Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Verteilung von DNA-Reparaturproteinen um doppelsträngige DNA-Brüche auf der Nanoskala zu kartieren. Um die Ultrastruktur des beschädigten Chromatins zu untersuchen, das mit elektronenspektroskopischer Bildgebung repariert wird. Dies wird durch die Erzeugung von DNA-Expressionskonstrukten erreicht, die für Fusionsproteine von DNA-Schadensreaktionsproteinen unter Verwendung eines fluoreszierenden Proteins und des Mini-SOG-Tags kodieren.

In einem zweiten Schritt werden Konstrukte durch Transfektion in die Zellen eingebracht, und dann werden die Zellen entweder durch Laser- oder Gammabestrahlung geschädigt. Anschließend werden die bestrahlten und fixierten Zellen elektronenmikroskopisch präpariert, um die Verteilung des mini-SOG-markierten Reparaturproteins im Elektronenmikroskop sichtbar zu machen. Die daraus resultierende elektronenspektroskopische Bildgebung liefert detaillierte Bilder, die die Analyse der Chromatin-Ultrastruktur und der Beziehung spezifischer Proteine zu DNA-Reparaturherden ermöglichen.