Name: Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie DNA-Verdichtung in Cyanobakterien während des Zellzyklus durch Hochspannungs-Cryo-Elektronentomographie sichtbar gemacht wird. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Einblicke in bakterielle Ultrastrukturen.

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Die Autoren danken Tammo Reisewitz für kritische Lesart der Handschrift, und Mako Hayashi und Sayuri Hagiwara für sorgfältige Pflege und Beobachtung von Cyanobakterien, Yoshitaka Kimori für die Bildverarbeitung, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki und Miyoko Nagayoshi für die Hilfe bei Segmentierung der Strukturen. Diese Arbeit wurde durch die Collaborative Study Program des National Institute für physiologische Wissenschaften (NIPS), Y.K unterstützt.

(1) synchrone Kultur der Cyanobakterien
<ol><li>Kultur S. Elongatus PCC 7942 auf sterilisierte BG 11 Teller (in einer 9 cm steril Kunststoff Petrischale), 1,5 % (w/V) Agar und 0,3 % (w/V) Natriumthiosulfat8enthalten.</li>
	<li>Legen Sie die Platten in einer Kammer Wachstum bei 23 ° C mit einer Intensität von 50 µE/m2/s und je nach 12 h Licht/12 h dunkel-Zyklen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen auf frischer BG11 Agarplatten einmal pro Woche. Hinweis: Die Kulturen auf Agar erscheinen als grüne Bänder der aktiv proliferierender Zellen nach einer Woche unter dieser Bedingung Kultur.</li>
	<li>Nehmen Sie grüne Klumpen von Zellen mit einer Flamme sterilisiert Drahtschlinge und Streifen die Zellen auf ein frischer BG11 nährbodenplatte. Tun Sie dies auf einer sauberen Werkbank.</li>
</ol>2. Überwachung durch Fluoreszenz-Mikroskopie
<ol><li>Verwenden Sie Zellen auf der Agarplatte für 6 Tage kultiviert, um DNA Verdichtung zu beobachten. Sammeln Sie Zellen von der Platte am Ende die lichtperiode durch Gießen 1 mL 0,2 M Saccharose-Lösung über die Zellen. Wiederholen Sie, Gießen die Lösung auf die Zellen, so dass die meisten Zellen gesammelt werden. Übertragen Sie die Lösung suspendiert-Zelle in eine Mikro-Schlauch für DNA-Färbung.</li>
	<li>Fügen Sie DNA Farbstoff (z.B. Hoechst 33342) Färbelösung zu 500 µL der hängenden Zelle Lösung in ein Mikro-Schlauch, eine Endkonzentration von 1 µg/mL. Dann halten Sie das Rohr in der Dunkelheit für 10 Minuten.</li>
	<li>Zentrifuge für 1 min bei 2.000 X g zu sedimentieren die Zellen. Verwerfen Sie den überstand und fügen Sie 10 µL 0,2 M Saccharoselösung um einen dichten Zellsuspension zu erhalten.</li>
	<li>1 µL der Lösung mit gefärbten Zellen zu einem Dia-Glas zu übertragen, setzen ein Deckglas und beobachten mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem UV-Filter mit einem Objektiv mit einer Vergrößerung von 100 X und Immersionsöl ausgestattet.</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass die DNA-Verdichtung an dieser Stelle in den meisten Zellen beobachtet wird, dann Einfrieren als nächstes bereiten Sie die Probe vor.</li>
</ol>3. Probe einfrieren für Cryo-HVET
<ol><li>Ein Sprung-Einfrieren-Gerät einrichten. Füllen Sie den Tank mit flüssigem Stickstoff und starten Sie die Cryo-Kühlkammer nach dem Anschluss des Tanks und der Kammer mit einem Teflonschlauch.</li>
	<li>Füllen Sie flüssiges Ethan in einen kleinen Cupper Topf im Inneren der Kammer nach dem Abkühlen der Kammer auf Temperatur von flüssigem Stickstoff. Trage eine Brille während des Betriebes, denn flüssiges Ethan explosiv ist.</li>
	<li>Glow discharge die Kohlenstoff-Seite von einer löchrigen Kohlenstoff-beschichtete EM Grid (löchrige Netz) für 30 s bei 50 mA mit einem Plasma-Ionen Bombarder.</li>
	<li>1 µL der BSA gold Tracer gelten (15 nm) an das löchrige Netz als treuhändische Marker.</li>
	<li>Ein Aliquot 2,5 µL Zellen in der DNA Verdichtung Stufe auf den löchrigen Raster anwenden Tupfen Sie die überschüssige Lösung mit einem Filterpapier. Tauchen Sie das Raster in flüssigem Ethan mit einem Kolben im Sprung Einfrieren Gerät sofort.</li>
	<li>Speichern Sie die gefrorenen Gitter in flüssigem Stickstoff Lagerung, bis sie untersucht werden.</li>
</ol>(4) Cryo-HVET
<ol><li>Richten Sie die HVEM bei einer hohen Spannung von 1 MV.</li>
	<li>Montieren Sie das gefrorene Raster in einem Cryo-Probenhalter für HVEM vorgekühlt bis-150 ° C mit flüssigem Stickstoff innerhalb der Cryo-Workstation und laden Sie sie in die HVEM. Achten Sie darauf, zur Vermeidung von Kontaminationen durch Eis.</li>
	<li>Wählen Sie einen imaging-Bereich bei niedriger Vergrößerung 1, 000 X. Die euzentrische z-Höhe einstellen.</li>
	<li>Kippen Sie den Objekttisch bis-60 ° und entfernen Sie die Gegenreaktion der kippbaren Rotation zu.</li>
	<li>Stellen Sie den Fokus in der Nähe von den Zielort bei einer Vergrößerung von 10, 000 X. Legen Sie eine unter Fokus von 6 bis 10 µm durch Abweichung von den scharfen Bild. Für Bildgebung, setzen Sie die Dosis auf 2 e–/Å-2 oder weniger auf die Probe vorher.</li>
	<li>Messen Sie die Elektron-Dosis durch die Stromdichte auf dem Bildschirm in HVEM. Nehmen Sie ein Bild auf ein Elektron Film oder Digitalkamera mit der gleichen Vergrößerung wie bei der Fokussierung Prozess.</li>
	<li>Kassiere Tilt Bilder manuell nach dem gleichen Verfahren wie in (4.5)-60 ° bis + 60 ° bei einer Neigung Winkel Inkrement von 2°, 4°. Hinweis: In vielen modernen Elektronenmikroskopen, ist der Erwerb der Tilt-Serie durch die Kombination von einer digitalen Kamera automatisiert. In diesem Fall folgen Sie der Anleitung. Für negativ-Filme, die Filme für 12 min. bei 20° C in einem entwicklertank mit voller Stärke Entwickler entwickeln und fix in ein Fixiermittel für 10 min. digitalisieren die Filme mit einer Auflösung von 4.000 dpi (0.635 nm/Pixel im Bild) mit einem Flachbettscanner. Bei einer Digitalkamera vorbehaltlich der gesammelten Bilder direkt zum nächsten Bild Verarbeitungsschritt. Bei Bedarf verkleinern Sie Bild von einem Median-Filter mit zwei bis vier binning (Größe Verkürzungsfaktor) und entsprechender Software (z.B. ImageJ).</li>
</ol>5. tomographische Rekonstruktion
<ol><li>Machen Sie eine Stapel-Image-Datei aus den einzelnen Bilder mit dem Befehl "tif2mrc" oder "Newstack" in IMOD Software9zu kippen.</li>
	<li>Starten Sie eTomo GUI Software in IMOD und Bildparameter gesetzt: Pixelgröße, treuhändische Durchmesser, Bilddrehung, etc.. Dann erstellen Sie Skripts.</li>
	<li>Individuelle Programme nach den aufgeführten Tabellen von Materialien, Software ausführen wo die Tilt-Serie mit kugelmarker (mit einem mittleren Restfehler weniger als 0,5) ausgerichtet ist. Zu guter Letzt ein 3D Tomogramm mit der SIRT-Algorithmus in IMOD zu rekonstruieren.</li>
	<li>Die Tomogramm eine Region of Interest (ROI) entziehen und denoise mithilfe eines Filters Denoise: ein anisotroper Diffusion in IMOD, eine bilaterale Filter EMAN10oder eine mathematische Morphologie filter11, etc., mit entsprechenden Parametern um den Kontrast zu verbessern.</li>
</ol>6. Segmentierung der Funktion von Interesse
Hinweis: Die unten beschriebene Verfahren ist spezifisch für die Software verwendet (siehe Materialtabelle) aber andere Softwarepakete können stattdessen verwendet werden. Lesen Sie in ihrer Bedienungsanleitung.
<ol><li>Im 3D Viewer-Fenster können Tomogramm auf Amira Software öffnen und eine OrthoSlice zu generieren.</li>
	<li>Erstellen Sie im Editorfenster Segmentierung eine Segmentierung Datei indem Sie ein neues "Label-Feld" auswählen.</li>
	<li>Nachzeichnen Sie die Begrenzung der Funktion von Interesse (FOI) manuell. Folgen Sie der FOI durch alle Tomogramm Scheiben. Erstellen Sie für die zweite FOI ein neues "Material" und wiederholen Sie den Vorgang.</li>
	<li>Generieren Sie eine Surface Rendering durch Auswahl im Menü "SurfaceGen". Um die segmentierten Volumen sichtbar zu machen, wählen Sie Menü "SurfaceView". Zum Verschieben, drehen und Zoomen in das 3D-Volumen, verwenden Sie die Tools in der 3D Viewer-Fenster.</li>
	<li>Verwenden Sie für automatische Segmentierung der Magic-Wand-Tool. Klicken Sie auf ein Objekt, und stellen Sie den Regler bei Anzeige und Maskierung den Wertebereich abzudecken, so dass das Objekt vollständig von seinen Funktionen ausgewählt ist.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Wir haben eine Reihe von Protokollen zur Visualisierung von Transienten DNA Verdichtung in Cyanobakterien vorgestellt. Das grundlegende Konzept ist ähnlich dem Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM)12. Darüber hinaus in dieser Methode waren live Cyanobakterien überwacht durch Fluoreszenz-Mikroskopie, schnell eingefroren auf EM Gittern und direkt mit der Hochspannung Cryo-Elektron Tomographie visualisiert. Als eine erste Anwendung, die detaillierte Struktur der DNA Bakterienzellen verdichtet wurde erfolgreich in 3D visualisiert. Derzeit, dieses Verfahren ist speziell für dieses Thema, aber intensiver, mit modifizierten Methodik in einigen Fällen angewendet wird. Hier werden die Vorteile, die Einschränkungen und die zukünftigen Möglichkeiten dieser Methode diskutiert.
Ein Vorteil dieser Methode ist die 3D Visualisierung der gesamten Zelle. 1 MV HVEM erfolgreich visualisiert die dynamische Struktur der subzellularen Organellen in der DNA Zellen verdichtet. Allerdings könnte die feine Struktur in normalen Zellen nicht aufgrund geringer Bildkontrast unterschieden werden. Erhöhung der unelastisch und Mehrfachstreuung bei dicken Exemplaren verwischt das Bild13. NULL- und die meisten wahrscheinliche Verlust Bildfilterung durch einen Energie-Filter kann durch die Reduzierung inelastische Streuung14,15Bildkontrast verbessern, aber es funktioniert nicht für Proben, die dicker als iMFP. Die NULL- und die meisten wahrscheinliche Verlust Gipfel verringern drastisch mit Dicke der Probe. Es ist besonders schwierig, einen ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnis für die Elektron sensible Eis eingebettete Proben zu erhalten. Murata Et Al. haben gezeigt, dass 1MV Scan Übertragung Mikroskopie (STEM) gibt höheren Kontrast als ein Hellfeld-Bild in Kunststoff eingebettet Hefezellen mit 5 µm Dicke, wo den Kontrast des Bildes in erster Linie von Amplitude Kontrast13 gegeben . Allerdings wird erwartet, dass die Wirkung von Domino Schaden auf höhere beschleunigten Elektronen eine weitere Einschränkung auf die Bestrahlungsdosis für Schaden-Sensitive Cryo-Proben16schafft. Die Anwendung der Volta und Zernike Phase Platten17,18 für HVEM möglicherweise nachteilige Schäden verringern, indem die Gesamtdosis in der Zukunft. Eine weitere Einschränkung mit HVEM bei dicken Proben kommt von der Tatsache, dass die Benutzer Einrichtungen, die HVEM weltweit knapp sind.
Verwenden eine alternative Methode, um Dicke Proben, Cryo-STEM-Tomographie bei 300 zu beobachten hat kV kontrastreiche Bilder auf gefrorene hydratisiert Proben mit einer Dicke von mehr als einige hundert Nanometer19gezeigt. Phasenkontrast in Cryo-STEM abzurufen, hat Pthychographic Elektronenmikroskopie auch eingeführt, in denen transponiert der Phase-Platte im Kondensator Objektiv eine Phase moduliert Beugung eine Pixelige 2D Detektor20. Die Bilder werden durch Berechnung aus mehreren Talfüllung abgerufen. Für direkte und schnelle 3D Cryo-Imaging von großen Native gefrorene Proben, Cryo-FIB-SEM kann auch gebrauchte21, wo seriellen Schnitt mit einem fokussierten Ionenstrahl und Gesicht Bildgebung blockieren ist für Bildgebung vollständig gefrorene Proben hydratisiert aufgetragen. Obwohl diese Technologien die Sichtweite des biologischen Proben erweitern, es ist schwer zu finden, den Zielspeicherort der Bakterien, z.B. Bakterien, bezeichnet, weil das Ziel vollständig unter dem Eis steht und nicht vor dem Trimmen identifiziert werden.
DNA-Verdichtung erzeugt eine klare Struktur in Cyanobakterien. DNA verdichtet Zellen unterscheiden sich leicht auch ohne wird durch eine große Dichte Tendenz innerhalb der Zellen, die nicht in normalen Zellen ist befleckt. Jedoch um weitere lokalen Veranstaltungen innerhalb der Zelle sichtbar zu machen, ist es notwendig den eindringmittel beschrifteten ROI in das Elektronenmikroskop zu übertragen. Für Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) sind in der Regel Lichtmikroskop und Elektronenmikroskop Bilder korreliert mit fluoreszierenden Latex-Kügelchen oder Quantenpunkte auf EM Finder Raster12. Die Kennzeichnung Partikel muss hohe Elektronendichte neben Fluoreszenz. Sie können genau und zuverlässig die Positionen zwischen den beiden Bildern korrelieren. Darüber hinaus kann durch die Bestätigung des markierten Bereich mit Cryo-Licht-Mikroskopie, vollständige Überlappung der ROI zwischen zwei Mikroskopen erreicht werden. Wenn genauere strukturelle Ereignisse in DNA Verdichtung zu charakterisieren, werden diese Partikel und Cryo-Licht Mikroskop ein unverzichtbares Werkzeug für eine robuste und präzise Korrelation in der Zukunft.
Dieser Artikel zeigt, wie die vorübergehende Struktur der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch eine Kombination von synchronen Kultur, Fluoreszenz-Mikroskopie und Hochspannung Cryo-Elektron Tomographie zu charakterisieren. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beobachtung der verdichteten DNA. Durch die Kombination dieser Methode mit anderen neuen Technologien erwähnt, es wird möglich sein, den Prozess der DNA Verdichtung näher untersuchen und entsprechend modifizierte Methoden sind allgemein anwendbar auf anderen dynamischen strukturellen Ereignisse in Bakterien.

DNA-Verdichtung ist eine dramatische zytoplasmatischen Ereignis, das in einigen Cyanobakterien identifiziert wurde. Wenn vorkommenden Elongatus kultiviert wurde unter 12 h Zyklus hell/dunkel, erschien Ende der lichtperiode, unterscheidet sich deutlich von seinen Auftritt auf das andere Mal war kondensierten DNA Punkte1. Es wurde vermutet, dass dieser Prozess durch eine innere Uhr, die basierend auf dem Kai Proteine2gesteuert wird. Seki Et Al. haben berichtet, dass die DNA mit Hoechst 33342 befleckt war in S. Elongatus Zellen gegen Ende der lichtperiode verdichtet und zeigte eine wellige Stab-Form unter dem Fluoreszenzmikroskop. Die verdichtete DNA dann getrennt in zwei in der Mitte der Stange wie die Zelle geteilt, und schließlich zurück zu einem normalen gleichmäßige Verteilung in jede tochterzelle3. Jedoch behindert seine Vergänglichkeit und große Größe für Elektronenmikroskopie Strukturanalyse. Murata Et Al. kombiniert mehrere Methoden, einschließlich der synchronen Kultur, Fluoreszenz-Mikroskopie, schnelles Gefrieren und hoher Spannung Elektron Cryo-Tomographie (Cryo-HVET), und erfolgreich bei der Ermittlung der Struktur des vorübergehenden DNA Verdichtung einschließlich der Kinetics von Polyphosphat Körper (PPBs)4. Das Manuskript enthält bildliche Erklärung des Bildmaterials schwer im Detail durch die Kombination der experimentellen Verfahren.
S. Elongatus hat eine Kapsel Form, eine Länge von 2 bis 5 µm, einer Breite von über 0,5 µm und die perfekte DNA-Verdichtung erscheint in lebenden Zellen nur für sehr kurze Zeit. Daher waren die strukturellen Veränderungen in der Cyanobakterien DNA Verdichtung im Detail unbekannt. Um diese Strukturen durch Elektronenmikroskopie untersuchen, ist es notwendig, zwei technische Probleme zu überwinden. Ist die Beobachtung einer dicken Probe des ganzen Bakteriums bei in der Nähe von einheimischen Bedingungen, und die andere ist die schnelle Fixierung einer dynamischen Struktur. Für das erste Problem hängt die unelastische mittlere freie Weglänge (iMFP) der Elektronen die Beschleunigungsspannung der Elektronen-Mikroskop5. In einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) von 300 kV, es ist weniger als 350 nm. Zum Beispiel, wenn ein Eis eingebettet cyanobakteriums (Probe Dicke ≈ 600 nm) wird bei 200kV TEM beobachtet (iMFP ≈ 250 nm), die Strukturen im Inneren der Zelle sind schwer zu beobachten. Durch Kontrast, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) geben kann und Bild der cytoplasmatische Struktur in der Zelle (Abbildung 1). In diesem Protokoll, als ein Teil der Lösung, eine Hochspannungs-Elektronen-Mikroskop (HVEM) bei einer Beschleunigungsspannung von 1 MV war beschäftigt. Allerdings sind Einrichtungen, die HVEM implementieren weltweit begrenzt. Mögliche alternative Lösungen sind auch in die Diskussion Abschnitt diskutiert. Das zweite Problem wurde durch Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) gelöst. Dies ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Visualisierung von dynamischen Strukturen auf in der Nähe von einheimischen Bedingungen, wo die Probe ist in flüssigem Ethan mit einem schnellen Einfrieren Gerät schnell eingefroren, und der eingefrorene Moment wird direkt mit einem Minimum an Modifikationen6beobachtet. Kombination mit Computertomographie, kann eine Momentaufnahme der dreidimensionalen (3D) Strukturen aus der Neigung der Serie7rekonstruiert werden. In diesem Experiment DNA Verdichtung wurde in S. Elongatus mit synchronen Kultur unter 12 h Zyklus jeder hell/dunkel wiedergegeben, und der Zeitplan für das Einfrieren der Probe wurde durch Überwachung unter dem Fluoreszenzmikroskop bestimmt.
Die hier beschriebenen Vorgehensweisen gelten allgemein für die Untersuchung von dynamischen Strukturen in Bakterienzellen, z. B. die Zellteilung, Chromosom Segregation und Phagen-Infektion, und haben ein Potenzial, neue Wege in der mikrobiologischen Forschung zu öffnen.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342 Lösung</td><td>Dojindo</td><td>346-07951</td><td>1mg/ml in H2O</td></tr><tr><td>Agar Pulver (für die Pflanzenkultur)</td><td>Wako</td><td>016-11875</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Wako</td><td>027-02192</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Manganchlorid-Tetrahydrat</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>99%</td></tr><tr><td>Zinksulfat-Heptahydrat</td><td>Wako</td><td>264-00405</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Natriummolybdat</td><td>Wako</td><td>196-02472</td><td>99%</td></tr><tr><td>Kupfersulfat-Pentahydrat</td><td>Wako</td><td>039-04412</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Kobaltnitrat-Hexahydrat</td><td>Wako</td><td>031-03752</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Natriumnitrat</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>99%</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Wako</td><td>131-00405</td><td>99,5</td></tr>%<tr><td>Calcium Chlorid-Dehydrierung</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>99,5</td></tr>%<tr><td>Zitronensäure</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>98%</td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>Dojindo</td><td>343-01861</td><td>99,5</td></tr>%<tr><td>Natriumcarbonat</td><td>Wako</td><td>197-01581</td><td>99,8</td></tr>%<tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>99%</td></tr><tr><td>TES (Gut' </td><td>Dojindo</td><td>344-02653</td><td>99%</td></tr><tr><td>Eisenammoniumcitrat</td><td>Wako</td><td>092-00802</td><td></td></tr><tr><td>Natriumthiosulfat-Pentahydrat</td> 1. Klasse <td>Wako</td><td>197-03585</td><td>99%</td></tr><tr><td>BSA Gold Tracer 15nm</td><td>Aurion</td><td>215.133</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil EM Gitter</td><td>Quantifoil MicroTools</td><td>R3.5/1 Kupfergitter</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenfilme</td><td>Kodak</td><td>SO-163</td><td></td></tr><tr><td>Entwickler</td><td>Kodak</td><td>D19</td><td></td></tr><tr><td>Fixer</td><td>Kodak</td><td>Rapid Fixer</td><td>Lösung</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>Grade 1</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumskammer</td><td>NKsystem</td><td>LH-100SP</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE 50i</td><td></td></tr><tr><td>Hochspannung TEM</td><td>HItachi</td><td>H1250M</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Probenhalter für HVEM</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tauch-Gefriergerät</td><td>Leica</td><td>EM CPC</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Ionenbomber</td><td>Vakuumgerät</td><td>PIB-10</td><td></td></tr><tr><td>Lagerung von flüssigem Stickstoff</td><td>Taylor-Wharton</td><td>25LDB</td><td></td></tr><tr><td>Entwicklungstank</td><td>Dosaka EM</td><td>TB-3-75</td><td></td></tr><tr><td>Flachbettscanner</td><td>Nikon</td><td>Coolscan 9000ED</td><td></td></tr><tr><td>Segmentierungssoftware</td><td>FEI</td><td>Amira</td><td>https://www.fei.com/software/amira</td></tr><tr><td>Tomographische Rekonstruktionssoftware</td><td>eTOMO</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod</td></tr></tbody></table>

visualisierung der dna verdichtung in cyanobakterien durch hochspannungs-cryo-elektron tomographie

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Dieses Protokoll beschreibt, wie die vorübergehende DNA-Verdichtung in Cyanobakterien zu visualisieren. DNA-Verdichtung ist eine dramatische zytoplasmatischen Ereignis fand vor kurzem in einigen Cyanobakterien vor der Zellteilung auftreten. Jedoch aufgrund der großen Zellengröße und der vorübergehende Charakter ist es schwierig, die Struktur im Detail zu untersuchen. Um die Schwierigkeiten zu überwinden, ist zunächst DNA Verdichtung reproduzierbar in cyanobakteriums vorkommenden Elongatus PCC 7942 durch synchrone Kultur mit 12 h jedes Hell/Dunkel-Zyklus produziert. Zweitens ist die DNA Verdichtung durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht und aufgezeichnet durch schnelles gefrieren. Drittens: die detaillierte Struktur der DNA Zellen verdichtet wird in drei Dimensionen (3D) durch Hochspannung Cryo-Elektron Tomographie visualisiert. Dieser Satz von Methoden ist überall anwendbar, transiente Strukturen in Bakterien, z. B. die Zellteilung, Chromosom Abtrennung, Phagen Infektion etc.zu untersuchen., welche durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht und direkt visualisiert, indem Cryo-Elektron Tomographie zu geeigneten Zeitpunkten.

In einer präzise synchrone Kultur unter 12 h Zyklus jeder hell/dunkel, zeigt beschriftet mit Hoechst DNA eine normale gleichmäßige Verteilung in den dunklen Zustand (Abbildung 2a). Jedoch schrittweise innerhalb der Zelle während der lichtperiode verdichtet, und erscheint als eine stabförmige Wellenstruktur (Abb. 2 b) am Ende der lichtperiode. Schließlich teilt des Stabs in der Mitte (Pfeile in Abbildung 2 c) und zwei Teile sind verteilt auf die Tochterzellen (Abb. 2d). Nach der Zellteilung die verdichtete DNA verschwindet sofort, und die DNA wieder in eine normale gleichmäßige Verteilung.
Wenn ein Aliquot der Zellen, in denen die Zellen in der letzten Phase der DNA Verdichtung wurden sofort übertragen, auf einem löchrigen Raster und schnelle Einfrieren in flüssigem Ethan, und gefrorenen Raster wurde beobachtet, von 1 MV Cryo-HVEM, die internen Strukturen der Cyanobakterien einschließlich DNA, Thylakoidmembran Membran Schichten und Zellwände PPBs, erschien wie eine Momentaufnahme zum Zeitpunkt des Einfrierens (Abb. 3a). Viele Zellen könnte zeigte deutliche Verdichtung der DNA in den Zellen (weiße Pfeile in Abbildung 3a), und leicht zu unterscheiden von normalen Zellen (weiße Pfeilspitzen in Abb. 3 b). Einige ausgestellt einer Einschnürung in der Mitte der Zellen, wie vor der Zellteilung (gelber Pfeil in Abbildung 3a) erwartet.
In 3D Schichtbilder könnte große Organellen der Zelle segmentiert werden; Zellwand, Thylakoidmembran Membran Schichten, DNA und PPBs werden konnte (Abbildung 4) zu unterscheiden. Insbesondere war die verdichtete DNA durch eine deutliche Lücke im Zytoplasma getrennt, wo die DNA von geringer Dichte Material umgeben war und die Thylakoidmembran Membran Schichten auf dem welligen Stab der verdichteten DNA verzerrt waren. Dynamisches Verhalten des PPBs wurde neu beobachtet: in DNA verdichtet Zellen, viele kleine PPBs galten, DNA, einzuhalten, während sie groß sind und weniger in den normalen Zellen. Darüber hinaus ein Großteil der PPBs erschien als Paare, und einige DNA schien sich in einem Prozess der Trennung von der PPBs. Dies suggeriert, dass PPBs selbst als Anbieter von Phosphat für DNA-Synthese durch DNA-Vervielfältigung und Funktion in zwei aufgeteilt werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig1.jpg"> Abbildung 1. Cryo-EM Bilder von Eis eingebettet normalen Cyanobakterien, S. Elongatus PCC 7942 bei verschiedenen zunehmende Spannungen. (a) 200kV und (b) 1000kV. Maßstabsleiste = 500 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig2.jpg"> Abbildung 2: Fluoreszenz-Mikroskopie des cyanobakteriums S. Elongatus Zellen. Nach dem synchronen Kultur unter 12 Stunden jede hell/dunkel-Zyklen, wurden Zellen mit Hoechst 33342 gebeizt. (a) Zellen nach 2 h Auftreten von den dunklen Zustand zeigen einheitlich DNA Kennzeichnung. Die DNA in vielen Zellen verdichtet sich allmählich während der lichtperiode. Es bildete letztlich einen dicken Stab wellig (b) typisch für DNA-Verdichtung. Nach dieser Phase, die verdichteten DNA-Strukturen schnell in ihren Zentren (Pfeilspitzen) während der Zellteilung (c), und die zwei Fragmente aufgeteilt in die Tochterzellen getrennt (d). Die Tochterzellen wieder mehr einheitliche DNA Kennzeichnung wieder in die dunkle Zeit. Maßstabsleiste = 2 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig3.jpg"> Abbildung 3: Cryo-HVEM Bild von Cyanobakterien eingebettet in amorphen Ice (a) zeigt ein raw-Bild bei 0° Neigung. Bilder wurden am Ende der lichtperiode. Einige Zellen zeigen wellig stabförmige DNA Körper ähnlich wie eukaryotischen kondensierten Chromosomen (weisse Pfeile). In normalen Zellen weisen Cyanobakterien eine erkennbare DNA-Struktur innerhalb des Zytoplasmas (weiße Pfeilspitzen). Einige Weisen einer Einschnürung in der Mitte der Zellen erwartungsgemäß vor der Zellteilung (gelber Pfeil). (b) Xy, Xz, Yz-Scheiben von einem 3D Tomogramm. Gelber gepunkteten Linien zeigen Schnittpunkte der Scheiben. Maßstabsleiste = 2 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig4.jpg"> Abbildung 4: Ultrastruktur der Zellen, die DNA verdichtet. Die Hauptkomponenten sind segmentiert: Zellwand (hellgelb), Thylakoidmembran Membranen (rot) und DNA (blau). (a) zeigt eine Z-Scheibe von einem 3D Tomogramm. (b) alle Segmente. Die Einschnürung Zellseparation Angabe erscheint in der Mitte der Zelle (Pfeil). PPBs werden als gelbe oder orangefarbene Kugeln modelliert; jede orange Kugel stellt das Gegenstück zu den engsten gelbe Kugel. Maßstabsleiste = 500 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Dieses Protokoll beschreibt, wie die vorübergehende DNA-Verdichtung in Cyanobakterien zu visualisieren. Synchrone Anbau, Überwachung durch die Fluoreszenz-Mikroskopie, schnelles Gefrieren und hoher Spannung Cryo-Elektron Tomographie verwendet. Ein Protokoll für diese Methoden vorgestellt, und zukünftige Anwendungen und Entwicklungen diskutiert.

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, etwa wie sich die DNA-Struktur während des Zellzyklus von Bakterien verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es möglich ist, die Ultrastruktur ganzer Bakterienzellen in der Nähe des lebenden Zustands zu geeigneten Zeitpunkten ohne zusätzliche Behandlungen sichtbar zu machen. Chihong Song, ein Postdoc aus meinem Labor, und Mako Hayashi, ein Doktorand aus Dr. Kanekos Labor, werden das Verfahren demonstrieren.Beginnen Sie mit der Züchtung von Cyanobakterien auf neun Zentimeter großen, sterilisierten BG-11-Platten, die 1,5 % Agar und 0,3 % Natriumthiosulfat enthalten. Inkubieren Sie die Platten bei 23 Grad Celsius unter einem 12-12-Lichtzyklus mit 50 Mikro-E Licht pro Quadratmeter und Sekunde. Um die Zellen zu erhalten, übertragen Sie sie wöchentlich auf frische BG-11-Agarplatten.Innerhalb einer Woche erscheinen die Kulturen als grüne Bänder. Übertragen Sie die grünen Zellklumpen mit einer flammensterilisierten Schlaufe und streichen Sie sie auf die neue Platte. Um die DNA-Verdichtung zu beobachten, sammeln Sie die kultivierten Zellen sechs Tage lang am Ende der Lichtperiode.Um die Zellen von der Platte zu lösen, fügen Sie einen Milliliter 0,2-molare Saccharose hinzu. Sammeln Sie dann die Zellsuspension und wiederholen Sie die Zugabe und Entfernung von Saccharose, bis die Lösung grün wird. Die Farbänderung zeigt an, dass die meisten Zellen freigegeben wurden.Übertragen Sie nun 500 Mikroliter der suspendierten Zelllösung in ein Microfuge-Röhrchen und fügen Sie Hoechst-Färbung für eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Lassen Sie die Zellen dann 10 Minuten lang im Dunkeln inkubieren. Als nächstes schleudern Sie die Zellen herunter, verwerfen den Überstand und resuspendieren sie in 10 Mikrolitern 0,2-molaren Saccharose.Übertragen Sie anschließend einen Mikroliter der Suspension auf einen Objektträger, legen Sie einen Deckschirm auf und beobachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem UV-Filter ausgestattet ist. Suchen Sie mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv nach Hinweisen auf eine DNA-Verdichtung, die in den meisten Zellen beobachtbar sein sollte. Bereiten Sie zunächst das Tauchgefriergerät vor.Richten Sie dann den Flüssigstickstoffbehälter ein, indem Sie den Ethanbehälter und den Kühlstabaufsatz einsetzen. Füllen Sie als Nächstes den Behälter mit flüssigem Stickstoff und kühlen Sie ihn auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff ab. Laden Sie danach Ethan in den Behälter.Achten Sie darauf, eine Schutzbrille zu tragen, da flüssiges Ethan explosiv ist. Entfernen Sie abschließend den Kühlstabaufsatz und decken Sie den Behälter mit einem Plastikdeckel ab, um Frost zu vermeiden. Um fortzufahren, wird die Kohlenstoffseite eines kohlenstoffbeschichteten EM-Gitters 30 Sekunden lang mit einer Plasma-Ionenbarriere bei 50 Milliampere glüht.Bereiten Sie dann den Vitrobot gemäß dem Testprotokoll vor. Setzen Sie mit einer Pinzette das vorbehandelte EM-Gitter auf die Kammer. Behandeln Sie das EM-Gitter mit einem Mikroliter 15-Nanometer-BSA-Goldtracer, der als Referenzmarker dient, bevor Sie die Probe auftragen.Nun aliquotieren Sie 2,5 Mikroliter Zellsuspension auf das Gitter. Tupfen Sie überschüssige Lösung mit Filterpapier ab und frieren Sie das Gitter sofort in flüssigem Ethan ein. Bewahren Sie das gefrorene Gitter in flüssigem Stickstoff auf, bis es untersucht werden kann.Starten Sie als Nächstes das HVEM und stellen Sie es auf eine Hochspannung von einem Megavolt ein. Kühlen Sie dann den Probengitterhalter mit flüssigem Stickstoff auf minus 150 Grad Celsius ab. Montieren Sie nach dem Abkühlen das gefrorene Gitter in den gekühlten Kryo-Probenhalter und laden Sie es in das HVEM.Achten Sie darauf, dass das Setup nicht mit Eis verunreinigt wird. Wählen Sie nun einen Bildbereich mit der geringen Vergrößerung von 1.000 Mal aus. Passen Sie dann die Höhe der euzentrischen Z-Achse an und neigen Sie den Probentisch um minus 60 Grad.Entfernen Sie dann das Spiel der Kippdrehung. Fokussieren Sie nun in der Nähe des Zielortes mit einer 10.000-fachen Vergrößerung. Stellen Sie einen Unterfokus von sechs bis 10 Mikrometern durch Abweichung vom fokussierten Bild ein.Stellen Sie für die Bildgebung die Dosis auf zwei Elektronen pro Quadrat-Angström pro Sekunde oder weniger ein. Behalten Sie die Elektronendosis im Auge, die von der Stromdichte reflektiert wird, und machen Sie ein Bild mit einer Digitalkamera oder auf einem Elektronenfilm. Erfassen Sie als Nächstes Neigungsbilder von minus 60 bis plus 60 Grad in Schritten von zwei bis vier Grad.Nutzen Sie nach Möglichkeit die automatisierten Funktionen des Mikroskops. Öffnen Sie das kommerzielle Softwarepaket und laden Sie die Neigungsbilder für die tomographische Rekonstruktion. Erstellen Sie dann mit dem Befehl tif2mrc oder newstack eine Bildstapeldatei aus den einzelnen Bildern.Starten Sie als Nächstes die eTomo GUI-Software und geben Sie die Bildparameter für Pixelgröße, Passermarkendurchmesser, Bilddrehung usw. ein. Erstellen Sie also das Bearbeitungsskript. Verwenden Sie nun die vorgeschlagene Software, um eine Neigungsreihe zu erstellen, die mit Passermarken ausgerichtet ist und einen mittleren Restfehler von weniger als 0,5 aufweist.Rekonstruieren Sie abschließend ein 3D-Tomogramm mit dem SIRT-Algorithmus. Extrahieren Sie nun einen interessierenden Bereich aus dem Tomogramm und wenden Sie einen Entrauschungsfilter an, z. B. einen anisotropen Diffusionsfilter, einen bilateralen Filter oder einen mathematischen Morphologiefilter. Führen Sie die Filterung mit Parametern durch, die den Bildkontrast verbessern.Segmentieren Sie als Nächstes ein interessantes Feature. Verwenden Sie die Slicing-Funktion, um das Tomogramm zu öffnen. Wechseln Sie dann zum Fenster Segmentierungseditor und wählen Sie ein neues Beschriftungsfeld aus, um eine Segmentierungsdatei zu erstellen.Verfolgen Sie dann manuell den Rand des interessierenden Features im ersten Slice und dann in jedem der anderen Slices. Zusätzliche interessante Funktionen können mit denselben Vorgängen hinzugefügt werden. Um nun ein Oberflächen-Rendering mithilfe der Optionen im Menü SurfaceGen zur Visualisierung des segmentierten Volumens zu erzeugen, wählen Sie das Menü SurfaceView aus.Verwenden Sie zum Verschieben, Drehen und Vergrößern des 3D-Volumens die Werkzeuge im 3D-Viewer-Fenster. Die automatische Segmentierung kann mit dem Zauberstab-Tool durchgeführt werden. Klicken Sie auf ein Objekt und passen Sie die Schieberegler in Anzeige und Maskierung so an, dass die Merkmale des Objekts vollständig ausgewählt sind.In einer präzisen Synchronkultur zeigt die mit Hoechst markierte DNA im dunklen Zustand eine normale, gleichmäßige Verteilung und verdichtet sich dann während der Lichtperiode schrittweise innerhalb der Zelle und nimmt am Ende der Lichtperiode eine wellenförmige, stäbchenförmige Struktur an. Schließlich teilt sich der Stab in der Mitte, und seine beiden Teile verteilen sich auf die Tochterzellen. Nach der Zellteilung verschwindet die verdichtete DNA sofort und die DNA kehrt zu einer normalen, gleichmäßigen Verteilung zurück.Als Zellen im Endstadium der DNA-Verdichtung eingefroren und mit Hilfe der Hochspannungs-Elektronenmikroskopie beobachtet wurden, zeigten viele eine deutliche DNA-Verdichtung, die leicht von normalen Zellen unterschieden werden konnte. Einige zeigten eine Verengung im Zentrum der Zellen, wie vor der Zellteilung erwartet. Von den 3D-Tomogrammen wird kompakte DNA sichtbar im Zytoplasma abgetrennt und ist von einem Material mit geringer Dichte umgeben.Die Thylakoidmembranschichten sind entlang des wellenförmigen Stabes der verdichteten DNA verzerrt. Interessanterweise haften viele kleine Phosphatkörper an der verdichteten DNA und treten in der Regel paarweise auf. Diese Polyphosphatkörper können die Lieferanten von Phosphat für die DNA-Synthese sein.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Ultrastruktur ganzer Bakterienzellen in der Nähe des lebenden Zustands zum richtigen Zeitpunkt durch Kryo-Hochspannungs-Elektronenmikroskopie ohne zusätzliche Behandlung wie Färben visualisieren können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass sich der Zustand der DNA-Verdichtung mit jeder Minute am Ende des Lichtzyklus ändert. Stellen Sie sicher, dass Sie nicht den besten Zeitpunkt verpassen, um die Probe einzufrieren.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie CLEM durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Lokalisierung bestimmter Proteine oder Nukleotide in der verdichteten DNA zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung soll diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg ebnen, um die Zellteilung, DNA-Segregation und Virusinfektion in Bakterien oder in kleinen Eukaryoten zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir zeigen hier, wie Elektronen cryotomography (ECT) zu verwenden, um auf die Ultrastruktur von Bakterienzellen in nahezu native Staaten zu studieren, "makromolekularen" (~ 4 nm) Auflösung.

Electron Cryotomography von Bakterienzellen

Quelle: Biller, S. J., et al. Isolierung und Charakterisierung cyanobakterieller extrazellulärer Vesikel. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Präparation von extrazellulären Cyanobakterienvesikeln für die Transmissionselektronenmikroskopie durch Negativfärbung, die eine hochauflösende Visualisierung der Vesikelmorphologie, -größe und -reinheit für strukturelle und vergleichende Analysen ermöglicht.

Visualisierung cyanobakterieller extrazellulärer Vesikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Quelle: Murata, K. et. al., Visualisierung der DNA-Kompression in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Kryo-Elektronentomographie. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die synchrone Kultivierung von Cyanobakterien unter Hell-Dunkel-Zyklen, um die zirkadiane regulierte DNA-Verdichtung zu untersuchen. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt kondensierte DNA zu definierten Zeitpunkten und bestätigt damit die Ausrichtung des Zellzyklus in der gesamten Population.

Synchronisierung von Cyanobakterienkulturen und DNA-Verdichtung durch Hell-Dunkel-Zyklen

Wir präsentieren ein Protokoll, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen von ganzen Mitochondrien. Die Technik liefert detaillierte Einblicke in die Struktur, Funktion und Organisation der großen Membranproteinkomplexen in nativen biologischen Membranen.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Wir präsentieren ein Protokoll, wie Hochdurchsatz-Kryo-Elektronentomographie zu nutzen, um hochauflösende in situ Strukturen der molekularen Maschinen zu bestimmen. Das Protokoll unterstützt große Datenmengen zu verarbeiten sind, vermeidet gemeinsame Engpässe reduziert Ressourcenstillstandszeit, so dass der Benutzer auf wichtige biologische Fragen zu konzentrieren.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.

Anwendung von Live Cell Imaging und Cryo-Electron Tomography zur Auflösung der raumzeitlichen Merkmale des Legionella pneumophila Dot/Icm Sekretionssystems

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Probenvorbereitungs- und Datenerfassungsschritte beschreibt, die in der Kryo-Soft-Röntgentomographie (SXT) erforderlich sind, um die Ultrastruktur ganzer kryokonservierter Zellen mit einer Auflösung von 25 nm Halbtonhöhe abzubilden.

Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Lamellenpräparation von gefrorenen biologischen Proben mittels kryofokussiertem Ionenstrahl-Mikrobearbeitung für hochauflösende Strukturstudien von Makromolekülen in situ mit Kryo-Elektronentomographie. Das vorgestellte Protokoll enthält Richtlinien für die Herstellung von hochwertigen Lamellen mit hoher Reproduzierbarkeit zur strukturellen Charakterisierung von Makromolekülen innerhalb der Saccharomyces cerevisiae.

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Das vorliegende Protokoll beschreibt die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie-Ferndatenerfassung mit Tomo5 und die anschließende Datenverarbeitung und Subtomogramm-Mittelung mittels emClarity. Apoferritin wird als Beispiel verwendet, um detaillierte Schritt-für-Schritt-Prozesse zu veranschaulichen, um eine Kryo-ET-Struktur bei 2,86 Å Auflösung zu erreichen.

Kryo-Elektronen-Tomographie Ferndatenerfassung und Subtomogramm-Mittelwertbildung

Die Kryo-STEM-Tomographie bietet eine Möglichkeit, Organellen intakter Zellen ohne Einbettung, Schnitt oder andere invasive Präparate sichtbar zu machen. Die erzielte 3D-Auflösung liegt derzeit im Bereich von wenigen Nanometern, mit einem Sichtfeld von mehreren Mikrometern und einer zugänglichen Dicke in der Größenordnung von 1 μm.

Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie

Erfahren Sie, wie DNA-Verdichtung in Cyanobakterien während des Zellzyklus durch Hochspannungs-Cryo-Elektronentomographie sichtbar gemacht wird. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Einblicke in bakterielle Ultrastrukturen.

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

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