Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Das Modell der chronischen kontraktilen Aktivität des Trainings ist nützlich, um die Anpassung der Skelettmuskulatur an Trainingsreize in vivo zu untersuchen. Insbesondere erhebt dieses Modell die phänotypischen Anpassungen eines sechswöchigen Trainingsprotokolls innerhalb von sieben Tagen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Muskelphysiologie wie mitochondriale Biogenese, Autophagie und viele andere trainingsassoziierte zelluläre Anpassungen zu beantworten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Beobachtung muskelspezifischer Anpassungen über einen kurzen Zeitraum von sieben Tagen ermöglicht, im Vergleich zu anderen Trainingsprotokollen, die mehrere Monate benötigen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des Muskelschwundalters, da sich gezeigt hat, dass chronische Muskelstimulation eine Wirkung auf die Verbesserung der altersbedingten Muskelschwäche hat. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, den Nervus peroneus communis zu markieren und elektrische Spulen an beiden Enden anzubringen, da dies Übung und Präzision erfordert.

Beginnen Sie mit der Anästhesie der Ratte unter einer Inhalation von ein bis 3 % Isofluran mit Sauerstoff und bestätigen Sie die vollständige Sedierung, indem Sie die Reaktion auf ein Einklemmen der Zehen der hinteren Gliedmaßen überprüfen und die Atemtiefe und -frequenz beobachten. Tragen Sie Augenschmiermittel auf die Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden, und legen Sie die Ratte auf ein Heizkissen mit niedriger bis mittlerer Einstellung. Rasieren Sie vorsichtig die linke hintere Extremität sowie einen Streifen um den Oberkörper vom Nacken bis hinter die Vordergliedmaßen und über den vorderen Thorax.

Wischen Sie die rasierten Stellen zur Desinfektion vorsichtig mit Jod und Ethylalkohol ab. Während das Tier auf dem Bauch liegt, verwenden Sie ein steriles Skalpell mit einer Klinge mit der Nummer 10, um einen kleinen Schnitt von etwa 0,5 Zentimetern am Nacken in der Mitte der rasierten Region zu machen. Rollen Sie dann das Tier auf die rechte Seite und machen Sie einen zwei bis drei Zentimeter langen Schnitt in die Haut der linken Hintergliedmaße zwischen dem Grübchen des Kniegelenks und nahe dem Ursprung des Schwanzes.

Mit einer stumpfen, gebogenen chirurgischen Schere wird der subkutane Bereich auf etwa 3,5 bis vier Zentimeter zerlegt, wobei die Haut vom darunter liegenden Muskel getrennt wird, um eine Tasche zwischen der offenen Haut und dem darunter liegenden Muskel zu bilden. Verwenden Sie als Nächstes eine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt von weniger als 0,5 Zentimetern am Bizeps femoris zu machen, um sicherzustellen, dass die Spitzen der Schere direkt durch den Muskel schneiden. Öffnen Sie dann vorsichtig den Schnittbereich, bis die inneren Muskelgruppen und der Nervus peroneus communis sichtbar sind.

Seien Sie äußerst vorsichtig, um zu vermeiden, dass der Nerv durchtrennt oder beschädigt wird. Bereiten Sie als nächstes 50 bis 60 Zentimeter PTFE-beschichteten feinen Edelstahldraht vor und falten Sie ihn in der Mitte. Haken Sie den gefalteten Teil des Drahtes in den Schlitz eines 30 Zentimeter langen Edelstahlstabs ein.

Führen Sie den Draht mit dem Stab durch die offene Tasche der hinteren Gliedmaße das Bein hinauf und entlang der Mitte des Rückens in einem L-förmigen Muster, um den kleinen Schnittbereich im Nacken zu erreichen. Befestigen Sie das Fenster, indem Sie es mit Metallhaken aufziehen, bis die Größe des Fensters etwa 1,5 Quadratzentimeter beträgt und der Nervus peroneus in der Mitte des Fensters liegt. Ziehen Sie mit einem Skalpell die Enden des Drahtes vorsichtig um 1,5 Zentimeter ab.

Wickeln Sie die abisolierten Drahtenden fünfmal um eine abgestumpfte 21-Gauge-Nadel, um eine Spule zu bilden. Sobald die Spulen richtig hergestellt sind, lösen Sie die Nadel von ihnen. Machen Sie einen Knoten ganz am Ende der Spirale und nähen Sie ihn auf der linken Seite des Nervs, wobei Sie darauf achten, dass die Spirale 1,5 bis 2,5 Millimeter vom Nerv entfernt ist.

Um die Spirale zu sichern, legen Sie zwei oder drei zusätzliche Nähte entlang der Spirale an. Dieser Schritt erfordert viel Übung und Geduld, um eine Schädigung des Nervs und des darunter liegenden Muskels zu vermeiden und einen möglichst gleichmäßigen Stimulationszustand bei allen Tieren zu erreichen. Es ist am besten, einen erfahrenen Forscher zu haben, der alle chirurgischen Eingriffe während einer Studie durchführt.

Tragen Sie zwei oder drei Tropfen Antibiotikalösung auf und nähen Sie das Fenster vorsichtig mit Seide der Größe 5-0. Wickeln Sie den restlichen lockeren Draht locker auf und schieben Sie ihn in die Unterhauttasche oberhalb des genähten Schnitts des Musculus biceps femoris oberhalb der Hüfte. Tragen Sie zwei bis drei Tropfen Antibiotikalösung auf und verschließen Sie die offene Haut durch Heften.

Bringen Sie als Nächstes das Tier in die Brustbeinposition und schneiden Sie die Drahtschlaufe ab, die aus dem Schnitt oben am Hals kommt, um zwei Drahtenden zu bilden. Streifen Sie mit einem Skalpell die Enden der Drähte um 0,5 Zentimeter ab. Schneiden Sie alle ausgefransten Drähte ab.

Schieben Sie die abisolierten Teile der Drähte langsam in das Loch der Stiftsockel und löten Sie die Drähte mit einem Lötkolben auf die Stiftsockel. Führen Sie die mit dem Stift verbundenen Drahtenden durch ein 4,4 Zentimeter steriles Mullkissen. Führen Sie dann die Drähte durch das Loch im Boden der Stimulatorbox.

Stecken Sie die Stifte in die Anschlussbuchsen an der CCA-Einheit. Setzen Sie das CCA-Gerät vorsichtig mit einem klebrigen Reißzweck in die Kammer ein, um das CCA-Gerät am Boden der Kammer zu befestigen. Verwenden Sie Sporttape oder poröses chirurgisches Klebeband, um die Kammer um den rasierten Oberkörper zu fixieren.

Verschließen Sie die Oberseite der Kammer mit drei Lagen Klebeband. Wickeln Sie zum Schluss Klebeband um die Seiten der Stimulatorbox, um die Box zu sichern. Überprüfen Sie, ob der CCA funktioniert, indem Sie das Gerät einem einzigen Impuls infrarotfarbenen Lichts aussetzen, das von einem tragbaren Infrarotblitzlicht ausgestrahlt wird.

Wenn die CCA richtig funktioniert, ziehen sich die Muskeln der hinteren Gliedmaßen als Reaktion auf das Infrarotlicht zusammen. Wiegen Sie die Tiere kurz vor Beginn des CCA-Verfahrens, um eine Ausgangsmessung aufzuzeichnen, die hilft, starken Stress oder nachteilige Auswirkungen durch Veränderung des Körpergewichts nach dem CCA-Verfahren zu identifizieren. Schalten Sie am Tag der CCA-Stimulation das CCA ein, indem Sie die Stimulatoreinheit einem einzigen Impuls von Infrarotlicht durch ein tragbares Infrarot-Stroboskoplicht aussetzen und drei oder sechs Stunden lang 10 Hertz CCA-Stimulation durchführen.

Überprüfen Sie die Stimulation und das Tier alle 30 bis 60 Minuten. Schalten Sie das CCA-Gerät nach Ablauf des gewünschten CCA-Zeitraums über Infrarotlicht aus. Ratten, die sieben Tage lang sechs Stunden pro Tag CCA erhielten, zeigten eine erhöhte mitochondriale Biogenese im stimulierten Muskel im Vergleich zu den nicht stimulierten kontralateralen Hintergliedmaßen.

Diese Zunahme der mitochondrialen Biogenese wird durch eine erhöhte Proteinexpression von PGC-1 alpha angezeigt. Die Untersuchung permeabilisierter Muskelfasern zur Messung der mitochondrialen Atmungskapazität zeigt, dass CCA zu einer Erhöhung der maximalen Atmungskapazität des Muskels im Vergleich zum Kontrollmuskel führte. Sowohl die subsarkolemmale als auch die intermyofibrilläre mitochondriale Population nahmen nach siebentägiger CCA im Vergleich zu unstimulierten Kontrollmuskeln zu.

Auch Anpassungen an das Autophagie- und lysosomale System können durch CCA herbeigeführt werden. Eine Zunahme der Proteinhäufigkeit des Transkriptionsfaktors EB, des Hauptregulators der lysosomalen Biogenese, wird nach CCA zu jedem Zeitpunkt beobachtet. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie allgemeine subkutane oder intraperitoneale Injektionen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Abschätzung des Autophagieflusses bei Colchicin-Behandlung.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das aktuelle Modell der chronischen kontraktilen Aktivität anwenden können, um phänotypische Muskelveränderungen nach Ausdauertraining zu untersuchen.