks neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen (NSPC) in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium kultiviert ermöglicht die Proliferation von multipotenten, selbst erneuernden und erweiterbar neuralen Stammzellen. Im Serum Bedingungen wird diese multi NSPC unterscheiden, Erzeugen Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Das geerntete Gewebe wird enzymatisch in einer Papain-EDTA-Lösung dissoziiert und dann mechanisch dissoziiert und in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten getrennt, um eine Einzelzellsuspension, die in Neurobasalmedium mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor plattierende Ausbeute (bFGF ) und Heparin. Erwachsenen Ratte Rückenmark NSPC sind als freischwebende Neurosphären und menschlichen Rückenmark NSPC Erwachsenen kultiviert werden als adhärente Kulturen angebaut. Unter diesen Bedingungen Erwachsenen Rückenmarks NSPC proliferieren express Marker von Vorläuferzellen, und kann kontinuierlich beim Durchgang ausgedehnt werden. Diese Zellen können be suchten in vitro als Reaktion auf verschiedene Reize, und exogene Faktoren können verwendet werden, um Linienbeschränkung zu fördern, um neuronale Stammzelldifferenzierung zu untersuchen. Multi NSPC oder deren Nachkommen können auch in verschiedenen Tiermodellen transplantiert werden, um Wiederaufbaureparatur zu bewerten.

Erwachsenen Ratte Rückenmark-Zellen in Suspensionskultur in EFH Medium gezüchtet werden kleine Neurosphären (Kolonien von undifferenzierten Zellen) innerhalb 1 Woche nach anfänglichen Plattierung zu bilden. In Primärkulturen, die meisten Zellen ausplattiert sterben und Wachstumsfaktor-responsive Stammzellen proliferieren und werden in der EFH Medium ausgewählt. Durch den Durchgang 3, wird es zahlreiche frei schwebenden Neurosphären etwa 100 &amp; mgr; m im Durchmesser (2A) sein. Neurospheres sind rund u...

Das Rückenmark eines adulten Säugetieres enthält neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs), die in Kultur isoliert und erweitert werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Isolierung, Kultivierung und Passage von NSPCs, die aus der periventrikulären Region des adulten Rückenmarks von der Ratte und von menschlichen Organtransplantatspendern erzeugt wurden.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neuronale Stammzellen aus der paraventrikulären Region des erwachsenen Ratten- oder menschlichen Rückenmarks zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Rückenmark mittels Laminektomie entnommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Rückenmark quer in ein Zentimeter lange Segmente zu schneiden und die paraventrikuläre Region aus jedem Segment des Rückenmarks zu präparieren.Anschließend wird das zerkleinerte Gewebe in Stücke von einem Millimeter Größe geschnitten und anschließend enzymatisch dissoziiert. Im letzten Schritt werden intakte Zellen durch Zentrifugation über ein diskontinuierliches Dichtegradienten getrennt und die Zellsuspension aufgeplattet. Letztendlich kann die Bildung von Neurosphären und das Wachstum von neuronalen Stammzellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie bewertet werden.Heute werde ich demonstrieren, wie man neuronale Stammzellen aus der paraventrikulären Region des erwachsenen Ratten-Rückenmarks isoliert. Diese Zellen können anschließend genutzt werden, um zentrale Fragen im Bereich der neuronalen Stammzellen zu beantworten, beispielsweise welche exogenen Faktoren die Linienrestriktion fördern oder wie diese Zellen auf verschiedene Reize oder Stresssituationen reagieren. Beginnen Sie damit, die Kultur, das Medium und die Puffer für die Dissektion gemäß der beigefügten Textanleitung vorzubereiten.Anschließend, nach einer Überdosierung des Anästhetikums, desinfizieren Sie die Haut der Ratte und entfernen mithilfe großer Dissektionscheren die Rückenseite, um die Wirbelsäule freizulegen. Halten Sie die Dissektionscheren senkrecht zur Rückenseite und quer ausgerichtet. Durchtrennen Sie die Wirbelsäule oberhalb der Hintergliedmaßen.Verwenden Sie dann kleinere Scheren, um den über der Wirbelsäule liegenden dorsalen Muskel in rostraler Richtung längs aufzuschneiden, um die Dornfortsätze freizulegen, beginnend am freigelegten Coddle-Ende. Führen Sie ein kleines stumpfes Knochenschneidinstrument extraoral von der Seite in den Zwischenraum zwischen Rückenmark und Wirbelsäule im Bereich des Wirbelkanals ein. Platziere die Klinge flach und parallel zum Rückenmark.Danach kleine Einschnitte in die Lamina vornehmen und die Lamina vorsichtig abziehen, um das Rückenmark freizulegen. Dieser Winkel verhindert eine Beschädigung des darunterliegenden Rückenmarks. Die Entfernung der Lamina in zephaler Richtung fortsetzen.Um das thorakale und zervikale Rückenmark freizulegen, heben Sie es vorsichtig mit stumpfen Gewebetupfern vom Wirbelkanal ab und durchtrennen Sie die Wurzeln mit einer Mikroschere. Um das Rückenmark zu lösen, legen Sie das entfernte Rückenmark in eine Petrischale, die eiskalten, sterilen Ratten-Dissektionspuffer enthält. Spülen Sie das Gewebe mit dem eiskalten Dissektionspuffer ab und schneiden Sie das Rückenmark mit einer Schere quer in ein Zentimeter lange Segmente. Für jedes Gewebestück halten Sie dieses mit einer Hand mit feinen Pinzetten fest und entfernen Sie mit der anderen Hand mit einer Mikroschere vorsichtig die weiße Substanz zusammen mit dem Großteil der grauen Substanz, sodass nur noch der periventrikuläre Bereich des Rückenmarks verbleibt.Ziehen Sie das dissektierte periventrikuläre Gewebe in eine 10 Zentimeter große sterile Petrischale mit eiskaltem Ratten-Dissektionspuffer. Um die Isolierung von neuronalen Stammzellen aus der Ratte zu beginnen, zerkleinern Sie das dissektierte periventrikuläre Gewebe mit einer Mikroschere zu Stückchen von je einem Kubikmillimeter. Bereiten Sie anschließend den enzymatischen Dissoziationspuffer vor, indem Sie zunächst fünf Milliliter Earl’schen Puffer mit ausgeglichener Salzlösung zu einem Röhrchen mit Papain aus einem Papain-Dissoziationskit hinzufügen.Stellen Sie das Gefäß 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit die Papain vollständig gelöst wird und die Lösung klar erscheint. Geben Sie anschließend 500 µL Earl’schen Pufferlösung (Earl’s balanced salt solution) zu dem Gefäß mit der DNA aus dem Dissoziationskit. Vorsichtig mischen, dann 250 µL der DNA-Lösung zu dem Gefäß mit Papain geben und erneut vorsichtig mischen.Fügen Sie als Nächstes das zerkleinerte Gewebe, etwa 0,2 Gramm, in das Gefäß hinzu und stellen Sie das Gefäß für 45 Minuten bis eine Stunde auf eine Wipplattform bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation pipettieren Sie die Mischung mit einer 10-Milliliter-Pipette um, um verbleibende Gewebestücke aufzulösen, wodurch eine trübe Zellsuspension entsteht. Überführen Sie die Zellsuspension in ein steriles 15-Milliliter-Kegelrohr und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 300 G.Bei Raumtemperatur während der Zentrifugation bereiten Sie die OVO-Moid-Lösung vor, indem Sie 2,7 Milliliter Earl’s Balanced Salt Solution mit 300 Mikrolitern der rekonstituierten Albumin-OVO-MOID-Inhibitor-Lösung mischen. Geben Sie in einem 15-Milliliter-Konischkolben 150 Mikroliter der zuvor hergestellten DNA-Lösung zur Oval-Moid-Lösung hinzu und mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen des Kolbens. Entsorgen Sie den Überstand der pelletierten Zellen und resuspendieren Sie das Zellpellet unverzüglich in der verdünnten DNA-Albumin-Inhibitor-Mischung. Bereiten Sie als Nächstes ein diskontinuierliches Dichtegradienten vor, indem Sie fünf Milliliter der Albumin-Inhibitor-Lösung in einen 15-Milliliter-Kolben geben und die Zellsuspension vorsichtig und langsam mit einer 5-Milliliter-Pipette auf die Albumin-Inhibitor-Lösung aufschichten.Zentrifugieren Sie die Probe sechs Minuten lang mit 70 ×g bei Raumtemperatur. Danach entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in einem Milliliter vorgewärmtem Ratten-EFH-Medium, das gemäß der im begleitenden Textprotokoll beschriebenen Methode hergestellt wurde. Bestimmen Sie die Dichte lebender Zellen mit einem Hämozytometer und impfen Sie die Zellen in einem T25-Kulturgefäß mit einer Dichte von 10 Zellen pro Mikroliter in EFH aus.Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid und lassen Sie die Kulturen eine Woche lang ungestört wachsen, um eine Aggregation der Sphäroide zu vermeiden. Gezeigt ist ein Querschnitt des Ratten-R&uuml;ckenmarks, der mit Luxol Fast Blue sowie H&auml;matin und Eosin gef&auml;rbt wurde, um die Grenzen von wei&szlig;er und grauer Substanz sichtbar zu machen. Die gestrichelte Linie kennzeichnet das dissektierte verbleibende periventrikul&auml;re Gewebe, das in diesem Protokoll aus diesem Bereich isoliert wurde.Neurosphären wie die hier gezeigten wachsen bei hoher Vergrößerung schwimmend in Suspension. Mikrospitzen sind sichtbar, die von den Neurosphären hervorstehen, und die Proliferation der Neurosphären zeigt sich durch KI-67-positive Färbung, wobei die Neurosphären dissociiert und auf mit Matrigel beschichteten Platten angezüchtet wurden. Zusätzlich exprimieren sie überwiegend Nestin, ein Marker für neuronale Vorläuferzellen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können der Kultur der Zellen exogene Faktoren hinzugefügt werden, um die Differenzierung zu fördern. Die adulten neuronalen Stammzellen oder ihre Tochterzellen können zudem in verschiedene Tiermodelle transplantiert werden, um ihre Fähigkeit zur regenerativen Reparatur zu untersuchen. Ich hoffe, dieses Video ist für Sie hilfreich, und wünsche Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

isolation-neural-stemprogenitor-cells-from-periventricular-region

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video stellt eine Methode zur Isolierung von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen aus dem periventrikulären Gewebe des Rückenmarks bei erwachsenen Ratten vor. Die Technik beinhaltet die Inkubation der Gewebefragmente in einer Lösung, die proteolytische Enzyme enthält, um die extrazelluläre Matrix zu zerstören und die Zellen freizusetzen. Anschließend werden die freigesetzten Zellen in ein Medium überzogen, das spezifische Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation von neuralen...

Isolierung von neuralen Stammvorläuferzellen aus der periventrikulären Region des Rückenmarks einer erwachsenen Ratte

Fibrin-Matrices, die Wachstumsfaktoren wurden verwendet, um aufgepfropften neuronalen Stammzellen in Websites von kompletten Durchtrennung des Rückenmarks zu behalten. Transplantierten Zellen die Läsion Hohlraum vollständig gefüllt ist und in mehrere neuronale Zelltypen, einschließlich Neuronen, die Axone in Wirtsrückenmark über lange Distanzen erweitert differenziert.

Förderung von Überleben und die Differenzierung neuraler Stammzellen mit Fibrin und Growth Factor Cocktails nach schweren Rückenmarksverletzungen

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen mechanischen Schneideverfahren, das die Erweiterung der sphärischen neuralen Stamm-und Vorläuferzellaggregate ohne Dissoziation zu einer Einzelzellsuspension ermöglicht. Die Aufrechterhaltung Zell / Zell-Kontakt ermöglicht eine schnelle und stabile Wachstum seit über 40 Passagen.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Verletzungen des Rückenmarks ist eine traumatische Erkrankung, die schwere Morbidität und hoher Sterblichkeit führt. In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail eine Quetschung Modell der Verletzung des Rückenmarks in Mäusen, gefolgt von einer Transplantation von neuralen Stammzellen.

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Gequetscht Modell von Rückenmarksverletzungen

Die Etablierung von Kultursystemen für die Expansion adulter neuraler Stammzellen (aNSCs) ermöglicht die Untersuchung und Anwendung von aNSCs für die Therapie. Die subkallosale Zone (SCZ) wurde kürzlich als neuartige Neuroblasten-bildende Region bei erwachsenen Mäusen erkannt. Hier werden Methoden zur Isolierung, Expansion und Differenzierung von SCZ-aNSCs beschrieben.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Marrow Stromazellen (MSCs) mit neuronalen Potenzial gibt es im Knochenmark. Unser Protokoll bereichert diese Population von Zellen durch hypoxische Vorkonditionierung und leitet sie dann zu reifen Schwann-Zellen.

Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

Hier zeigen wir die Leistung eines minimalen Rückenmark Verletzungen Modells in einer Erwachsenen Maus, die den zentralen Kanal Nische Gehäuse endogenen neurale Stammzellen (NSCs) erspart. Wir zeigen, wie neurosphäre Assay verwendet werden kann, um Aktivierung und Migration der definitive und primitiven NSCs nach Verletzung zu quantifizieren.

Ein Neurosphäre Assay auszuwertende endogenen neurale Stammzellen Aktivierung in einem Mausmodell der minimalen Spinal Cord Injury

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Eine Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirn lebender Ratten wird hier experimentell detailliert vorgestellt. Es ermöglicht die mehrfache Entnahme dieser Zellen von denselben Tieren, ohne ihr Wohlbefinden zu beeinträchtigen.

Die "Brain Milking"-Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus lebenden Ratten

Lernen Sie die Isolierung neuraler Stamm-/Vorläuferzellen aus der periventrikulären Region des erwachsenen Rückenmarks von Ratte und Mensch. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von Neurosphären für die regenerative Medizinforschung.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

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