Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, humane Zellträgergerüste in Mäuse zu implantieren, um humanisierte Knochenmarknischen zu schaffen und dann das Verhalten der menschlichen Zellen innerhalb der Implantate live abzubilden. Diese Methode wird dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der menschlichen Blutbildung zu beantworten, da sie es ermöglicht, verschiedene Komponenten des Knochenmarks mit einer Einzelzellauflösung zu reproduzieren und live abzubilden. Die Vielseitigkeit dieses Systems ist einer seiner Hauptvorteile, da es die Implantation verschiedener Nischenkomponenten nacheinander oder in Kombination ermöglicht.

Diese Methodik könnte möglicherweise auf andere Forschungsbereiche angewendet werden, z. B. auf Tumormetastasierungs- oder Wirkstoffscreening-Studien. Beginnen Sie mit der geeigneten sterilen Technik damit, einen sterilisierten Gelatineschwamm in 24 ähnlich große Stücke zu schneiden. Rekonstituieren Sie die Gelatinegerüste durch Eintauchen in Ethanol und dann in PBS.

Tupfen Sie dann jedes Gerüst vorsichtig auf ein steriles Tuch, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und übertragen Sie die Gerüste in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz. Injizieren Sie mit einer Insulinspritze vorsichtig eins mal 10 bis fünfte bis einmal 10 bis sechste Stromazellen in 50 Mikrolitern Kulturmedium in jedes Gerüst und legen Sie die Platte in einen Zellkulturinkubator. Wenn Sie die Zellen in das Gerüst injizieren, stellen Sie sicher, dass das Gerüst nicht ausläuft.

Füllen Sie nach einer Stunde jede Vertiefung mit drei Millilitern frischem Zellkulturmedium und stellen Sie die Gerüste wieder in den Inkubator. Nach 24 Stunden injizieren Sie einmal 10 bis 10 der fünften hämatopoetischen Zellen in die Gerüste, gefolgt von einer Inkubation und weiterer Medienzugabe und einer 24-stündigen Inkubation, wie gerade gezeigt. Für die Erzeugung von rekombinantem menschlichem knochenmorphogenetischem Protein werden zwei Trägergerüste gebildet, die rekonstituierten Gerüste werden in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit U-Boden gelegt und fünf Mikroliter rekombinantes menschliches morphogenetisches Knochenprotein zwei zu jedem Gerüst hinzugefügt.

Decken Sie dann die Gerüste mit 20 Mikrolitern Thrombin und 20 Mikrolitern Fibrinogen ab. Für die chirurgische Implantation der biotechnologisch hergestellten Gerüste rasieren Sie zunächst den Operationsbereich auf dem Rücken der Versuchsmaus und reinigen Sie die freiliegende Hautoberfläche mit einem in verdünntes Chlorhexidin getauchten Wattestäbchen dreimal in jede Richtung. Verwenden Sie anschließend eine sterile Pinzette und ein Skalpell, um einen 0,5 bis 0,7 Zentimeter großen Schnitt von vorne nach hinten in die Haut zu setzen, und führen Sie die Pinzette unter das Unterhautgewebe ein, um eine Tasche zu machen.

Führen Sie das Gerüst tief in die Tasche ein und verschließen Sie den Schnitt mit chirurgischem Kleber. Lassen Sie die implantierten Gerüste acht bis 24 Wochen vor dem Explantat entwickeln. Nach intravenöser Verabreichung von fluoreszierenden Substanzen und Einschläferung der Tiere wird die Haut wie gerade gezeigt sterilisiert und ein Längsschnitt auf dem Rücken des Tieres in der Nähe der ursprünglichen Implantationsstelle vorgenommen.

Trennen Sie die Haut vorsichtig von der Unterhauttasche, in der das Gerüst implantiert wurde, greifen Sie dann vorsichtig mit einer Pinzette nach dem Gerüst und schneiden Sie vorsichtig die verbleibende Membran und das Gewebe um das Gerüst herum, um die Struktur wiederherzustellen. Befestigen Sie das Gerüst mit schnellwirkendem Kleber an einer 35 x 10 Milliliter großen Petrischale. Für knochenmorphogenetische Proteine verwenden Sie zwei Gerüste, bevor Sie die Platte mit PBS füllen, verwenden Sie einen chirurgischen Mikrobohrer unter einem mikrochirurgischen Mikroskop, um die Knochenoberfläche zu verdünnen, was die Visualisierung der Fluorophore und die hochauflösende Aufnahme der Bilder ermöglicht.

Seien Sie beim Bohren besonders vorsichtig, da die Dicke des Knochens in der Regel zwischen den Gerüsten variiert und es wichtig ist, die Oberfläche nicht zu beschädigen. Füllen Sie die Schüssel mit PBS bei Raumtemperatur. Für die 2-Photonen-Mikroskopie der biotechnologisch hergestellten Gerüste stellen Sie das Gerüst auf den konfokalen Mikroskoptisch und wählen Sie die 20-fache 1,0-NA-Wasserimmersionslinse.

Wählen Sie dann im Aufnahmemodus der Imaging-Software das Feld "Manuelle Werkzeuge anzeigen" aus. Schalten Sie im Lasermenü den 2-Photonen-Laser ein und lassen Sie den Laser erwärmen und stabilisieren. Wenn der Laser bereit ist, aktivieren Sie im Imaging-Setup-Menü den Kanalmodus und wechseln Sie bei jedem Frame die Spur.

Wählen Sie im Menü Strahlengang die Option nicht degescannt und Fernlichtteiler MBS 760 plus. Aktivieren Sie die vier nicht degescannten Detektoren und stellen Sie die Konfiguration wie im Schaltplan dargestellt ein. Stellen Sie im Menü "Kanäle" die Wellenlänge des Lasers auf 890 Nanometer und die Leistung auf 50 % ein. Stellen Sie den Gain-Master auf 500 bis 600, den digitalen Offset auf Null und die digitale Verstärkung auf 15 für jeden Kanal ein.

Stellen Sie im Erfassungsmodus die entsprechenden Parameter ein, um hochauflösende Bilder zu erhalten, ohne das Gewebe zu beschädigen und die Fluorophore zu bleichen. Stellen Sie dann den Zoom für den ersten Scan des Bildes auf eins. Wenn alle Parameter eingestellt sind, senken Sie die Linse ab, bis sie die Kochsalzlösung berührt, und stellen Sie den Linsenfokus manuell mit einer Lampe als Lichtquelle ein.

Aktivieren Sie nun das Z-Stack-Menü und wählen Sie die vorletzte Funktion aus. Stellen Sie das gewünschte Intervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Slices ein und wählen Sie Live, um einen Live-Scan des Samples abzugeben, und passen Sie die digitale Verstärkung und den digitalen Offset nach Bedarf an, um eine optimale Belichtung zu erzielen. Um mehrere Kanäle gleichzeitig zu visualisieren, wählen Sie die Split-Funktion.

Scannen Sie im Bühnenmenü im Live-Modus das Bild und markieren Sie die gewünschten Bereiche, z. B. die Position von Knochenkavitäten. Wenn der Sample-Scan abgeschlossen ist, wechseln Sie zum ersten Bereich of Interest und verwenden Sie die Funktionen Set First und Set Last im Live-Modus, um den oberen und unteren Rand des 3D-Z-Stacks um den Interessenbereich herum festzulegen. Legen Sie dann den Mittelpunkt auf C fest und klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten, um die Z-Stapel-Bildaufnahme des interessierenden Bereichs zu starten.

Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, speichern Sie die Bilder im angegebenen Ordner und scannen Sie den nächsten Interessenbereich. In diesen repräsentativen Bildern ist die grobe Morphologie verschiedener Gerüste zu sehen, die acht Wochen nach der Implantation von immundefizienten NSG-Mäusen gewonnen wurden. Die gemeinsame Aussaat mit menschlichen Endothelzellen erhöht die Vaskularisierung des Gerüsts, während die Zugabe des rekombinanten menschlichen morphogenetischen Proteins zwei die Knochenbildung induziert.

Diese Gerüste, die durch Live-2-Photonen-Mikroskopie abgebildet wurden, zeigen das Vorhandensein von Blutgefäßen in den Gerüsten und die langfristige Transplantation der menschlichen hämatopoetischen Zellen in das Gerüstparenchym. Gerüste, die mit humanen endothelialen und mesenchymalen Stromazellen besiedelt sind, verdeutlichen die Beteiligung der menschlichen Endothelzellen an der Bildung von Gefäßen innerhalb des Gerüsts, was zu einem murin-humanen chymeren Gefäßsystem führt. Die Bildung von Knochengewebe kann durch 2-Photonenmikroskopie sichtbar gemacht werden, ebenso wie die Bildung von Hohlräumen in humanisierten Gefäßen im endostalen Gewebe, das dem endostalen Gewebe des Knochenmarks stark ähnelt.

Des Weiteren ähnelt die Morphologie des Gewebes innerhalb des Gerüsts in rekombinanten menschlichen knochenmorphogenetischen Proteinen dem reifen Knochenmark mit Fettgewebe, was darauf hindeutet, dass die menschlichen mesenchymalen Stromazellen auch zur Fettgewebsbildung beitragen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für alle Bioingenieure und die wichtigsten murinen Gerüste haben. Denke immer daran, eine asketische Umgebung zu pflegen und beim Umgang mit Gerüsten besonders vorsichtig zu sein.

Beachten Sie die Einschränkungen, die mit dieser Methode verbunden sind, wie z. B. Mensch-Maus-Chimären des Gewebes. Denken Sie daran, dass nach der Bildgebung Proben für weitere Studien verwendet werden können, da die Gerüste verdaut werden können und daher lebende Zellen aus ihnen entnommen werden können.