Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff

Menschlichen Nabelschnur (UC) erhalten Sie während der Perinatalperiode durch Frühgeburt, Begriff und postterm Lieferung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-mesenchymale Stammzellen (UC-MSCs) von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Beratung von UCMSC zu beantworten, wie die beste Quelle von USMSC für die Zelltherapie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine konsistente Isolierung und eine kräftige Proliferation von UCMSC von Säuglingen vor und zu einem Begriff ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von hartnäckigen Krankheiten.

Obwohl diese Methode Einblick in die Beratung von UCMSC bieten kann, kann es auch auf andere MSC-Quellen angewendet werden, wie Fettgewebe, Synovium, Haut, Zahnfleisch und so weiter. Im Allgemeinen wird eine Person, die mit dieser Methode neu ist, kämpfen, weil es so viele Variationen in den Schritten der Nabelsektion und der mesenchymalen Stammzellisolierung gibt. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da diese Schritte schwer zu erlernen sind, da mehrere Punkte übersehen werden können.

Um mit der Sezieren der Nabelschnur zu beginnen, bereiten Sie zunächst eine Metallschale, eine sterilisierte Schere und Zange, zehn Milliliter Pipetten, 25 Milliliter Pipetten und zwei 60-Millimeter-Gewebekulturgerichte vor. Erwärmen Sie PBS-gereinigte Enzymmischungen, ein 500 Milliliter reduziertes Serummedium und Kulturmedium, auf Raumtemperatur. Entfernen Sie zuvor isolierte Nabelschnur aus einem 50 Milliliter Rohr in alpha MEM, und legen Sie es in die Kunststoffschale.

Wiegen Sie die Nabelschnur, und verwenden Sie dann sterilisierte Schere, um fünf Gramm der Schnur zu sezieren. Um die Nabelschnur zu sterilisieren, verwenden Sie zehn Milliliter Pipette, um zehn Milliliter 70 Prozent Ethanol darüber zu gießen. Dann waschen Sie die Schnur zweimal, indem Sie zehn Milliliter PBS mit zehn Milliliter Pipette hinzufügen.

Legen Sie die gewaschene Nabelschnur in die sterilisierte 60-Millimeter-Gewebekulturschale und fügen Sie zehn Milliliter reduziertes Serummedium und 0,5 Milliliter gereinigte Enzymmischungen hinzu. Verwenden Sie sterilisierte Schere und Zange, um die Schnur in zwei bis drei Millimeter Stücke zu schneiden. Legen Sie die Schale in einen fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.

Dann die teilweise verdauten Stücke in kleinere Stücke schneiden und bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator bebrüten, bis das Homogenat zähflüssig wird. Stellen Sie schließlich sicher, dass das Homogenat leicht durch eine 25-Milliliter-Pipette fließt. Zuerst vier, 50 Milliliter Kunststoffrohre in einer 500-Milliliter-Flasche Kulturmedium zubereiten.

Verwenden Sie eine 25-Milliliter-Pipette, um die Nabelschnur homogenat in zwei, 50 Milliliter Kunststoffrohre mit etwa 7,5 Milliliter in jedem Rohr zu teilen. Dann fügen Sie 20 Milliliter Kulturmedium in jede Röhre und gut mischen. Sammeln Sie jedes Homogenat mit 25 Milliliter Pipette und filtern Sie durch ein 100 Mikrometer Zellsieb auf einem neuen 50 Milliliter Sammelrohr platziert.

Zentrifugieren Sie zwei Rohre mit Filtraten bei 1000g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der zentrifugieren, den Überstand vorsichtig ansaugen und entsorgen. Fügen Sie fünf Milliliter Kulturmedium zu jeder Röhre hinzu, und setzen Sie die Zellpellets wieder auf.

Übertragen Sie die Zellsuspension in eine neue 60-Millimeter-Platte und Kultur bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator. Um die UCMSKs zu kulturen, erwärmen Sie die PBS, Trypsin EDTA und Kulturmedium auf Raumtemperatur. Wenn Zellen an der Platte befestigt sind, entfernen Sie das Medium und waschen Sie zweimal mit fünf MilliliterPBS, um Schmutz und rote Blutkörperchen zu entfernen.

Fügen Sie das Kulturmedium hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator. Ersetzen Sie das Medium zweimal pro Woche, und kulturieren Sie die Zellen, bis sie 90 bis 100 Prozent Konfluenz erreichen. Dann waschen Sie die Zellen zweimal mit fünf Milliliter PBS, fügen Sie 0,5 Milliliter Trypsin EDTA hinzu und inkubieren bei 37 Grad Celsius für fünf bis zehn Minuten.

Wenn Zellen gerundet und abgetrennt werden, fügen Sie neun Milliliter Kulturmedium hinzu und mischen Sie sie gut, um Trypsin zu inaktivieren. Fügen Sie die Zellaufhängung in eine neue 100-Millimeter-Platte ein. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator, bis sie 90 bis 100 Prozent Konfluenz erreichen.

Wiederholen Sie die Trypsinisierung und teilen Sie sich in zwei neue Platten, bis zum zehnten Durchgang. Der Oberflächenmarkerausdruck von UCMSKs wurde als Kriterium für ihre Charakterisierung verwendet. Bei der Inkubation mit geeigneten Antikörpern und der Analyse durch Durchflusszytometrie wurden sie positiv für die MSC-Signaturmarker gefunden, aber negativ für Monozytenmakrophage, negativ für hematapoetische Stammzelle und Ephithelzelle, negativ für B-Zelle, negativ für Pan-Leukozyten und negativ für große Histokompatibilitäts-Komplexe Marker.

Um die Trilineage-Differenzierungskapazität von USCMSc von Frühgeborenen und Term-Säuglingen zu bewerten, wurden die Zellen induziert, sich in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten zu differenzieren. UCMSKs differenziert erfolgreich in alle drei Arten von mesodermalen Zellen, die ihre Differenzierungsfähigkeit bestätigen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass es vier kritische Schritte gibt.

Schneiden Sie die Schnur in zwei bis drei Zentimeter Stücke, schneiden Sie in kleinere Stücke, um sicherzustellen, dass das Homogenat leicht durch eine 25-Milliliter-Pipette fließt, und filtern Sie das Homogenat durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb.