Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, endotheliale Vorläuferzellen aus menschlichem Nabelschnurblut zu isolieren. Diese Methode beschreibt die Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut für ihre potentielle Verwendung als autologe Zellen für das Tissue Engineering von Gefäßtransplantaten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Isolierungsverfahren in speziellen Medien durchgeführt werden kann, ohne dass eine Aminosortierung erforderlich ist.

Die isolierten endothelialen Vorläuferzellen können zur Untersuchung der Neovaskularisation verwendet werden, und Berichte deuten auch darauf hin, dass diese Zellen als Biomarker verwendet werden können, um Patienten mit einem Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu identifizieren. Bevor Sie mit dem Isolierungsverfahren beginnen, beschichten Sie sechs Well-Platten mit zwei Millilitern frisch zubereitetem Rattenschwanz und einer Kollagenlösung pro Well. Äquilibrieren Sie die Platte mindestens eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius heißen und 5 % CO2-Inkubator.

Verdünnen Sie dann etwa 25 Milliliter Nabelschnurblut mit HBSS in einer Eins-zu-Eins-Konzentration. Geben Sie als nächstes 20 Milliliter Reagenz mit Dichtegradientenmedium in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und geben Sie vorsichtig 20 Milliliter verdünntes Nabelschnurblut an der Wand des Röhrchens ab, um das Blut auf das Medium zu schichten. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation, gefolgt von einer vorsichtigen Entfernung der Plasmaschicht.

Mit einer Spritze, die mit einer 18-Gauge-Nadel versehen ist, wird die mononukleäre Zelle, die den Buffy Coat enthält, in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen aufgefangen. Und fügen Sie den Zellen ein gleiches Volumen an endothelialem Basalmedium hinzu. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation und lysieren Sie die roten Blutkörperchen im resultierenden Gaumen mit fünf Millilitern Ammoniumchloridlösung auf Eis.

Nach fünf bis 10 Minuten mit gelegentlichem Schütteln sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das weiße Kügelchen in frischem endothelialem Wachstumsmedium. Nach dem Zählen aspirieren Sie das Kollagen aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte und waschen Sie die Vertiefungen dreimal in PBS. Die mononukleären Zellen werden in einer Konzentration von eins mal 10 bis siebten Zellen pro zwei Milliliter Medium pro Vertiefung ausgesät.

Und stellen Sie die Platte für 24 Stunden in den Inkubator. Spülen Sie die Zellen am nächsten Tag einmal mit frischem endothelialem Wachstumsmedium aus. Ersetzen Sie dann die Wäsche durch drei Milliliter frisches endotheliales Wachstumsmedium und geben Sie die Zellen wieder in den Zellkultur-Inkubator.

Mit einem Hellfeldmikroskop erhalten Sie täglich Bilder der Zellen, um das Fortschreiten der Endothelzellkolonien zu überwachen und die Platten zu markieren, an denen die Kolonien entstehen, um ihr Wachstum zu verfolgen. Wenn die Endothelzellkolonien eine Größe von etwa drei Millimetern erreicht haben, wird ein T25-Kulturkolben mindestens eine Stunde lang im Zellkultur-Inkubator mit frischem Rattenschwanz und Kollagen bestrichen. Anschließend werden die Zellen mit 150 Mikrolitern 0,05%Trypsin-EDTA pro Vertiefung im Zellkultur-Inkubator für zwei bis drei Minuten geerntet.

Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die anhaftenden Zellen zu lösen. Wenn sich die Zellen abzulösen beginnen, fügen Sie sofort zwei Milliliter frisches endotheliales Wachstumsmedium hinzu und ziehen Sie die Zellen in ein einzelnes konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in frischem endothelialem Wachstumsmedium.

Nach dem Zählen säen Sie die Zellen in dem mit Kollagen überzogenen Kolben bei fünf mal 10 bis zu den fünften Zellen in drei Milliliter Medium pro Kolbendichte aus und markieren Sie den Kolben als Durchgang eins. Stellen Sie dann den Kolben wieder in den Inkubator und säen Sie die Zellen erneut aus, sobald die Kolonie eine Konfluenz von 90 % erreicht. Nach der Aussaat auf die mit Kollagen behandelten Platten wird das erste Auswachsen der Kolonie in der Regel zwischen dem fünften und neunten Tag beobachtet.

Die Kolonien wachsen weiter und nehmen in den frühen Stadien der Kultur eine spindelförmige Zellmorphologie an, die später zu einer kopfsteinpflasterartigen Morphologie fortschreitet. Die Gesamtzahl der Zellen, die bei jeder Passage entnommen werden, steigt in direktem Zusammenhang mit der Gesamtzahl der Tage in Kultur. Die Western-Blot-Analyse zeigt eine frühe Expression von CD 31 und CD 34 durch die kultivierten Endothelzellen, die mit anschließender Passage abzunehmen.

Die Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptors zwei bleibt jedoch über die Zeit erhalten, wenn auch auf einem etwas niedrigeren Expressionsniveau als nach der ersten Passage. Bemerkenswert ist, dass endotheliale Vorläuferzellen nicht positiv für den mesenchymalen Zellmarker alpha glatte Muskelaktin sind, im Gegensatz zum Beispiel zu valvulären interstitiellen Zelllysaten, die als Positivkontrolle eingeschlossen werden können. Das gesamte Isolationsverfahren kann in weniger als fünf Stunden abgeschlossen werden, abhängig von der erhaltenen Nabelschnurbluteinheit.

Nach der Isolierung und Aussaat der mononukleären Zellen in endothelialem Wachstumsmedium dauert es in der Regel zwischen fünf und neun Tagen, bis die EPC-Kolonien in der Kultur auftauchen. Das vorgeschlagene Isolierungsverfahren verwendet spezielle Medien für die Kultivierung der endothelialen Vorläuferzellen und vermeidet die Verwendung eines Durchflusszytometers, soweit Endothelmarker erforderlich sind. Diese Methode bietet auch ein effizientes Protokoll für die Gewinnung großer Mengen an endothelialen Vorläuferzellen über einen kurzen Zeitraum.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man endotheliale Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurbluteinheiten isoliert. Vergessen Sie nicht, dass menschliches Nabelschnurblut gefährlich sein kann und dass die ordnungsgemäße Entsorgung von Blutabfällen und Zellkulturprodukten befolgt werden sollte.