Name: Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Lernen Sie die Isolierung endothelialer Vorläuferzellen aus menschlichem Nabelschnurblut für Gewebetechnik und kardiovaskuläre Forschung. Diese Methode ermöglicht effiziente Zellgewinnung ohne Flusszytometrie.

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Dieses Material basiert auf Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation Grant No. CMMI-1452943 und von der University of Arkansas Ehrenhochschule. Wir möchten auch die Arkansas Nabelschnurblutbank für die uns mit Schnur Blut Einheiten zu erkennen.

dieser Forschung wurde mit Zustimmung der University of Arkansas Institutional Review Board (Zulassungsnummer 16-04-722) durchgeführt. Nabelschnur Blut Einheiten wurden in Citrat Phosphat Traubenzucker (CPD) Lösung in Arkansas Nabelschnurblutbank und Einheiten, die nicht die Voraussetzung für die Lagerung für die Forschung gespendet wurden. Cord Blood Einheiten waren couriered im Labor innerhalb von 24 h Kollektion bei Umgebungstemperaturen.
 1. Isolation der endothelialen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut <ol><li>Vorbereitung der Reagenzien.
	<ol><li>Ergänzt bereiten EGM durch Zugabe von endothelialen basal Medium (EBM), 10 % fetalen bovine Serum (FBS) mit 20 ng/mL des Insulin-Like Growth Factor (IGF), 1 µg/mL Ascorbinsäure, 5 ng/mL rekombinanten menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (RhEGF), 22,5 µg/mL Heparin, und 0,5 ng/mL vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), zusammen mit 10 ng/mL von rekombinanten menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor B (RhFGF-B), 0,2 µg/mL Hydrocortison und 2 % Penicillin-Streptomycin-Glutamin. Sterilisieren Sie das Kulturmedium mit einem 0,2 µm Polyethersulfone (PES) Membrane Vakuumfilter.</li>
		<li>Vorbereiten Ratte tail ich Kollagen-Lösung mit einer Konzentration von 50 µg/mL mit 0,02 N Essigsäure. Diese Lösung mit einem 0,2 µm Spritze Filter sterilisieren.</li>
		<li>Pre-Mantel-6-Well-Platten mit 2 mL der vorbereiteten Ratte tail ich Kollagen-Lösung für jedes gut. Legen Sie sie in einem Inkubator auf 5 % CO 2 und 37 ° C für mindestens 1 h vor der Aussaat gehalten.</li>
		<li>Verdünnen etwa 25 mL Nabelschnurblut mit Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS) in einer Konzentration von 1:1.</li>
		<li>Vorbereiten-Radio-Immuno-Niederschlag assay (RIPA) Puffer mit 150 mM Natrium-Chlorid, 1 % Triton x-100, 0,5 % Natrium Deoxycholate, 1 mM β-Glycerophosphat, 0,1 % SDS und 50 mM Tris (pH 8,0).</li>
	</ol></li> <li>Isolation von endothelialen Progenitorzellen.
	<ol><li>Warm All vorbereitet Reagenzien in einem Wasserbad auf 37 ° C vor der Isolierung gehalten.</li>
		<li>20 mL Dichte Gradienten mittlere Reagenz hinzufügen eine 50 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Sorgfältig Schicht 20 mL verdünnten Nabelschnurblut in der Dichte-Gradienten-Medium ohne diese Schicht mit dem Ziel, der Pipette auf den Seitenwänden des Rohres mit Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Einzelteilen anhand ihrer Dichte ( Abbildung 1) Blut durch Zentrifugieren bei 800 X g für 30 min bei Raumtemperatur mit den Bremsen des Rotors Zentrifuge ab. Die verschiedenen Schichten nicht stören.</li>
		<li>Entfernen der Plasmaschicht durch pipettieren sie sorgfältig aus der Tube ohne zu stören andere Zelle, die Schichten bis die Pipettenspitze erreichen das MNC ist überlagern (siehe Abbildung 1). Entsorgen Sie das entfernte Plasma. 
		Hinweis: Bei der Verwendung von Pipettenspitzen, um das Plasma zu entfernen, lassen Sie eine kleine Schicht von Plasma über den MNC-Schicht ( Abbildung 1), um Störungen zu reduzieren.</li>
		<li>Sammeln die buffy Mantel, den die multinationalen Konzerne mit einer Spritze ausgestattet, ein 18-Gauge-Nadel enthält und überträgt es auf eine frische Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Hinzufügen einem gleichen Volumen der EBM die gesammelten MNCs. Zentrifuge diese Rohre bei 500 X g für 10 min bei 4 ° C. verwerfen des Überstands. 
		Hinweis: Die Zelle-Pellet erscheinen rot wegen der Anwesenheit von roten Blutkörperchen/Erythrozyten.</li>
		<li>5 mL Ammoniumchlorid-Lösung für die Erythrozyten lysiert hinzugeben. Dieses Rohr für ca. 5-10 min, mit gelegentlichen schütteln auf Eis brüten. 
		Hinweis: Vorsicht getroffen werden während dieses Schrittes nicht überschreiten die Zeitdauer, wie es für die multinationalen Konzerne schädlich sein kann.</li>
		<li>Schläuche am 500 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entsorgen. Wenn Erythrozyten bestehen bleiben, wiederholen Sie die Schritte 1.2.8 und 1.2.9, bis keine rote Farbe in das Pellet beobachtet wird.</li>
		<li>Das Pellet in vorbereiteten EGM Aufschwemmen und verwenden die Hemocytometer, die multinationalen Konzerne zählen.</li>
		<li>Aspirat Ratte tail ich Kollagen beschichtet 6-Well-Platte (aus Schritt 1.1.3) und waschen Sie die Brunnen dreimal mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Samen das MNC-Pellet Nukleinsäuretablette in EGM auf die Kollagen-Platte in einer Konzentration von 1 x 10 7 MNCs in jede Vertiefung. Legen Sie sie in das 37 ° C, 5 % CO 2-Inkubator.</li>
		<li>Nach 24 h, aspirieren Sie das Medium und die Brunnen einmal mit EGM zu waschen. Jede Vertiefung 3 mL EGM Medium hinzu und legen Sie sie zurück in das 37 ° C, 5 % CO 2-Inkubator.</li>
		<li>Ergänzen die Platte mit frischen EGM Medium täglich für 7 Tage. Nach 7 Tagen das EGM-Medium verändern jeden zweiten Tag.</li>
		<li>Mit einem Hellfeld Mikroskop Bilder von der 6-Well-Platte nehmen jeden Tag, um das Fortschreiten der Endothelzellen Kolonien zu verfolgen. Markieren Sie die Platte, wo die Kolonien entstehen, deren Wachstum nachzuverfolgen. 
		Hinweis: Es dauert in der Regel zwischen 5 und 9 Tage für die Kolonien in der Kultur angezeigt werden.</li>
	</ol></li> <li>Ausbau der endothelialen Vorläuferzellen.
	<ol><li>Mantel der t-25-Kultur-Küvette mit Ratte tail ich Kollagen (50 µg/mL) und legen Sie sie in das 37 ° C, 5 % CO 2 Inkubator für mindestens 60 min. Absaugen und waschen die t-25 Zelle Kultur Küvette dreimal mit 1 X PBS vor der Aussaat Zellen.</li>
		<li>Trypsinize die Endothelzellen Kolonien, wenn sie etwa 3 mm groß mit 150 µL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung in jede Vertiefung zu erreichen. Setzen Sie die 6-Well-Platte wieder in 37 ° C, 5 % CO 2 Inkubator für 2-3 min.</li>
		<li>Klopfen die 6-Well-Platte um die angeschlossenen Zellen verdrängen. Sofort 2 mL der EGM und Wiederherstellen der Zellen in einem Zentrifugenröhrchen 15 mL.</li>
		<li>Der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer zählen und rechnen die ursprünglichen Aussaatdichte.</li>
		<li>Spin der Zentrifuge 15 mL Röhrchen bei 400 X g für 5 min. Aufschwemmen der Zelle Pellet in EGM und Samen den t-25 Kolben mit ~ 500.000 Zellen. Markieren Sie dieses Fläschchen als Durchgang 1 und t-25 Kolben wieder in 37 ° C, 5 % CO 2-Inkubator. 
		Hinweis: Zellen können in EBM und DMEM, das Wachstum mit EGM vergleichen vernickelt werden.</li>
		<li>Für weitere Passagen, wenn der Kolben Zusammenfluss von 90 % erreicht, führen Sie Schritte 1.3.1 - 1.3.5 und reseed Zellen 10 4 Zellen/cm 2 T-75 oder T-175 Zellkulturflaschen. Fahren Sie mit der Charakterisierung der isolierten Zellen (Schritte 2 und 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Charakterisierung der isolierten Zellen mittels Western Blotting <ol><li>Lyse hinzufügen 50-100 µL Puffer bei jedem Durchgang Handlungsschritte auf Ausbau der isolierten Zellen zu charakterisieren. Proteine von etwa 500.000 oder mehr Zellen sammeln.</li>
	<li>Pipette oben und unten kräftig zu platzen die Zellen und Proteine. Sammeln und übertragen den Puffer zu einem Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Spin Microcentrifuge Schlauch bei 500 X g und den Überstand sorgfältig auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen. Benennen und Speichern der Rohre bei-80 ° C für die Langzeitspeicherung.</li>
	<li>Quantifizieren die Menge der Proteine in jedem Röhrchen verwenden entweder Bradford &#39; s oder BCA assay 27 , 28 , 29.</li>
	<li>Führen durch Western Blot mit Standardverfahren 27 , 28 , 29. 5 µg Gesamt-Protein für den Ausdruck von CD31, CD34, VEGFR2 und α-SMA zu analysieren. Α-Tubulin für die Normalisierung der Daten verwenden.</li>
</ol> 3. Indirekte Immunfluoreszenz <ol><li>18 mm Glasdeckgläser in 50 % igem Ethanol beschallen und trocknen Sie sie. Verlassen sauberen Deckgläsern in ein 12-Well-Platte über Nacht in der Biosicherheits-Haube mit einem UV-Licht auf um sie zu sterilisieren.</li>
	<li>Mantel Deckgläsern mit 50 & #181; g/mL Ratte tail ich Kollagen und übertragen Sie die Platte auf einem 37 ° C, 5 % CO 2 Inkubator für mindestens 60 min.</li>
	<li>Aspirieren das Kollagen und die 12-Well-Platte, die Deckgläsern waschen 1 mL 1 X PBS hinzufügen. 1 X PBS Aspirieren und zweimal wiederholen.</li>
	<li>Samen 250.000 kultiviert EPC in jedem gut und sie zurück in das 37 ° C, 5 % CO 2 Inkubator für mindestens 3 Tage vor Durchführung Immunostaining.</li>
	<li>Waschen die Platte 3 Mal mit 1 X PBS. Fügen Sie 1 mL eiskaltes Methanol in jede Vertiefung und Inkubation bei Raumtemperatur 15 Minuten, die Zellen zu beheben.</li>
	<li>Führen Immunostaining mit einem Standardprotokoll 27 , 28 , 29. Die Antikörper bei ihren entsprechenden Verdünnungen verwenden (z. B. CD31 (01:20), CD34 (01:50), α-SMA (1: 100) und VEGFR2 (01:50)).</li>
	<li>Bilder von den Immunostained Deckgläsern mit einem Epifluoreszenz Mikroskop nehmen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wie bereits erwähnt, anhaftende EPCs besitzen eine Kopfsteinpflaster-Morphologie. Unsere isolierten MNCs entwickelte sich von einer spindelförmigen Zelle Kolonie (Abbildung 2A-2D) in den frühen Stadien zu einer gepflasterten Kolonie (Abbildung 2E-2F) über einen Zeitraum von zehn Tagen in Kultur. EPC haben unterschiedlich von verschiedenen Forschungsgruppen, nämlich als späten endothelial Progenitor Zellen10</su...

Mehrere Forscher untersuchten die Eigenschaften und das Potential der menschlichen EPCs5,10,11,12,13. EPC können beschrieben werden als Zellen, die Fähigkeit zur Einhaltung endothelial Gewebe an Standorten von Hypoxie, Ischämie, Verletzungen oder Tumorbildung und tragen zur Bildung von neuen vaskulären Strukturen4,14in Umlauf. Ihre beobachteten Beteiligung an Neovaskularisation, in Form von postnatale Vaskulogenese, führte zu einem Verständnis der Pathophysiologie der diese Zellen und deren Anwendung in therapeutischen Anwendungen4,15, 16. die Anzahl der EPC im Einzelfall nachweislich korreliert mit Herz-Kreislauf-Pathologie9,15,16,17,18,19 ,20. Andere Studien haben auch differenzierte EPC in einem Ventil Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp und schlug vor, dass diese Zellen für Gewebe-Engineering Herz Ventile7,21verwendet werden könnten.
Bestimmte Zelle Oberfläche Moleküle EPCs isolieren musste wurden aufgrund von Unstimmigkeiten zwischen den Untersuchungen4nicht eindeutig identifiziert. Die Haftung der multinationalen Konzerne zu einer bestimmten Matrix, mit der Exposition gegenüber einer Vielzahl von Kulturbedingungen durchgeführt worden durch mehrere Gruppen1,17,22,23, was darauf hindeutet, dass vermeintliche EPCs kann unterschiedlichen phänotypische Eigenschaften anzeigen. Zu diesen Eigenschaften gehören einen Mangel an phagocytotic Fähigkeit, Rohr-Bildung in Matrigel und die Aufnahme von Low-Density-Lipoproteine Dil acetyliert. Die hohe klonogenen und proliferative Potential sind zwei Eigenschaften, die mit dem EPC hierarchisierte5werden können. EPC können auch in-vitro- Tubuli wenn mit menschlichen fetalen Lunge Fibroblasten4cocultured bilden. Diese Zellen sind Endothelzellen Oberflächenmarker zum Ausdruck zu bringen und einige der hämatopoetischen Marker13,24,25Teilen bekannt. Die positiv ausgedrückt Marker, die weithin für Phänotypisierung EPCs akzeptiert werden sind CD31, CD34, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (VEGFR2), von-Willebrand-Faktor (vWF), CD133, c-Kit und vaskulären endothelialen Cadherin (VE-Cadherin)4 , 18. Zellen, die CD90, CD45, CD14, CD115 oder Alpha-Glattmuskel Aktin (α-SMA) Co ausdrücken gelten nicht als EPC wegen ihrer begrenzten proliferative potenzielle, Fähigkeit, Phagozytose von Bakterien und die Unfähigkeit, de Novo menschlichen bilden Schiffe in Vivo4,7. Dieser Artikel beschreibt ein modifiziertes Protokoll für die Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut ohne die Notwendigkeit für jede Zelle sortieren Protokolle. In diesem Artikel verwendet CD31, CD34 und VEGFR2 als die positive Markierungen mit α-SMA als negativer Indikator.
In diesem Artikel schlagen wir vor, dass eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von endothelialen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut ohne Zelle sortieren mit endothelialen Wachstumsmedium ergänzt mit Wachstumsfaktoren (EGM) spezialisiert. Diese EGM vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und enthält Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), die das Überleben, Proliferation und Migration von Endothelzellen26zu verbessern. Es enthält auch Ascorbinsäure, die für die Aufrechterhaltung der Kopfsteinpflaster-Morphologie der Zellen verantwortlich ist; Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-1 (IGF-1), die Angiogenese und wandernden Funktion bietet; und Heparin, wodurch verbesserte Langzeitstabilität von Wachstumsfaktoren in der mittleren26. Andere Wachstumsfaktoren hinzugefügt, um die endotheliale Zellkulturmedium umfasst die Supplementation mit epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), die hilft, anregende Zell-Proliferation und Differenzierung und Hydrocortison, die die Zellen EGF26 sensibilisiert . Wir zeigen, dass die Nutzung dieses Mediums spezifischen Wachstumsraten höhere Anzahl von EPC im Vergleich zu Endothelzellen basal Medium (EBM) oder Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM ergibt).

<table><tbody><tr><td><stark>A) Zur Isolierung und Kultivierung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Dieses Produkt enthält alle Wachstumsfaktoren, die zur Herstellung des endothelialen Wachstumsmediums</td></tr> für <tr><td>fetales Rinderserum</td><td>benötigt werden Thermofisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin-Glutamin (100x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Heatlhcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid-Stammzelltechnologien</td><td></td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Rattenschwanz I Kollagen</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Amresco</td><td>0714-500ML</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Puffer</td><td>Thermofisher</td><td>Scientific 15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Thermofisher</td><td>Scientific 10566-016</td><<td></td></tr><tr><td>strong>B) Antikörper und Zelllysate</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>1:250 Verdünnung&nbsp; für Western Blotting</td></tr><tr><td>CD34</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7045</td><td>1:100 Verdünnung für Western Blotting</td></tr><tr><td>&alpha;-SMA</td><td>abcam</td><td>ab5694</td><td>1:100 Verdünnung für Western Blotting</td></tr><tr><td>&alpha;-Tubulin</td><td>abcam</td><td>ab7291</td><td>1:2.500 Verdünnung für Western Blotting</td></tr><tr><td>VEGFR2</td><td>abcam</td><td>sc504</td><td>1:100 Verdünnung für Western Blot</td></tr><tr><td>Endothelzelllysat für menschliche Nabelvenen</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc24709&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Primäre</td><td></td><td></td><td>Zelllinie, die aus dem eigenen Labor kultiviert und mit RIPA-Puffer lysiert</td></tr> wurde<tr><td>C) Western Blot und Immunfärbung</td>10x Tris/Glycin/SDS-Puffer <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>161-0772</td><td>Wird als laufender Puffer</td></tr><tr><td>verwendet 10x Tris/Glycin-Puffer</td><td>Biorad</td><td>161-0771</td><td>Wird als Transferpuffer verwendet</td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfermembran</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL0010</td><td>Hierbei handelt es sich um eine PVDF-Transfermembran mit 45 &; Mikro; m Porengröße und wird im Protokoll als Western Blot Membran</td></tr><tr><td>erwähnt 4x Laemmli Probenpuffer</td><td>Biorad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Biorad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>10% Kriterium TGX Fertigteilgel</td><td>Biorad</td><td>5671033</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Wird zur Montage von immungefärbten Deckgläsern für die Langzeitlagerung</td> verwendet</tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung der endothelialen vorläuferzellen aus menschlichen nabelschnurblut

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Die Existenz von endothelialen Progenitorzellen (EPC) im peripheren Blut und seine Einbindung in Vaskulogenese wurde zuerst von Ashara und Kollegen1berichtet. Später, dokumentiert andere die Existenz von ähnlichen Arten von EPC aus dem Knochenmark2,3. Vor kurzem hatte Yoder und Ingram zeigte, dass Nabelschnurblut EPCs abgeleitet ein höheres proliferative Potential im Vergleich zu denen von Erwachsenen peripheren isoliert Blut-4,5,6. Neben der postnatalen Vaskulogenese beteiligt zu sein, haben EPC auch Versprechen als eine Zelle Quelle für die Erstellung von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil Konstrukte7,8gezeigt. Verschiedenen Isolierung Protokolle sind vorhanden, von denen einige beinhalten Zellsortierung mononukleären Zellen (MNU) abgeleitet aus den Quellen erwähnt mit Hilfe von Endothelzellen und hämatopoetischen Marker oder Kultivierung dieser multinationalen Unternehmen mit spezialisierten endothelial Wachstum Medium, oder eine Kombination dieser Techniken-9. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultur des EPC mit spezialisierten Endothelzellen Medium ergänzt mit Wachstumsfaktoren, ohne den Einsatz von Immunosorting, gefolgt von der Charakterisierung von der isolierten Zellen mittels Western blotting und Immunostaining.

Isolation und Ausbau der endothelialen Vorläuferzellen: Ein Schaltplan (Abbildung 1) steht zur Verfügung, zeigt das gesamte Protokoll. Die verschiedenen Blut Komponentenschichten wurden nach Dichte Gradienten Zentrifugieren der menschlichen Nabelschnurblut mit Dichte Gradienten Medium beobachtet. Bei der Aussaat MNCs auf die Kollagen-behandelten Platten, wurde erstmals Auswuchs von Kolonien zwischen 5 Tagen und 7 (Abb....

Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, endotheliale Vorläuferzellen aus menschlichem Nabelschnurblut zu isolieren. Diese Methode beschreibt die Isolierung endothelialer Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut für deren potenzielle Verwendung als autologe Zellen zur Gewebezüchtung vaskulärer Transplantate. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der Isolationsprozess in spezialisierten Medien durchgeführt werden kann, ohne dass eine Antikörpersortierung erforderlich ist.Die isolierten endothelialen Vorläuferzellen können zur Untersuchung der Neovaskularisation verwendet werden, und es gibt Berichte, die darauf hindeuten, dass diese Zellen auch als Biomarker zur Identifizierung von Patienten mit Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen dienen können. Bevor mit dem Isolationsverfahren begonnen wird, beschichte man sechs-Loch-Platten mit je zwei Milliliter frisch hergestellter Rattenschwanz-Kollagen-Lösung Typ I pro Loch. Anschließend wird die Platte mindestens eine Stunde lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 äquilibriert.Anschließend verdünnen Sie etwa 25 Milliliter Nabelschnurblut mit HBSS in einem Verhältnis von eins zu eins. Fügen Sie danach

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video-Protokoll zeigt die Isolierung und Kultivierung der menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) aus humanen Nabelschnur. Nach der Isolierung dieser Zellen in vitro Angiogenese-Assays, wie die optimierte Fibringel Bead Assay auch durch die Hughes-Labor nachgewiesen werden kann, verwendet werden.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

Endothelial Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) im Umlauf Endothelzellen mit robusten klonale proliferative Potential zeigen, dass...

Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Endothelial Kolonie-bildenden Zellen aus humanem Nabelschnurblut

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut. Ein ausreichender Menge und Qualität von Nukleinsäuren können aus den Zellen extrahiert werden und in nachfolgenden Assays DNA oder RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige Erzeugung und Charakterisierung von Blutwachstums-Endothelzellen (BOECs) aus einem kleinen Volumen von adultem peripherem Blut. BOECs können als Surrogat für Endothelzellen von Patienten mit Gefäßerkrankungen und als Substrat für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen verwendet werden.

Generation und Kultur der Blut Outgrowth Endothelzellen aus menschlichen peripheren Blut-

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) sind entscheidend in der Neovaskularisation von ischämischen Geweben beteiligt. Dieses Verfahren beschreibt die Isolierung von menschlichem EPCs aus peripherem Blut sowie die Identifizierung ihres Migrationspotential gegen Serumproben von Herzchirurgiepatienten.

Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen von gesunden Freiwilligen und ihre Migratory Potential Beeinflusst von Serumproben nach einer Herzoperation

Hier beschreiben wir die Ex Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut behandelt mit einer Kombination aus einem Zytokin-cocktail und VPA. Diese Methode führt zu einem bedeutenden Grad von ex-Vivo Expansion der primitiven HSCs entweder für klinische oder Laboranwendungen.

Ex-Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen aus menschlichen Nabelschnur Blut abgeleitet CD34+ Zellen mit Valproinsäure

Hier stellen wir ein Protokoll zur immunphenotypischen Charakterisierung und Zytokin-induzierten Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34+ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Linien vor. Die Anwendungen dieses Protokolls umfassen Untersuchungen über die Wirkung von myeloischen Krankheitsmutationen oder kleinen Molekülen auf die myeloische Differenzierung der CD34+ Zellen.

Panmyeloische Differenzierung von humanem Cordblood abgeleitet CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Lernen Sie die Isolierung endothelialer Vorläuferzellen aus menschlichem Nabelschnurblut für Gewebetechnik und kardiovaskuläre Forschung. Diese Methode ermöglicht effiziente Zellgewinnung ohne Flusszytometrie.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

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