Ex-vivo-Kultur von Schlundbögen auf Herz und Muskelvorläuferzellen und ihre Nische Studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Kultivierung von Rachenbögen, um die Biologie von Herz- und Muskelvorläuferzellen und ihrer Mikroumgebung zu untersuchen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Erhalt, die Migration und das Schicksal von Herz- und Muskelvorläuferzellen im pharyngealen Mesoderm zu untersuchen. Dazu werden zunächst die Rachenbögen eines frisch entnommenen Mausembryos präpariert. Anschließend werden die Bögen in eine Medienfolie gelegt, um ihre Befestigung zu erleichtern.

Die Zellen innerhalb des pharyngealen Explans oder die Migration aus dem pharyngealen Explan werden dann täglich überwacht. Letztendlich kann die Cree-basierte Fluoreszenz-Lineage-Tracing verwendet werden, um die Migration, Differenzierung und Erneuerung der Herz- und Muskelvorläufer innerhalb der Pharynxbögen zu verfolgen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um das einzige ex vivo-System handelt, mit dem eine sich erneuernde Population von Herz- oder Muskelvorläufern und deren Mikroumgebung in vitro untersucht

Die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die elterlichen Bögen in den 9,5 Tage alten Mausembryonen nur zwei bis 300 Mikrometer groß sind, was es sehr schwierig macht, sie ohne vorherige Visualisierung zu identifizieren und zu präparieren. Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen. Coda 12, Well-Platte mit PBS, ergänzt mit 10%FBS.

Ersetzen Sie die Beschichtungslösung nach einer Stunde durch 200 Mikroliter serumfreies Medium pro Vertiefung. Schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass ein Film aus Medium die gesamte Oberfläche des Bohrlochbodens bedeckt. Als nächstes besprühen und reinigen Sie den Bauch einer euthanasierten schwangeren Maus mit 70% Ethanol.

Machen Sie dann mit sterilen Werkzeugen einen 0,5 Zentimeter großen Schnitt im Nabelbereich. Fassen Sie die Haut über und unter dem Schnitt und ziehen Sie sie sanft in entgegengesetzte Richtungen. Machen Sie dann einen V-förmigen Schnitt in der Membran vom Nabel bis zu den Eierstöcken auf jeder Seite des Bauches, um die Gebärmutter freizulegen.

Den Eileiter, der die Gebärmutter mit dem Eierstock verbindet, mit einer Pinzette und den Eileiter auf der Eierstockseite mit einer Schere einklemmen, um die Gebärmutter vom Eierstock zu befreien. Ziehen Sie die Gebärmutter vorsichtig mit der Brust nach oben. Schneiden Sie die Gebärmutter aus der Blasenregion heraus.

Ziehen Sie dann die Gebärmutter weiter an der Brustscheide nach oben und schneiden Sie die Gebärmutter auf der anderen Seite ab, wodurch die Gebärmutter aus der Bauchhöhle gelöst wird. Übertragen Sie die Gebärmutter in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 Millilitern kaltem, sterilem PBS mit Kalzium und Magnesium. Schütteln Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang vorsichtig, um das Blut auszuwaschen.

Übertragen Sie dann die Gebärmutter mit einer Pinzette in eine 10-Milliliter-Schale und geben Sie fünf Milliliter kaltes PBS in das Gewebe. Verwenden Sie dann unter einem Stereomikroskop zwei Pinzettenpaare, um die Gebärmutter vorsichtig zu öffnen und die Fruchtsäcke mit den Embryonen nacheinander zu präparieren. Kneifen und entfernen Sie dann für jeden Embryo vorsichtig den Fruchtwassersack mit einer Pinzette, wobei Sie das andere Paar verwenden, um den Sack vom Embryo zu trennen und zu lösen.

Legen Sie den Embryo auf die Seite und schneiden Sie mit einer Pinzette den ersten und zweiten Bogen hinter dem Herzen zwischen dem Bogen und dem Rachenbeutel durch. Nach dem Umdrehen des Embryos und dem Schneiden des Bogens auf der anderen Seite wird gerade gezeigt. Schneiden Sie den kardialen Ausflusstrakt ab, der die Bögen mit dem Embryo verbindet, und entfernen Sie sie.

Kneifen und lösen Sie jeden der beiden Pharynxbögen aus dem verbleibenden kardialen Ausflusstrakt und dem Vier-Darm-Endoderm. Übertragen Sie dann wiederum das Gewebe in die Mitte der einzelnen Vertiefungen der beschichteten 12-Well-Platte, wobei darauf zu achten ist, dass die Bögen nicht mit Medium bedeckt sind. Um die Befestigung zu erleichtern, inkubieren Sie die Bögen unter Zellkulturbedingungen.

Nach zwei Stunden fügen Sie 200 Mikroliter 37 Grad Celsius warmes serumfreies Medium an den Seiten der Vertiefungen hinzu und achten Sie darauf, dass die Bögen befestigt bleiben, und inkubieren Sie das Gewebe über Nacht. Am nächsten Tag bestätigte sich visuell, dass die Bögen noch befestigt sind. Geben Sie dann vorsichtig weitere 200 Mikroliter 37 Grad Celsius Serum-freies Medium in die Vertiefungen.

Wenn sich das Gewebe löst und zu schwimmen beginnt, entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette, ohne die Bögen zu entfernen, bis nur noch ein Film aus Medium übrig ist. Schieben Sie dann mit der Pipettenspitze die Bögen zurück in die Mitte der Vertiefung und inkubieren Sie das Gewebe erneut. Ersetzen Sie während der Entwicklung jeden zweiten Tag verdampftes Medium durch 100 bis 200 Mikroliter frisches Medium.

Vorläuferzellen des Gesichtsmuskels und des Herzens können verfolgt werden, während sie sich vermehren und vom ersten und zweiten Rachenbogen zur Kopf- bzw. Herzmuskulatur wandern. Die Kultivierung der Rachenbögen bietet eine einzigartige Möglichkeit, die Herz- und Muskelentwicklung ex vivo im Detail zu untersuchen. Unter Verwendung des CRE-Lock-Systems können Mesodermnachkommen von Mäusen durch fluoreszierende Reporter nach der Cree-Expression innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach der ex vivo-Kultur nach 36 bis 72 Stunden verfolgt werden.

Die Bildung von Kardiomyozyten kann visuell bestätigt werden, indem Cluster wandernder Zellen innerhalb des zweiten Bogens spontan zusammengezogen werden, sowie durch die Analyse spezifischer Kardiomyozytenmarker. Nach drei- bis siebentägiger Kultivierung kann die Bildung von Myotuben und Gesichtsmuskeln als längliche und spontan zuckende Zellen innerhalb des ersten Bogens und durch die Analyse spezifischer Muskelmarker nach seiner Entwicklung sichtbar gemacht werden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Herz- und Muskelstammzellbiologie den Weg, expandierende Vorläuferzellen und ihre Nischen in vitro direkt zu überwachen und zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Foralbögen von der Entwicklung von Mausembryonen bis hin zur In-vitro-Kultur seziert, was die Untersuchung der progenerativen Entwicklung von Herz und Muskeln ex vivo ermöglicht.