Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, etwa wie sich die DNA-Struktur während des Zellzyklus von Bakterien verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es möglich ist, die Ultrastruktur ganzer Bakterienzellen in der Nähe des lebenden Zustands zu geeigneten Zeitpunkten ohne zusätzliche Behandlungen sichtbar zu machen. Chihong Song, ein Postdoc aus meinem Labor, und Mako Hayashi, ein Doktorand aus Dr. Kanekos Labor, werden das Verfahren demonstrieren.

Beginnen Sie mit der Züchtung von Cyanobakterien auf neun Zentimeter großen, sterilisierten BG-11-Platten, die 1,5 % Agar und 0,3 % Natriumthiosulfat enthalten. Inkubieren Sie die Platten bei 23 Grad Celsius unter einem 12-12-Lichtzyklus mit 50 Mikro-E Licht pro Quadratmeter und Sekunde. Um die Zellen zu erhalten, übertragen Sie sie wöchentlich auf frische BG-11-Agarplatten.

Innerhalb einer Woche erscheinen die Kulturen als grüne Bänder. Übertragen Sie die grünen Zellklumpen mit einer flammensterilisierten Schlaufe und streichen Sie sie auf die neue Platte. Um die DNA-Verdichtung zu beobachten, sammeln Sie die kultivierten Zellen sechs Tage lang am Ende der Lichtperiode.

Um die Zellen von der Platte zu lösen, fügen Sie einen Milliliter 0,2-molare Saccharose hinzu. Sammeln Sie dann die Zellsuspension und wiederholen Sie die Zugabe und Entfernung von Saccharose, bis die Lösung grün wird. Die Farbänderung zeigt an, dass die meisten Zellen freigegeben wurden.

Übertragen Sie nun 500 Mikroliter der suspendierten Zelllösung in ein Microfuge-Röhrchen und fügen Sie Hoechst-Färbung für eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Lassen Sie die Zellen dann 10 Minuten lang im Dunkeln inkubieren. Als nächstes schleudern Sie die Zellen herunter, verwerfen den Überstand und resuspendieren sie in 10 Mikrolitern 0,2-molaren Saccharose.

Übertragen Sie anschließend einen Mikroliter der Suspension auf einen Objektträger, legen Sie einen Deckschirm auf und beobachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem UV-Filter ausgestattet ist. Suchen Sie mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv nach Hinweisen auf eine DNA-Verdichtung, die in den meisten Zellen beobachtbar sein sollte. Bereiten Sie zunächst das Tauchgefriergerät vor.

Richten Sie dann den Flüssigstickstoffbehälter ein, indem Sie den Ethanbehälter und den Kühlstabaufsatz einsetzen. Füllen Sie als Nächstes den Behälter mit flüssigem Stickstoff und kühlen Sie ihn auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff ab. Laden Sie danach Ethan in den Behälter.

Achten Sie darauf, eine Schutzbrille zu tragen, da flüssiges Ethan explosiv ist. Entfernen Sie abschließend den Kühlstabaufsatz und decken Sie den Behälter mit einem Plastikdeckel ab, um Frost zu vermeiden. Um fortzufahren, wird die Kohlenstoffseite eines kohlenstoffbeschichteten EM-Gitters 30 Sekunden lang mit einer Plasma-Ionenbarriere bei 50 Milliampere glüht.

Bereiten Sie dann den Vitrobot gemäß dem Testprotokoll vor. Setzen Sie mit einer Pinzette das vorbehandelte EM-Gitter auf die Kammer. Behandeln Sie das EM-Gitter mit einem Mikroliter 15-Nanometer-BSA-Goldtracer, der als Referenzmarker dient, bevor Sie die Probe auftragen.

Nun aliquotieren Sie 2,5 Mikroliter Zellsuspension auf das Gitter. Tupfen Sie überschüssige Lösung mit Filterpapier ab und frieren Sie das Gitter sofort in flüssigem Ethan ein. Bewahren Sie das gefrorene Gitter in flüssigem Stickstoff auf, bis es untersucht werden kann.

Starten Sie als Nächstes das HVEM und stellen Sie es auf eine Hochspannung von einem Megavolt ein. Kühlen Sie dann den Probengitterhalter mit flüssigem Stickstoff auf minus 150 Grad Celsius ab. Montieren Sie nach dem Abkühlen das gefrorene Gitter in den gekühlten Kryo-Probenhalter und laden Sie es in das HVEM.

Achten Sie darauf, dass das Setup nicht mit Eis verunreinigt wird. Wählen Sie nun einen Bildbereich mit der geringen Vergrößerung von 1.000 Mal aus. Passen Sie dann die Höhe der euzentrischen Z-Achse an und neigen Sie den Probentisch um minus 60 Grad.

Entfernen Sie dann das Spiel der Kippdrehung. Fokussieren Sie nun in der Nähe des Zielortes mit einer 10.000-fachen Vergrößerung. Stellen Sie einen Unterfokus von sechs bis 10 Mikrometern durch Abweichung vom fokussierten Bild ein.

Stellen Sie für die Bildgebung die Dosis auf zwei Elektronen pro Quadrat-Angström pro Sekunde oder weniger ein. Behalten Sie die Elektronendosis im Auge, die von der Stromdichte reflektiert wird, und machen Sie ein Bild mit einer Digitalkamera oder auf einem Elektronenfilm. Erfassen Sie als Nächstes Neigungsbilder von minus 60 bis plus 60 Grad in Schritten von zwei bis vier Grad.

Nutzen Sie nach Möglichkeit die automatisierten Funktionen des Mikroskops. Öffnen Sie das kommerzielle Softwarepaket und laden Sie die Neigungsbilder für die tomographische Rekonstruktion. Erstellen Sie dann mit dem Befehl tif2mrc oder newstack eine Bildstapeldatei aus den einzelnen Bildern.

Starten Sie als Nächstes die eTomo GUI-Software und geben Sie die Bildparameter für Pixelgröße, Passermarkendurchmesser, Bilddrehung usw. ein. Erstellen Sie also das Bearbeitungsskript. Verwenden Sie nun die vorgeschlagene Software, um eine Neigungsreihe zu erstellen, die mit Passermarken ausgerichtet ist und einen mittleren Restfehler von weniger als 0,5 aufweist.

Rekonstruieren Sie abschließend ein 3D-Tomogramm mit dem SIRT-Algorithmus. Extrahieren Sie nun einen interessierenden Bereich aus dem Tomogramm und wenden Sie einen Entrauschungsfilter an, z. B. einen anisotropen Diffusionsfilter, einen bilateralen Filter oder einen mathematischen Morphologiefilter. Führen Sie die Filterung mit Parametern durch, die den Bildkontrast verbessern.

Segmentieren Sie als Nächstes ein interessantes Feature. Verwenden Sie die Slicing-Funktion, um das Tomogramm zu öffnen. Wechseln Sie dann zum Fenster Segmentierungseditor und wählen Sie ein neues Beschriftungsfeld aus, um eine Segmentierungsdatei zu erstellen.

Verfolgen Sie dann manuell den Rand des interessierenden Features im ersten Slice und dann in jedem der anderen Slices. Zusätzliche interessante Funktionen können mit denselben Vorgängen hinzugefügt werden. Um nun ein Oberflächen-Rendering mithilfe der Optionen im Menü SurfaceGen zur Visualisierung des segmentierten Volumens zu erzeugen, wählen Sie das Menü SurfaceView aus.

Verwenden Sie zum Verschieben, Drehen und Vergrößern des 3D-Volumens die Werkzeuge im 3D-Viewer-Fenster. Die automatische Segmentierung kann mit dem Zauberstab-Tool durchgeführt werden. Klicken Sie auf ein Objekt und passen Sie die Schieberegler in Anzeige und Maskierung so an, dass die Merkmale des Objekts vollständig ausgewählt sind.

In einer präzisen Synchronkultur zeigt die mit Hoechst markierte DNA im dunklen Zustand eine normale, gleichmäßige Verteilung und verdichtet sich dann während der Lichtperiode schrittweise innerhalb der Zelle und nimmt am Ende der Lichtperiode eine wellenförmige, stäbchenförmige Struktur an. Schließlich teilt sich der Stab in der Mitte, und seine beiden Teile verteilen sich auf die Tochterzellen. Nach der Zellteilung verschwindet die verdichtete DNA sofort und die DNA kehrt zu einer normalen, gleichmäßigen Verteilung zurück.

Als Zellen im Endstadium der DNA-Verdichtung eingefroren und mit Hilfe der Hochspannungs-Elektronenmikroskopie beobachtet wurden, zeigten viele eine deutliche DNA-Verdichtung, die leicht von normalen Zellen unterschieden werden konnte. Einige zeigten eine Verengung im Zentrum der Zellen, wie vor der Zellteilung erwartet. Von den 3D-Tomogrammen wird kompakte DNA sichtbar im Zytoplasma abgetrennt und ist von einem Material mit geringer Dichte umgeben.

Die Thylakoidmembranschichten sind entlang des wellenförmigen Stabes der verdichteten DNA verzerrt. Interessanterweise haften viele kleine Phosphatkörper an der verdichteten DNA und treten in der Regel paarweise auf. Diese Polyphosphatkörper können die Lieferanten von Phosphat für die DNA-Synthese sein.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Ultrastruktur ganzer Bakterienzellen in der Nähe des lebenden Zustands zum richtigen Zeitpunkt durch Kryo-Hochspannungs-Elektronenmikroskopie ohne zusätzliche Behandlung wie Färben visualisieren können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass sich der Zustand der DNA-Verdichtung mit jeder Minute am Ende des Lichtzyklus ändert. Stellen Sie sicher, dass Sie nicht den besten Zeitpunkt verpassen, um die Probe einzufrieren.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie CLEM durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Lokalisierung bestimmter Proteine oder Nukleotide in der verdichteten DNA zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung soll diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg ebnen, um die Zellteilung, DNA-Segregation und Virusinfektion in Bakterien oder in kleinen Eukaryoten zu erforschen.