Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Verteilung von DNA-Reparaturproteinen um DNA-Doppelstrangbrüche herum auf der Nanoskala abzubilden. Um die Ultrastruktur von beschädigtem Chromatin während der Reparatur mithilfe der elektronenspektroskopischen Bildgebung zu untersuchen, werden DNA-Expressionskonstrukte erzeugt, die für Fusionsproteine von DNA-Schadensreaktionsproteinen mit einem fluoreszierenden Protein und dem Mini-SOG-Tag kodieren.

Im zweiten Schritt werden Konstrukte mittels Transfektion in Zellen eingeführt, anschließend werden die Zellen entweder durch Laser- oder Gammabestrahlung geschädigt. Danach durchlaufen die bestrahlten und fixierten Zellen die Vorbereitungsschritte für die Elektronenmikroskopie, um die Verteilung des mit mini-SOG markierten Reparaturproteins im Elektronenmikroskop sichtbar zu machen. Die resultierende elektronenspektroskopische Bildgebung liefert detaillierte Aufnahmen, die eine Analyse der Chromatin-Ultrastruktur sowie der Beziehung spezifischer Proteine zu DNA-Reparaturfoci ermöglichen.

Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber anderen bestehenden Technologien wie der ImmunoGold-Markierung besteht darin, dass sie nicht von der Verfügbarkeit von Antikörpern abhängt und die Strukturen von Interesse sehr dicht markiert. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden in der Regel Schwierigkeiten haben, da die Photooxidation sehr empfindlich gegenüber pH-Wert, Lichtintensität und Sauerstoffsättigung ist. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte der Photooxidation, Sauerstoffsättigung und Beleuchtung auf sehr geringe Änderungen reagieren, weshalb es wichtig ist, die Durchführung der Methode anschaulich darzustellen, um sie reproduzieren zu können.

Dr. Hilmar Fadden, ein Postdoktorand in meinem Labor, wird die Methode für Sie demonstrieren: Kultur humaner Osteosarkomzellen, die stabil die mini-SOG- und M-Cherry-markierten Reparaturproteine exprimieren, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Nach dem Aufteilen der Zellen aus einer 10 cm-Dish, kultivieren Sie die Zellen bis zu einer Konfluenz von 80 %.

Als Nächstes bringen Sie die Zellen unter ein Fluoreszenzmikroskop und umreißen mit einem sterilen Diamantschreiber einen kleinen Bereich von etwa einem Quadratmillimeter, der Zellen enthält, die die ektopischen Proteine exprimieren. Sobald markiert, sensibilisieren Sie die Zellen, indem Sie Herx zur Lösung hinzufügen, sodass die Endkonzentration 0,5 Mikrogramm pro Milliliter beträgt, und stellen Sie sie dann 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Anschließend bestrahlen Sie die Zellen mit einem 405-Nanometer-Festkörperlaser eines konfokalen Mikroskops, um DNA-Schäden zu induzieren. Nach der Induktion von DNA-Schäden fixieren Sie die Zellen im Dunkeln mit einem Milliliter 4 % Paraformaldehyd in 0,1-molarer Natriumcitatpuffer bei Raumtemperatur nach 30 Minuten.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit vier Milliliter 0,1-molarer Natrium-Cate-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,4. Behandeln Sie die fixierten Zellen anschließend 30 Minuten lang mit zwei Milliliter einer Lösung, die 50 Millimolar Glycin, 5 Millimolar Amino-triazol und 10 Millimolar Kaliumcyanid bei einem pH-Wert von 7,4 enthält. Ersetzen Sie den Puffer durch zwei Milliliter Photooxidationspuffer bei einem pH-Wert von 7,4, der gemäß der begleitenden textlichen Anleitung hergestellt wurde.

Anschließend inkubieren Sie die Probe im Dunkeln auf Eis, während Sauerstoff in die Lösung eingeleitet wird, um sie sauerstoffgesättigt zu halten. Danach montieren Sie die Schale mit den fixierten Zellen vorsichtig auf ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 40x-Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist, und bewegen sie in den zuvor markierten Bereich von Interesse. Erregen Sie den mini-SOG-Tag mit blauem Licht, indem Sie Filterwürfel für grünes Fluoreszenzprotein verwenden.

Setzen Sie die Beleuchtung fort, auch nachdem die grüne Mini-SOG-Fluoreszenz vollständig verschwunden ist, und zwar bis das braune Photooxidationsprodukt des polymerisierten Diaaminobenzidins im Durchlichtkanal sichtbar wird. Danach fixieren Sie die Zellen mit einem Milliliter 2 %igem Glutaraldehyd in 0,1 molarer Natriumcitatpufferlösung bei pH 7,4 für 30 Minuten nach.

Als Nächstes fixieren Sie die zellulären Membranen mit 0,1 bis 0,5 % Osmiumtetroxid in 0,1 molarer Natrium-Cate-Pufferlösung für 20 Minuten bei pH 7,4. Nach der Fixierung dehydrieren Sie die Zellen durch eine Abfolge von Ethanolwäschen. Anschließend inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang in einem Gemisch aus 100 % Ethanol und Acrylharz im Verhältnis 1:1 auf einem Schüttler.

Als Nächstes entfernen Sie die Mischung und geben 100 % Acrylharz zu den Proben hinzu, das weitere vier Stunden einwirken soll. Um das Harz zu polymerisieren, schneiden Sie mit einer Rasierklinge den Deckel eines beschrifteten 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens ab und bestreichen den Rand mit Acrylharz-Beschleuniger. Füllen Sie das Röhrchen vorsichtig zu etwa zwei Dritteln mit LR-White-Harz unter Verwendung eines Pasteur-Pipettenpads.

Stellen Sie sicher, dass das Harz nicht mit dem Beschleuniger am Rand in Kontakt kommt. Entfernen Sie das Harz, das in die Zellen in der Petrischale eingedrungen ist, und stellen Sie die Schale verkehrt herum auf ein aufrecht stehendes Mikrozentrifugenröhrchen, sodass die Breite des Röhrchens das glasbedeckte Beobachtungsfenster der Schalenwaage nahezu vollständig ausfüllt. Ein bis zwei Minuten warten, damit der Beschleuniger das Röhrchen und die Deckglasabdeckung versiegeln kann.

Danach das Röhrchen umdrehen, sodass das Harz im Röhrchen die Zellen bedeckt. Die Schale mit dem Röhrchen in einen Ofen bei 60 Grad Celsius stellen und 12 Stunden aushärten lassen. Sobald der Block ausgehärtet ist, die Schale mit dem angebrachten, harzgefüllten Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Ofen nehmen und das Mikrozentrifugenröhrchen von der Schale trennen.

Entsorgen Sie die Glasboden-Schale und schneiden Sie das Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig mit einer Rasierklinge auf, um den Block freizugeben. Schneiden Sie den Block mit einer Rasierklinge so zurecht, dass nur noch der quadratmillimetergroße Bereich erhalten bleibt, der die zuvor mit dem Diamant- oder Wolframstift markierte Stelle enthält. Bringen Sie anschließend den Block in einem Ultramikrotom an und trimmen Sie ihn mit einem Trimmesser, bis die Zellen erreicht sind.

Wechseln Sie dann zu einem Diamantschneider und schneiden Sie ultradünne Schnitte von etwa 50 Nanometern durch die Zellen. Nehmen Sie die Schnitte auf Hochdurchlassraster mit 300 Maschen auf. Stellen Sie anschließend die Raster in eine Kohlenstoffbedampfungsanlage und beschichten Sie die Schnitte mit etwa 0,2 bis 0,4 Nanometern Kohlenstoff, um sie unter dem Elektronenstrahl des Transmissionselektronenmikroskops zu stabilisieren.

Laden Sie die Gitter in ein Transmissionselektronenmikroskop, das mit einem Energiefilter ausgestattet ist. Untersuchen Sie die Zellen in den Schnitten im Normal-Transmission-Modus mit niedriger Vergrößerung und vergleichen Sie sie mit zuvor aufgenommenen Fluoreszenzbildern. Sobald ein Kern mit einer DNA-Schadensspur oder DNA-Reparaturfoci gefunden ist, schalten Sie in den energiefilternden Modus um und nehmen Sie die Probe mit einer Dickenkarte auf.

Als Nächstes nehmen Sie die Phosphor-Kartierung nach der Kante bei einem Elektronenenergieverlust von 175 mit einer Schlitzbreite von 20 Elektronenvolt auf. Nehmen Sie außerdem Vorkantenbilder bei einem Energieverlust von 120 Elektronenvolt auf, ebenfalls mit einer Schlitzbreite von 20 Elektronenvolt, für die Stickstoff-Kartierung. Aufnahmen nach der Kante bei 447 Elektronenvolt mit einer Schlitzbreite von 35 Elektronenvolt und Vorkantenbilder bei 358 Elektronenvolt.

Auch mit einer Spaltbreite von 35 Elektronenvolt. Öffnen Sie die Elementverhältnis-Karten in einer Bildverarbeitungssoftware wie dieser. Kopieren Sie die Stickstoffkarte in den Rotkanal und die Phosphorkarte in den Grünkanal eines RGB-Bildes.

Danach überlagern und die Karten ausrichten. Exportieren Sie das zusammengesetzte Bild als Datei im Tagged Image File Format und öffnen Sie das Bild anschließend in einer Bildverarbeitungssoftware, die Ebenen verwenden kann. Passen Sie danach den Dynamikbereich jedes Kanals an, indem Sie die minimalen und maximalen Werte im Bild auf einen 8-Bit-Datensatz umskalieren.

Subtrahieren Sie anschließend den Phosphorgehalt aus der Stickstoffkarte innerhalb des Schichtenfensters. Konvertieren Sie das Bild in eine indizierte Farbe und erstellen Sie eine gelbe Farbtabelle im CMYK-Farbraum für die Karte, die die Verteilung der Nukleinsäuren zeigt, sowie eine cyanfarbene Farbtabelle, um die Nicht-Chromatin-Proteinkarte darzustellen. Erstellen Sie dann ein neues Bild und importieren Sie die Karten, die die Verteilungen von Phosphor und Nicht-Chromatin-Proteinen zeigen, als verschiedene Ebenen.

Verwenden Sie den Transparenzmodus der Anzeige, um beide Schichten übereinander liegend zu sehen. Gezeigt sind hier Elektronenspektroskopische-Verhältnis-Karten aus dem Inneren eines Zellkerns, die die Lokalisation von Phosphor und Stickstoff anzeigen, wenn die beiden Verhältnis-Karten im RGB-Farbraum übereinander gelegt werden. Ein Bild wie das hier gezeigte wird bei dieser Abbildung erhalten.

Gelbe Strukturen repräsentieren nukleäre Proteine, die das Vorhandensein von Phosphor und Stickstoff widerspiegeln. Hier wird die elektronenspektroskopische Bildgebung verwendet, um die Veränderungen in der Fokusstruktur nach Gammabestrahlung in U2-OS-Zellen sichtbar zu machen. In der oberen Zeile sind stabil exprimierte M-Cherry-markierte Reparaturproteine abgebildet, die Zellen, die nicht bestrahlt wurden.

Die zweite Reihe zeigt Zellen, die drei Stunden nach der Bestrahlung fixiert wurden. Die dritte Reihe zeigt Zellen, die sechs Stunden nach der Bestrahlung fixiert wurden. Die elektronenspektroskopische Abbildung zeigt, dass sich die Struktur der Foci im Zeitverlauf umzuordnen scheint, da die relative Menge des 53BP1-Proteins im Fokus – angezeigt durch die Zunahme des Stickstoffsignals – zu steigen scheint, während das Chromatin, angezeigt durch das Phosphorsignal, eine periphere Position einnimmt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bestrahlte Zellen, die Mini-So-Reparaturproteine exprimieren, präpariert, um die Ultrastruktur von Chromatin in DA-Reparaturfoci mittels elektronenspektroskopischer Bildgebung zu analysieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumcacylatpuffer, Kaliumcyanid und Osmiumoxid äußerst gefährlich sein kann, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einem Abzug und das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten, während Sie dieses Verfahren durchführen.