Name: Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Erfahren Sie die chronische Kontraktionsaktivität zur Untersuchung skelettaler Muskelanpassungen bei Ratten. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung von Mitochondrienbiogenese und Autophagie innerhalb von sieben Tagen.

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Wir sind dankbar für seine kompetente Lektüre des Manuskripts Liam Tyron. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC), D. A. Haube. D. A. Hood ist auch der Inhaber einer Canada Research Chair in Zellphysiologie.

Alle tierbezogenen Verfahren wurden überprüft und genehmigt von der York University Animal Care Committee. Bei der Ankunft im Tierhaus an der York University erhielten alle Ratten mindestens fünf Tage, bis an ihre Umgebung vor dem chirurgischen Eingriff mit Verpflegung Ad Libitumzu akklimatisieren. Obwohl dieses Protokoll auf andere Arten15,17,22zuvor durchgeführt wurde, das aktuelle Papier baut auf die Pionierarbeit von Pette und Kollegen23 und konzentriert sich speziell auf die Rattenmodell.
1. Vorbereitung des chronischen kontraktilen Leistungseinheit
<ol><li>Überprüfen Sie mit einem Voltmeter, das Potenzial der Münze Lithiumbatterien. Hinweis: Sollte das Potenzial eines jeden Akkus 3,0 ± 0,10 V sein.</li>
	<li>Legen Sie zwei oder drei Batterien in den Schlitz des Gerätes, so dass das Gesamtpotenzial 6-9 V ist. Hinweis: Es liegt im Ermessen der Forscher zu prüfen, wie viel Potenzial (6 oder 9 V), weiterhin während der gesamten Versuchsdurchführung. Je nach Design der Studie und der gewünschten Intensität des Reizes können entweder 2 oder 3 Batterien verwendet werden.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Gerät über das Puls-Kennzeichen funktionsfähig ist, indem man das Gerät 1 Impuls von einem tragbaren Infrarot-Strobe Licht emittiert.</li>
</ol>2. chirurgische Verfahren chronische kontraktilen Aktivität
Hinweis: Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor dem chirurgischen Eingriff. Während und unmittelbar nach der Operation bleibt die Körpertemperatur der Ratten durch ein Heizkissen. Es ist wünschenswert, den chirurgischen Eingriff auf eine chirurgische drapieren durchzuführen. Der Chirurg sollte sterile OP-Handschuhe sowie einen sauberen Kittel tragen. Bei Bedarf empfiehlt es sich, eine Einweg-Atemschutzmaske tragen.
<ol><li>Betäuben Sie Ratten unter 1-3 % Isofluran Inhalation mit Sauerstoff, der durch ein Gas-Vaporizer-System betrieben wird. Bestätigen Sie, dass Tier vollständig durch Überprüfung Megalosauridae Zeh kneifen und durch Beobachtung der Atemwege Umfang und Tempo sediert ist. Wenden Sie okuläre Schmiermittel auf Augen, Trockenheit zu vermeiden. Wenden Sie eine subkutane Injektion von Meloxicam (0,5 mg/mL) bei 2 mg/kg. Hinweis: Es wird auch empfohlen, eine Multi-modale Anwendung der Analgesie (z.B. Meloxicam plus Lidocain), keine Schmerzen während und nach der Operation zu minimieren.</li>
	<li>Rasieren Sie sanft ein Streifen um den Rumpf von der Rückseite des Halses, der linken Megalosauridae sowie etwa hinter der Vorderbeine und über dem vorderen Thorax. Wischen Sie rasierte Bereichen mit Jod und Äthyl-Alkohol zu desinfizieren.</li>
	<li>Mit dem Tier auf den Bauch legen, machen einen kleinen Schnitt (~0.5 cm) auf der Rückseite des Halses in der Mitte der rasierte Region (tastbare Bereich zwischen den Schulterblättern) mit einem Skalpell (Nr. 10 Blatt).</li>
	<li>Suchen Sie die Peronaeus.<ol>
<li>Tier auf der rechten Seite und eine ~ 2-3 cm-langen Schnitt in der Haut der linken Megalosauridae. Zielbereich der Schnitt um die Oberschenkel-Muskel-Gruppen, die denkmalgeschützte zwischen den Grübchen des Kniegelenks und der Rückseite in der Nähe des Ursprungs der Rute ist. Hinweis: Achten Sie darauf, den ersten Schnitt-Bereich verunreinigen, wenn die Position des Körpers verändern.</li>
		<li>Chirurgische Schere gebogen mit stumpfen Spitzen, sezieren der subkutanen Bereich weit ~3.5 - 4 cm, trennt die Haut vom darunter liegenden Muskeln um eine Tasche zwischen geöffneten Haut und der darunter liegenden Muskeln zu machen. Öffnen Sie die Haut vom darunter liegenden Gewebe rund um den gesamten Umfang des Schnittes (~1.5 cm2).</li>
		<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt (weniger als 0,5 cm) auf den Bizeps Femoris Muskel mit Chirurgische Scheren, um sicherzustellen, dass die Spitzen der Schere direkt nach unten durch den Muskel schneiden.</li>
		<li>Der Schnittbereich sanft zu öffnen, bis die internen Muskelgruppen und der Peronaeus sichtbar sind (die Tiefe des externen Muskelgewebe (z.B. Bizeps Femoris) ist um ~0.5 cm). Mit Pinzette, sanft Touch/Prise Nervus sichtbar und beobachten Sie die Reaktionen der Muskeln Zielgruppen (z. B. TA Muskel) und Zehen (sichtbare Dorsalflexion) zu bestätigen, dass die Peronaeus isoliert ist. Hinweis: Dieser Schritt sollte mit äußerster Vorsicht zu vermeiden, schneiden oder den Nerv Beschädigung erfolgen.</li>
		<li>Befestigen Sie das Fenster durch offen mit Metall Retraktoren ziehen, so dass die Größe des Fensters ~1.5 cm2 mit Nervus Peronaeus liegen in der Mitte des Fensters ist. Verwenden Sie kleine Metallhaken befestigt Gurte und/oder Gummibänder, die auf der Tischfläche (oder Chirurgie Board), nach unten befestigt sind (Abbildung 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Befestigen Sie den Draht zu beiden Seiten des Nervs.<ol>
<li>~ 50-60 cm von Polytetrafluorethylen (PTFE) vorbereiten-feinen Edelstahl-Draht beschichtet und in der Mitte falten. Hinweis: Es möglicherweise hilfreich, PTFA-beschichtetem Draht unter dem UV-Licht vor der Operation verfügbar zu machen.</li>
		<li>Haken Sie den gefalteten Teil des Drahtes in den Schlitz des eine 30 cm lange Edelstahl-Stab. Übergeben Sie die Rute, zusammen mit den Draht, subkutan aus der offenen Tasche der Megalosauridae in den Bereich der kleinen Schnitt an der Rückseite des Halses in einem L-förmigen Muster am Bein und entlang der Mittellinie des Rückens.</li>
		<li>Finden Sie die beiden Enden des Drahtes bei der Megalosauridae. Streifen Sie die Drähte, da alle Leitungen PTFE-isoliert sind. Streifen Sie mit einem Skalpell, sorgfältig die Enden des Drahtes von ~1.5 cm. Wenn die Drähte ausgefranst werden, schneiden Sie sie aus und wieder Streifen. Wickeln Sie die abisolierte Enden einer abgestumpften 21-G-Nadel (5 Mal), so dass eine Spule. Sobald die Spulen richtig gemacht werden, lassen Sie die Nadel von ihnen.</li>
		<li>Mit einer Größe 6-0 chirurgische Seide, sichern Sie jeweils der Spulen auf beiden Seiten der Peronaeus (Abbildung 2A).<ol>
<li>Machen Sie einen Knoten am Ende der Spule, und auf der linken Seite des Nervs Naht. Sicherstellen Sie, dass die Spule bei 1,5-2,5 mm vom Nerv.</li>
			<li>Um die Spule zu sichern, gelten Sie zwei oder drei zusätzliche Nähte entlang der Spule.</li>
			<li>Wiederholen Sie diese Schritte auf der rechten Seite des Nervs.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2-3 Tropfen antibiotische Lösung (Ampicillin in Kochsalzlösung; 132 mg/mL), und dann vorsichtig das Fenster (z.B. Bizeps Femoris Muskelgewebe) Größe 5-0 Seide mit Naht.</li>
	</ol></li>
	<li>Lose wind den verbleibenden Durchhang der Draht (über den Durchmesser des Zeigefingers) und in der subkutanen Tasche über die genähten Inzision des Bizeps Femoris Muskels (etwa oberhalb der Hüfte) einschieben.</li>
	<li>Geben Sie 2-3 Tropfen antibiotische Lösung wieder (Ampicillin in Kochsalzlösung; 132 mg/mL). Schließen Sie die geöffnete Haut durch Heften.</li>
	<li>Verbinden Sie die Drähte (aus dem Schnitt am Hals) mit der CCA-Stimulator.<ol>
<li>Verbinden Sie Pin Buchsen mit den Drähten.<ol>
<li>Schneiden Sie die Drahtschlinge, die aus der Schnitt an der Spitze des Halses zu 2 Kabelenden (Dies führt zu den Spulen zu beiden Seiten des Nervus Peronaeus vernäht) erstellen.</li>
			<li>Mit einem Skalpell, Streifen Sie die Enden der Drähte von ~0.5 cm. Cut off ausgefranste Drähte ab, wenn überhaupt.</li>
			<li>Langsam schieben Sie die abisolierten Teile der Drähte in das Loch der Pin Buchsen, und mit einem Lötkolben, Löten Sie der Drähte auf die Pin-Buchsen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Optional, überprüfen Sie die Verbindung von Drähten.<ol>
<li>Verbinden Sie die Stifte mit eine große Benchtop-Stimulator-Einheit über Krokodilklemmen.</li>
			<li>Ein Einzelimpuls von 9 V (0,1 ms, 10 Hz) um zu bestätigen, dass TA Muskel Verträge und den linken Dorsiflexes Fuß zu liefern.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Übergeben Sie die Pin verbunden-Drahtenden durch die sterile Gaze-Pad, die ~ 4 x 4 cm.</li>
		<li>Verbinden Sie die Stifte mit der CCA Stimulator Einheit.<ol>
<li>Übergeben Sie die Kabel durch das Loch im Boden des Feldes Stimulator. Hinweis: Dieses Feld ist eine hausgemachte Kammer für die CCA-Stimulator-Einheit und 3,5 cm × 3,5 cm × 2,5 cm13.</li>
			<li>Legen Sie die Pins in den Anschlussbuchsen am Gerät von CCA. Die CCA-Einheit legte sanft in die Kammer. Verwenden Sie eine stickige Tack, um das CCA-Gerät an der Unterseite der Kammer zu sichern.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Befestigen Sie mit eine sportliche Band oder poröse chirurgische Band der Kammers mit Klebeband um den rasierte Rumpf. Die Spitze der Kammer mit drei Schichten des Tapings schließen und beenden durch das Einwickeln von einer Bands um die Seiten der Stimulator Box, die Box (Abb. 2 b) zu sichern.</li>
	</ol></li>
	<li>Überprüfen, ob die CCA funktioniert indem man das Gerät in einen einzigen Impuls des Infrarot-Lichtes (Wellenlängenspektrum > 770 nm), die von einem tragbaren Infrarot-Stroboskop ausgegeben. Hinweis: Wenn die CCA ordnungsgemäß funktioniert, werden Forscher in der Lage sein zu sehen, dass die Megalosauridae Muskeln (z. B. TA) als Reaktion auf das Infrarotlicht öffentliche Auftraggeber sind.</li>
	<li>Beobachten Sie die Ratte zu und überwachen Sie die Temperatur, bis es vollständig Bewusstsein wiedererlangt hat. In einem Single-Insassen Käfig um Schaden von anderen Tieren zu verhindern Haus und lassen Sie keine Tunnel oder plastische Objekte in den Käfig für den Rest der Studie um das Risiko der Beschädigung des Geräts Stimulator oder Verletzung des Tieres. Versorgung mit einem Amoxicillin-inklusive Trinkflasche (0,5 mg/mL).</li>
	<li>Gelten Sie Dosis von 1 mg/kg von Meloxicam subkutan alle 24 h nach der Operation, die mindestens 72 h nach wie vor.</li>
</ol>3. chronische kontraktilen Aktivität
<ol><li>Können Sie nach der Operation mindestens 5-7 Tage für eine vollständige Wiederherstellung der Schnitt und Naht Gebiete in/um die Skelettmuskulatur. Hinweis: Während und nach CCA Verfahren gründlich überprüfen Sie jedes Tier Zustand durch die Beobachtung ihrer Verhaltensweisen (z. B. Essen, trinken und/oder verschieben). Darüber hinaus bestimmen Sie schweren Stress oder Nebenwirkungen durch eine Veränderung des Körpergewichts vor und nach dem CCA-Verfahren überprüfen.</li>
	<li>Am Tag der CCA-Stimulation, CCA durch die Aufdeckung der Stimulator-Einheit in einen einzigen Impuls von infrarotem Licht einschalten (Wellenlängenbereich > 770 nm) durch ein tragbares Infrarot-Stroboskop.</li>
	<li>3 oder 6 h 10 Hz CCA Stimulation anwenden. Hinweis: Der zeitliche Rahmen für die Stimulation obliegt der Forscher. Die Häufigkeit der Stimulation nie geändert wurde in diesen Experimenten und durch die Ausweitung der Stimulation von 3 bis 6 h/Tag, nach unserer Erfahrung nur sehr bescheidene Verbesserungen in der mitochondrialen Adaption eingehalten worden. Wenn möglich, überprüfen Sie die Stimulation und Tier alle 30-60 Minuten.</li>
	<li>Schalten Sie nach der gewünschten Zeit CCA das CCA-Gerät per Infrarot-Licht Exposition (gleicher Vorgang wie das Gerät einschalten).</li>
	<li>Wenn Sie mehrere Tage beantragen, wiederholen Sie den Schritt 3.2. bis 3.4.</li>
	<li>Zeitplan für die Erhebung der Gewebe zu bestimmen. Zum Beispiel sammeln Sie Gewebe 24 h nach Beginn der letzten Kampf des CCA (d.h.18 h nach der letzten CCA-Stimulation von 6 h), die unter der Narkose durchgeführt wird, wie bei den CCA chirurgischen Eingriff. Sofort nach dem Sammeln aller Gewebe, Tiere einschläfern von Herzen besteuert, während das Tier noch in Narkose ist.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die chronische kontraktilen (CCA) Aktivitätsmodell der Übung durch niederfrequente Muskel Stimulation in Vivo, ist ein hervorragendes Modell für das Studium Muskel phänotypische Anpassungen zur Ausübung von13,24,25 , 26. wie in früheren Studien20,27, CCA ist ein effektives Werkzeug, mit dem Forscher Steuern Training Volumen und...

Skelettmuskulatur kann anpassen und Ausbildung durch Veränderungen in der Bioenergetik und physikalische Struktur1ausüben. Eines der wichtigsten Veränderungen herbeigeführt durch Ausdauertraining ist mitochondriale Biogenese, welches durch eine Erhöhung der Expression des mitochondrialen Komponenten (z. B. Cytochrom C Oxidase [COX] Untereinheiten) ausgewertet werden kann, sowie der Ausdruck von die transcriptional Coactivator, PGC-1α-2. Eine wachsende Anzahl von Studien haben gezeigt, dass zahlreiche andere Faktoren, einschließlich der mitochondrialen Umsatz- und Mitophagy, auch wichtig für Muskel-Anpassungen sind. Jedoch die Mechanismen durch die akute oder chronische Übung regulieren diese Prozesse in der Skelettmuskulatur sind noch unklar.
Um die Wege abzugrenzen die Ausübung induzierten Muskel Anpassungen zu regulieren, haben verschiedene Übung Modelle in Nagetier Studien, einschließlich Laufband, Rad laufen und Schwimmen Übung gebräuchlich. Diese Protokolle haben jedoch einige Einschränkungen, dass ~ 4-12 Wochen nötig sind, um diesen phänotypischen Veränderungen3,4,5zu beobachten. Als alternative experimentelle Methode, niederfrequente Stimulation-induzierten chronischen kontraktilen Aktivität (CCA) hat effektiv verwendet, da es in einem wesentlich kürzeren Zeitraum zu Muskel Anpassungen führen kann (d. h. bis zu 7 Tagen) und seine Auswirkungen scheinen werden Sie vergleichbar oder sogar größer als andere Übung-Protokolle. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von hormonellen6, Temperatur7und neurologischen Auswirkungen8 Muskel-spezifische Reaktionen auf chronische Übung verstehen erschweren. Zum Beispiel Schilddrüsenhormone9,10 und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF)-111 wurden identifiziert, um Muskel Training-induzierte Anpassungen zu vermitteln, die auch andere Signalwege im Skelett regulieren kann Muskel. CCA-induzierte Effekte sind vor allem minimal systemische Faktoren, so dass Fokus auf die direkte Reaktion des skelettartigen Muskels auf kontraktilen Aktivität geregelt.
Die Außeneinheit für CCA wurde erstmals von Tyler und Wright12und wurde mit Modifikationen12entwickelt. Kurzum, das Gerät besteht aus drei Hauptteilen: einem Infrarotdetektor, die durch die Einwirkung von Infrarotlicht, Impulsgeber und einen Puls-Indikator (Abbildung 1) aktiviert oder deaktiviert werden kann. Die detaillierte Schaltungsdesign des Referats Stimulator wurde zuvor13beschrieben. Die detaillierte und spezifische Merkmale der CCA finden Sie in größerer Tiefe in einer Reihe von Review Artikel14,15,16,17. In Kürze soll die Stimulation Protokoll Peronaeus bei tiefen Frequenzen zu aktivieren (z. B. 10 Hz), und der innervierten Muskulatur (m. Tibialis anterior [TA] und Beinstrecker m.digitorum Longus [EDL] Muskel) sind gezwungen, Verträge für eine vorgegebenen Zeitspanne (z.B. 3-6 h). Im Laufe der Zeit verschiebt dies die genannten Muskeln zu einer mehr aerobe Phänotyp, nachgewiesen durch eine Zunahme der Kapillardichte18 und mitochondriale Inhalt19,20,21. Daher ist diese Methode ein bewährtes Modell, einige der großen Ausdauer Training Anpassungen im skelettartigen Muskel der Ratten zu imitieren.
Dieser Beitrag stellt ein detailliertes Verfahren der Elektrode Implantation Operation, CCA zu induzieren, so dass die Forscher dieses Modell in ihre Übung Studien anwenden können. CCA ist ein hervorragendes Modell für das Studium des zeitlichen Verlauf des Muskels Anpassungen, wodurch ein wirksames Instrument für die Untersuchung von molekularen und Signalisierung Veranstaltungen zu beiden frühen und späteren Zeitpunkten nach Beginn der Übung Training.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Charles River</td><td>Strain 400</td><td></td></tr><tr><td>Einheit für chronische kontraktile Aktivität</td><td>Hausgemachte</td> Schutzbox <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CCA-Einheit (3,5 x 3,5 x 2,5 cm)</td><td>Hausgemacht</td><td>n/a</td><td>Die Box sollte aus undurchsichtigem Material bestehen oder mit einem undurchsichtigen Klebeband bedeckt sein</td></tr><tr><td>Münz-Lithium-Ionen-Batterien (3V)</td><td>Panasonic</td><td>CR2016</td><td></td></tr><tr><td>Medwire</td><td>Leico Industrie</td><td>316SS7/44T</td><td></td></tr><tr><td>Lötstift (Sockel)</td><td>Digi-Key</td><td>ED6218-ND</td><td></td></tr><tr><td>Zonas poröses Klebeband</td><td>Johnson & Johnson</td><td>5104</td><td></td></tr><tr><td>Nahtseide (Größe 5)</td><td>Ethicon</td><td>640G</td><td></td></tr><tr><td>Nahtseide (Größe 6)</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene stumpfe Schere (11,5 cm Länge)</td><td>F.S.T.</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene stumpfe Schere (15 cm Länge)</td><td>F.S.T.</td><td>14111-15</td><td></td></tr><tr><td>Zarte hämostatische Pinzette (16 cm Länge)</td><td>Lawton</td><td>06-0230</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellfeder</td><td></td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlstab (30 cm; 7mm Durchmesser)</td><td>Hausgemacht</td><td>n/a</td><td>Der Stab sollte an einem Ende einen Schlitz von 5 mm haben, um den Draht zum Tunneln unter der Haut zu halten</td></tr><tr><td>Clip zum Anlegen einer Pinzette</td><td>KLS Martin</td><td>20-916-12</td><td></td></tr><tr><td>Klammern (Clips)</td><td>Bbraun</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>Metallhaken/Retraktor</td><td>Hausgemacht</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod (500 mL)</td><td>Rougier</td><td>#NPN00172944</td> Ampicillin-Natrium-Novopharm<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>#DIN00872644</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer</td><td>#DIN02240463</td><td></td></tr><tr><td>Digitalmultimeter (Voltmeter)</td><td>Soar Corporation</td><td>ME-501</td><td></td></tr><tr><td>LED-Digital-Stroboskop</td><td>Lutron Electronic Enterprise</td><td>DT-2269</td><td></td></tr></tbody></table>

anwendung der chronische stimulation kontraktilen aktivität induzierten ratte skelettmuskulatur phänotypische anpassungen zu studieren

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skelettmuskulatur ist ein anpassungsfähiges Gewebe wie seine biochemischen und physiologischen Eigenschaften stark als Reaktion auf chronische Übung verändert werden. Um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, die verschiedenen Muskel-Adaptionen herbeizuführen, haben eine Reihe von Ausübung Protokolle wie Laufband, Rad laufen und Schwimmen-Übung in tierexperimentellen Studien verwendet worden. Jedoch üben diese Modelle erfordern eine längere Zeit zu Muskel-Anpassungen, die humorale oder neurologische Faktoren, wodurch ihre Anwendungen bei der Untersuchung der Muskel-spezifische Kontraktion-induzierte Anpassungen auch geregelt werden kann. Indirekte niederfrequente Stimulation (10 Hz) induzieren chronische kontraktilen Aktivität (CCA) hat als ein alternatives Modell für Übung Training eingesetzt, da es erfolgreich zu Muskel mitochondriale Anpassungen innerhalb von 7 Tagen, unabhängig von systemische Faktoren führen kann. Dieses Papier beschreibt die Operationstechniken der Skelettmuskulatur von Ratten, die Behandlung von CCA zuweisen für weit verbreitete Anwendung in Zukunft Studien erforderlich.

Wir haben gezeigt, dass chronische kontraktilen Aktivität (CCA) ein wirksames Instrument zur günstigen mitochondriale Anpassungen im skelettartigen Muskel induzieren ist. Ratten, die 7 Tage der CCA (6 h pro Tag) unterzogen anzeigen verbesserte mitochondriale Biogenese in der stimulierten Muskulatur im Vergleich zu den Megalosauridae unstimulierte kontralateralen (Kontrolle). Dieser Anstieg der mitochondrialen Biogenese wird durch erhöhte Protein-Expression von PGC-1α (<strong class="xfig"...

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz des Aktivitätsmodells chronische kontraktilen der Übung, skelettartiger Muskel Stimulation induzierte Anpassungen in der Ratte Megalosauridae zu beobachten.

Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Das Modell der chronischen kontraktilen Aktivität des Trainings ist nützlich, um die Anpassung der Skelettmuskulatur an Trainingsreize in vivo zu untersuchen. Insbesondere erhebt dieses Modell die phänotypischen Anpassungen eines sechswöchigen Trainingsprotokolls innerhalb von sieben Tagen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Muskelphysiologie wie mitochondriale Biogenese, Autophagie und viele andere trainingsassoziierte zelluläre Anpassungen zu beantworten.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Beobachtung muskelspezifischer Anpassungen über einen kurzen Zeitraum von sieben Tagen ermöglicht, im Vergleich zu anderen Trainingsprotokollen, die mehrere Monate benötigen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des Muskelschwundalters, da sich gezeigt hat, dass chronische Muskelstimulation eine Wirkung auf die Verbesserung der altersbedingten Muskelschwäche hat. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, den Nervus peroneus communis zu markieren und elektrische Spulen an beiden Enden anzubringen, da dies Übung und Präzision erfordert.Beginnen Sie mit der Anästhesie der Ratte unter einer Inhalation von ein bis 3 % Isofluran mit Sauerstoff und bestätigen Sie die vollständige Sedierung, indem Sie die Reaktion auf ein Einklemmen der Zehen der hinteren Gliedmaßen überprüfen und die Atemtiefe und -frequenz beobachten. Tragen Sie Augenschmiermittel auf die Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden, und legen Sie die Ratte auf ein Heizkissen mit niedriger bis mittlerer Einstellung. Rasieren Sie vorsichtig die linke hintere Extremität sowie einen Streifen um den Oberkörper vom Nacken bis hinter die Vordergliedmaßen und über den vorderen Thorax.Wischen Sie die rasierten Stellen zur Desinfektion vorsichtig mit Jod und Ethylalkohol ab. Während das Tier auf dem Bauch liegt, verwenden Sie ein steriles Skalpell mit einer Klinge mit der Nummer 10, um einen kleinen Schnitt von etwa 0,5 Zentimetern am Nacken in der Mitte der rasierten Region zu machen. Rollen Sie dann das Tier auf die rechte Seite und machen Sie einen zwei bis drei Zentimeter langen Schnitt in die Haut der linken Hintergliedmaße zwischen dem Grübchen des Kniegelenks und nahe dem Ursprung des Schwanzes.Mit einer stumpfen, gebogenen chirurgischen Schere wird der subkutane Bereich auf etwa 3,5 bis vier Zentimeter zerlegt, wobei die Haut vom darunter liegenden Muskel getrennt wird, um eine Tasche zwischen der offenen Haut und dem darunter liegenden Muskel zu bilden. Verwenden Sie als Nächstes eine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt von weniger als 0,5 Zentimetern am Bizeps femoris zu machen, um sicherzustellen, dass die Spitzen der Schere direkt durch den Muskel schneiden. Öffnen Sie dann vorsichtig den Schnittbereich, bis die inneren Muskelgruppen und der Nervus peroneus communis sichtbar sind.Seien Sie äußerst vorsichtig, um zu vermeiden, dass der Nerv durchtrennt oder beschädigt wird. Bereiten Sie als nächstes 50 bis 60 Zentimeter PTFE-beschichteten feinen Edelstahldraht vor und falten Sie ihn in der Mitte. Haken Sie den gefalteten Teil des Drahtes in den Schlitz eines 30 Zentimeter langen Edelstahlstabs ein.Führen Sie den Draht mit dem Stab durch die offene Tasche der hinteren Gliedmaße das Bein hinauf und entlang der Mitte des Rückens in einem L-förmigen Muster, um den kleinen Schnittbereich im Nacken zu erreichen. Befestigen Sie das Fenster, indem Sie es mit Metallhaken aufziehen, bis die Größe des Fensters etwa 1,5 Quadratzentimeter beträgt und der Nervus peroneus in der Mitte des Fensters liegt. Ziehen Sie mit einem Skalpell die Enden des Drahtes vorsichtig um 1,5 Zentimeter ab.Wickeln Sie die abisolierten Drahtenden fünfmal um eine abgestumpfte 21-Gauge-Nadel, um eine Spule zu bilden. Sobald die Spulen richtig hergestellt sind, lösen Sie die Nadel von ihnen. Machen Sie einen Knoten ganz am Ende der Spirale und nähen Sie ihn auf der linken Seite des Nervs, wobei Sie darauf achten, dass die Spirale 1,5 bis 2,5 Millimeter vom Nerv entfernt ist.Um die Spirale zu sichern, legen Sie zwei oder drei zusätzliche Nähte entlang der Spirale an. Dieser Schritt erfordert viel Übung und Geduld, um eine Schädigung des Nervs und des darunter liegenden Muskels zu vermeiden und einen möglichst gleichmäßigen Stimulationszustand bei allen Tieren zu erreichen. Es ist am besten, einen erfahrenen Forscher zu haben, der alle chirurgischen Eingriffe während einer Studie durchführt.Tragen Sie zwei oder drei Tropfen Antibiotikalösung auf und nähen Sie das Fenster vorsichtig mit Seide der Größe 5-0. Wickeln Sie den restlichen lockeren Draht locker auf und schieben Sie ihn in die Unterhauttasche oberhalb des genähten Schnitts des Musculus biceps femoris oberhalb der Hüfte. Tragen Sie zwei bis drei Tropfen Antibiotikalösung auf und verschließen Sie die offene Haut durch Heften.Bringen Sie als Nächstes das Tier in die Brustbeinposition und schneiden Sie die Drahtschlaufe ab, die aus dem Schnitt oben am Hals kommt, um zwei Drahtenden zu bilden. Streifen Sie mit einem Skalpell die Enden der Drähte um 0,5 Zentimeter ab. Schneiden Sie alle ausgefransten Drähte ab.Schieben Sie die abisolierten Teile der Drähte langsam in das Loch der Stiftsockel und löten Sie die Drähte mit einem Lötkolben auf die Stiftsockel. Führen Sie die mit dem Stift verbundenen Drahtenden durch ein 4,4 Zentimeter steriles Mullkissen. Führen Sie dann die Drähte durch das Loch im Boden der Stimulatorbox.Stecken Sie die Stifte in die Anschlussbuchsen an der CCA-Einheit. Setzen Sie das CCA-Gerät vorsichtig mit einem klebrigen Reißzweck in die Kammer ein, um das CCA-Gerät am Boden der Kammer zu befestigen. Verwenden Sie Sporttape oder poröses chirurgisches Klebeband, um die Kammer um den rasierten Oberkörper zu fixieren.Verschließen Sie die Oberseite der Kammer mit drei Lagen Klebeband. Wickeln Sie zum Schluss Klebeband um die Seiten der Stimulatorbox, um die Box zu sichern. Überprüfen Sie, ob der CCA funktioniert, indem Sie das Gerät einem einzigen Impuls infrarotfarbenen Lichts aussetzen, das von einem tragbaren Infrarotblitzlicht ausgestrahlt wird.Wenn die CCA richtig funktioniert, ziehen sich die Muskeln der hinteren Gliedmaßen als Reaktion auf das Infrarotlicht zusammen. Wiegen Sie die Tiere kurz vor Beginn des CCA-Verfahrens, um eine Ausgangsmessung aufzuzeichnen, die hilft, starken Stress oder nachteilige Auswirkungen durch Veränderung des Körpergewichts nach dem CCA-Verfahren zu identifizieren. Schalten Sie am Tag der CCA-Stimulation das CCA ein, indem Sie die Stimulatoreinheit einem einzigen Impuls von Infrarotlicht durch ein tragbares Infrarot-Stroboskoplicht aussetzen und drei oder sechs Stunden lang 10 Hertz CCA-Stimulation durchführen.Überprüfen Sie die Stimulation und das Tier alle 30 bis 60 Minuten. Schalten Sie das CCA-Gerät nach Ablauf des gewünschten CCA-Zeitraums über Infrarotlicht aus. Ratten, die sieben Tage lang sechs Stunden pro Tag CCA erhielten, zeigten eine erhöhte mitochondriale Biogenese im stimulierten Muskel im Vergleich zu den nicht stimulierten kontralateralen Hintergliedmaßen.Diese Zunahme der mitochondrialen Biogenese wird durch eine erhöhte Proteinexpression von PGC-1 alpha angezeigt. Die Untersuchung permeabilisierter Muskelfasern zur Messung der mitochondrialen Atmungskapazität zeigt, dass CCA zu einer Erhöhung der maximalen Atmungskapazität des Muskels im Vergleich zum Kontrollmuskel führte. Sowohl die subsarkolemmale als auch die intermyofibrilläre mitochondriale Population nahmen nach siebentägiger CCA im Vergleich zu unstimulierten Kontrollmuskeln zu.Auch Anpassungen an das Autophagie- und lysosomale System können durch CCA herbeigeführt werden. Eine Zunahme der Proteinhäufigkeit des Transkriptionsfaktors EB, des Hauptregulators der lysosomalen Biogenese, wird nach CCA zu jedem Zeitpunkt beobachtet. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie allgemeine subkutane oder intraperitoneale Injektionen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Abschätzung des Autophagieflusses bei Colchicin-Behandlung.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das aktuelle Modell der chronischen kontraktilen Aktivität anwenden können, um phänotypische Muskelveränderungen nach Ausdauertraining zu untersuchen.

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Entwicklungsbiologie

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Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

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