Ex-vivo-Bildgebung von Postnatale Kleinhirn-Körnerzellmigration mittels konfokaler Makros

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, wandernde Neuronen in lebenden Hirnschnitten sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zuerst das Kleinhirn von einer P 10-Ratte präpariert wird. Die nächsten Schritte sind die Präparierung akuter Kleinhirnschnitte und die Markierung der Neuronen mit einer Fluoreszenzsonde.

Dann wird das Zeitraffer-Experiment durch makrokonfokale Bildgebung oder konfokale Mikroskopie durchgeführt. Der letzte Schritt besteht darin, die Neuronen in den resultierenden Filmen zu verfolgen. Letztendlich wird die Ex-vivo-Mikroskopie verwendet, um die Rolle endogener Faktoren oder toxischer Substanzen zu zeigen, die die neuronale Migration regulieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass die makrokonfokale Bildgebung das Sehgefühl beim Verlassen von zerebralen Schnitten direkt auf dem Leistenansatz erhöht. Ich hatte die Idee zu dieser Methode, als ich Schwierigkeiten hatte, zerebrale Schnitte für konfokale Mikroskopie-Experimente zu übertragen und zu stabilisieren. Beginnen Sie damit, den Schädel eines enthaupteten P 10-Rattenwelpen zu erreichen, indem Sie mit einer feinen Irisschere vorsichtig zwei seitliche Schnitte von der Basis zur rostralen Region des Schädels vornehmen. Entfernen Sie dann den präparierten Schädel mit zwei Zangen Nummer drei, wodurch die Adhäsion zwischen Gehirn und Schädel gebrochen wird.

Schöpfen Sie nun das Gehirn mit dem Löffelende eines Spatels heraus und geben Sie es in eine 35-Millimeter-Petrischale mit zwei Millilitern kaltem HBSS auf Eis. Isolieren Sie nun unter einem Stereomikroskop das Kleinhirn vom Gehirn durch D-Schnittwunden mit zwei Pinzetten Nummer drei. Den Kleinhirn in eine neue Schüssel mit eiskaltem Puffer geben.

Entfernen und entsorgen Sie dann mit denselben Werkzeugen das verbleibende Rückenmark und die Peeling-Membran. Bereiten Sie einen soliden Skalpellgriff mit Nummer drei und einer chirurgischen Klinge Nummer 15 vor. Schneiden Sie mit der Klinge unter einem Stereomikroskop das Kleinhirn zwischen dem Verus und der rechten Hemisphäre auf.

Geben Sie nun am Vibrato einen Tropfen Cyanokristallatkleber auf die Probenscheibe und warten Sie 15 bis 25 Sekunden, bis sich der Lösungsmitteldampf aufgelöst hat, bevor Sie das Kleinhirn auf die Scheibe übertragen. Befestigen Sie dann den Rand des Kleinhirns an der Probenscheibe und warten Sie 10 Sekunden. Führen Sie nun mit dem Manipulator die Probenscheibe so in die Pufferschale ein, dass die Querachse des Kleinhirns senkrecht zum Messerhalter steht.

Achten Sie darauf, die Disc mit einem Alaunschlüssel zu sichern. Decken Sie dann das Kleinhirn vorsichtig mit HBSS ab und laden Sie Crushed Ice in das Kühlbad. Um die Probe zu schneiden, positionieren Sie eine gereinigte Klinge so, dass sich ihre Kante direkt hinter der hinteren Kante der Probe befindet.

Definieren Sie dies als Ausgangspunkt für die Vereisung. Verwenden Sie dann den Vorwärtsbefehl, um den Endpunkt so zu definieren, dass er knapp hinter der Vorderkante der Probe liegt. Stellen Sie nun die Scheibendicke auf 180 Mikrometer ein.

Stellen Sie dann die Schnittgeschwindigkeit auf 2,5 und die Frequenz auf acht ein und beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe. Sammle bis zu fünf Scheiben pro Kleinhirn. Nehmen Sie jeden Abschnitt mit einer abgeschnittenen Pipette aus breitem Wildschweinglas auf.

Übertragen Sie die Abschnitte in eine Schüssel mit kaltem HBSS auf Eis. Nachdem Sie die Scheiben unter einem Stereomikroskop entnommen haben, entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute mit zwei Pinzetten Nummer fünf. Trennen Sie die LOEs auch vorsichtig, um die Sondenbelastung zu verbessern.

Nachdem Sie die Probe geschnitten haben, verwenden Sie eine abgeschnittene breite Eberpipette, um sie mit etwas HBSS auf eine Sechs-Well-Platte zu übertragen, die bis zu drei Scheiben in jede Vertiefung bestückt. Nachdem Sie das Medium in jedem geladenen Medium entleert haben, fügen Sie fünf Milliliter Ladelösung mit 10 Mikromolar des Fluoreszenzfarbstoffs hinzu, um die Proben vor Licht zu schützen, und decken Sie die Platte mit Folie ab. Setzen Sie dann die Platte auf einen Mutator, der auf 35 U/min eingestellt ist.

Lassen Sie die Platte 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, damit der Farbstoff die Zellvertiefungen markieren kann. Übertragen Sie nun die Scheiben wie zuvor auf die Membran eines Transwell-Einsatzes, der drei Mikrometer Poren hat. Saugen Sie dann das Lademedium an, so dass nur die Scheiben übrig bleiben.

Entferne nun den Einsatz und die Scheiben, um die Vertiefung mit 1,9 Millilitern DMEM zu füllen. Setzen Sie dann den Einsatz wieder ein und fügen Sie weitere 100 Mikroliter DMEM hinzu, um das Gewebe zu bedecken. Inkubieren Sie dieses Präparat zwei Stunden lang, danach sind die Körnerzellen sichtbar.

Übertragen Sie die Platte ohne Deckel in eine Klimakammer mit konstantem Gasfluss auf einem konfokalen Mikroskop. Platzieren Sie dann eine Glasabdeckung auf dem Platteneinsatz des konfokalen Mikroskops für Zeitraffer-Experimente. Lassen Sie die Zellen weitere zwei Stunden in der Kammer inkubieren, bevor Sie fortfahren.

Um die Wanderung der Körnerzellen in den Gewebescheiben sichtbar zu machen, beleuchten Sie das Präparat mit 488 Nanometern Licht und verwenden Sie ein Two x Dry-Objektiv. Erkennen Sie Fluoreszenzemissionen von 500 bis 530 Nanometern mit Bild J.Führen Sie für jedes Bild des Zeitrafferfilms eine Zack-Projektion im Standardabweichungsmodus durch, passen Sie den Kontrast und die Helligkeit jedes Bildes so an, dass die markierten Körnerzellen leicht zu sehen sind. Wählen Sie nun das manuelle Tracking-Plugin aus dem Menü der Partikelanalyse.

Verwenden Sie das Plugin, um auf den zentralen Punkt jedes beschrifteten Zellkörpers während der Zeitraffer-Bildsequenz zu klicken. Exportieren Sie dann die Tracking-Rohdaten zur weiteren Analyse in eine Tabelle. Organisieren Sie die exportierten Tracking-Rohdaten aus Image J mit einem intelligenten, hausgemachten Tool neu, das jede Zelle und die zugehörigen Positionen mithilfe des Programms identifiziert.

Berechnen Sie die Gesamtfahrstrecke und die durchschnittliche Migrationsgeschwindigkeit für jede Zelle. Im frühen postnatalen Kleinhirn zeigen Körnerzellen signifikante Veränderungen in ihrer Art und Geschwindigkeit der Migration, wenn sie verschiedene kortikale Schichten durchqueren. CTG-markierte Körnerzellen in Kleinhirngewebeschnitten von PM-Ratten wurden untersucht.

Wie beschrieben, wanderten die Körnerzellen radial in der molekularen Schicht mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 18 Mikrometern pro Stunde. Ein anderes Präparat wurde dann verwendet, um die Wirkung von Medikamenten zu testen, von denen erwartet wird, dass sie die Migrationsrate verändern. Die Anwendung von Pay Cap 38 auf das Kulturmedium führte zu einer Geschwindigkeitsabnahme der Körnerzellen in der Molekülschicht um 79 %, was einem Abfall auf 2,5 Mikrometer pro Stunde entspricht.

Die Verabreichung von PI one, einem Inhibitor von endogenem TPA, reduzierte die Geschwindigkeit der Körnerzellmigration um 78% von der Kontrollgeschwindigkeit auf 4,2 Mikrometer pro Stunde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Zellen in der sich entwickelnden Theorieballon verfolgen können. Während ich dieses Verfahren versuche, ist es wichtig, daran zu denken, angemessene und konstante Umweltparameter bereitzustellen, die für die Zellmigration nach ihrer Entwicklung unerlässlich sind.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, die faktischen Prozesse im Gehirn zu erforschen.