Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Struktur und Organisation der mitochondrialen Proteine in C zwei zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein gefrorenes hydratisiertes Elektronenmikroskopgitter erzeugt wird, das die Probe enthält. Als nächstes wird eine dosisbegrenzte Neigungsreihe der Probe in einem Elektronen-Kryomikroskop aufgezeichnet.

Dann wird die Neigungsreihe verarbeitet, um ein tomographisches Volumen zu erzeugen. Schließlich werden die Proteindichten gemittelt, um die Struktur der Proteine zu bestimmen, und die Membranen werden segmentiert, um ihre 3D-Struktur sichtbar zu machen. Durch die Rückpositionierung der Mittelwerte von Proteinen in die Tom-Grahams-Zellen wird die Struktur und Organisation der Proteine in der Membran enthüllt.

Wir machen also Elektronen-Cry-Tomographie von Mitochondrien, weil wir verstehen wollen, wie sie auf molekularer Ebene funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z. B. der Elektronenmikroskopie dünner plastischer Schnitte, besteht darin, dass die Auflösung höher ist. Das Material ist in keiner Weise chemisch fixiert, und die molekularen Details der Proteine bleiben erhalten.

Die Beherrschung der Technik der Elektronenkrytographie kann einige Zeit in Anspruch nehmen, aber erfahrene Benutzer können fünf bis sechs TOM-Grunde von guter Qualität pro Sitzung erwerben. Der schwierigste Teil des Verfahrens besteht darin, gefrorene hydratisierte Gitter mit optimaler Eisdicke herzustellen. Nach dem Isolieren und Pelletieren von Mitochondrien gemäß dem Textprotokoll werden 250 millimolare T-Triosen in 10 millimolaren HEPA-Puffern verwendet, um das Pellet auf eine Konzentration von etwa fünf Milligramm pro Milliliter der gesamten Proteinglühentladung zu resuspendieren. Vollständig kohlenstoffhaltige EM-Gitter mit der Kohlenstoffseite nach oben in einem Vakuumgerät gemäß den Anweisungen des Herstellers verflüssigen einige Milliliter Ethan, indem ein Strom von Ethangas auf die Innenseite eines mit flüssigem Stickstoff gekühlten Aluminiumbehälters geleitet wird.

Nehmen Sie mit einer Pinzette ein Glimmentladungs-DM-Gitter auf und legen Sie es auf das Labor-Mix-Protein, eine konjugierte Gold-Fiducial-Suspension, eins zu eins mit der mitochondrialen Suspension, und tragen Sie sofort drei Mikroliter der Lösung auf das Gitter auf. Legen Sie als Nächstes die Pinzette in ein Vitrifikationsgerät, z. B. eine selbstgemachte Guillotine mit einem Keil Filterpapier, tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit vom Gitter ab und lassen Sie den Auslöser los, um das Gitter sofort in flüssiges Ethan zu tauchen. Dann das Gitter von flüssigem Ethan in flüssigen Stickstoff zu überführen.

Entfernen Sie das überschüssige Ethan vom Gitter, indem Sie die Spitze eines frischen Filterpapierkeils in das flüssige Ethan stecken. Wenn die Flüssigkeit aufsteigt, ziehen Sie das Gitter vorsichtig auf dem Filterpapier nach oben, halten Sie es unter der Flüssigkeitsfront und überführen Sie es dann sofort in flüssigen Stickstoff, um es für die spätere Verwendung aufzubewahren. Legen Sie das Gitter in eine Gitterbox und lagern Sie es in einem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Doer, um eine tomographische Neigungsreihe aufzunehmen.

Stellen Sie zunächst sicher, dass die Flüssigstickstoff-Doer voll sind, und überprüfen Sie, ob die Temperatur des Probentisches und der Gitterübertragungsvorrichtung unter 100 Kelvin liegt. Bestätigen Sie, dass das Elektronenmikroskop gut ausgerichtet ist, indem Sie ein Bild eines Testgitters aufnehmen und die Qualität der Dornenringe überprüfen. Die Ringe sollten rund sein und sich bis zum Rand des Bildes erstrecken. Als nächstes setzen Sie ein Gitter mit gefrorenen hydratisierten Mitochondrien ein.

Suchen Sie dann im Suchmodus nach Bereichen mit geeigneter Eisdicke und Probenqualität. Nehmen Sie ein sechs Sekunden langes Suchbild von vielversprechenden Bereichen auf, um die Eignung für die Datenerfassung zu bestimmen. Nachdem Sie einen guten Probenbereich gefunden haben, neigen Sie den Tisch um plus oder minus 60 Grad, um den maximalen Neigungsbereich zu bestimmen, der ohne Behinderung des Belichtungs- oder Fokusbereichs durch Gitterstäbe oder Eiskristalle auf einem nahegelegenen mit Eis gefüllten Loch mit ähnlichem Aussehen verfügbar ist, wechseln Sie in den Belichtungsmodus und passen Sie die Strahlintensität oder die Bildaufnahmezeit an.

Jedes aufgenommene Bild hat also eine Elektronendosis von 30 bis 50 Elektronen pro Pixel für CCDs oder sechs bis acht Elektronen pro Pixel pro Sekunde. Berechnen Sie bei direkten Elektronendetektoren das Dosisverteilungsverhältnis oder I Null über I 60, indem Sie die durchschnittliche Elektronenzahl für ein einsekündiges Bild, das bei null Grad aufgenommen wurde, durch das eines 60-Grad-Bildes über einem leeren Loch dividieren. Nehmen Sie ein Bild von einer Sekunde im Belichtungsmodus auf und notieren Sie sich die Elektronenzahl pro Ångström zum Quadrat.

Berechnen Sie unter Berücksichtigung des Dosisverteilungsverhältnisses die Gesamtzahl der Bilder und das Neigungsintervall, die für eine bestimmte Gesamtelektronendosis mit einer geeigneten automatischen Datenerfassungssoftware aufgezeichnet werden können. Einrichten und Aufnehmen eines Tom Agrams mit den eben ermittelten Parametern typischer Tomos. Beginnen Sie für diese Proben bei plus oder minus 20 Grad und gehen Sie durch null Grad, bevor Sie hohe Neigungen erreichen.

Um Tomos zu erstellen und zu segmentieren, konvertieren Sie die Neigungsserie in ein Dateiformat, das für die Rekonstruktionssoftware geeignet ist. Richten Sie die Bilder mit einem Tom-Graham-Rekonstruktionsprogramm wie Im mod aus, indem Sie die Position der goldenen Passermarken markieren. Generieren Sie nach dem Ausrichten einen Tommo Graham.

Verbessern Sie den Kontrast des Tommo-Graham, indem Sie zur Visualisierung einen Bildfilter wie den nichtlinearen und isotropen Diffusionsfilter verwenden, der mit IM o verteilt ist. Verwenden Sie handelsübliche Programme, um den Tom manuell zu segmentieren. Zuweisen von Voxeln, die der inneren und äußeren Membran entsprechen, zu separaten Layern Erstellen Sie nach der Zuweisung eine Oberfläche, um die Membranen zu visualisieren.

Markieren Sie mit der Clicker-Option im EM-Paket-Plugin für Emira die Position eines TP-Syntase-Partikels, indem Sie die markierten Partikel als Eingabe und ein entsprechendes Softwarepaket wie die Partikelschätzung verwenden. Berechnen Sie für das Elektronentomographie-Programm einen Agramm-Durchschnitt für eine Auflösungsschätzung. Berechnen Sie die Korrelation der Foyerschale zwischen zwei unabhängig voneinander ermittelten Sub-Tommo-Mittelwerten mit dem kostenlosen Visualisierungsprogramm.

Chimären passen bekannte Röntgenstrukturen in den Sub-Tom-Agramm-Durchschnitt zuerst manuell, dann automatisch mit dem Befehl Fit ein Wie in dieser Abbildung zu sehen, zeigt die manuelle Segmentierung der Membranen in einem mitochondrialen Elektronenschrei die Struktur des Christi in einem Mitochondrium. Durch die Abbildung von Mitochondrien aus Hefe-Knockout-Stämmen, denen bestimmte Proteine fehlen. Der Einfluss dieser Proteine auf die Christi-Morphologie kann beurteilt werden.

Hier ist ein Mitochondrium aus einem Hefestamm dargestellt, dem eine TP-Synthese-Untereinheit E fehlt, die für die Bildung eines TP-Synthe-Dimers erforderlich ist. Im Gegensatz zu den normalen Lala Christi von Wildtyp-Mitochondrien enthalten diese Organellen stattdessen eine Reihe von inneren Membranstrukturen, die entweder frei von Christi sind oder kleine ballonförmige Membraneinstülpungen enthalten. Bei Ingrammen mit gutem Kontrast sind A TP Synthes Dimere gut sichtbar, wie hier die gelben Pfeilspitzen anzeigen.

Durch die Segmentierung der Membranen kann der Ort der A-TP-Synthese, der nun durch die gelbe Kugel dargestellt wird, in Bezug auf die Morphologie von Christi visualisiert werden. In diesem Fall ermöglicht die A-TP-Synthese Reihen von Dimeren entlang der stark gekrümmten Kanten der Lo Meer Christi Sub-Tommo-Mittelung, die Strukturen von Proteinen mit Auflösungen von vier Nanometern oder besser zu bestimmen. Durch das Einpassen bekannter Röntgenstrukturen in den Sub-Tomo Graham können durchschnittliche atomare Modelle von Proteinkomplexen in ihrer natürlichen Umgebung wie zu sehen zusammengesetzt werden.

In diesem Beispiel können durchschnittliche Volumina wieder in den Tomo-Graham-Komplex eingebracht werden, um die Organisation einzelner Komplexe relativ zueinander und zu anderen Proteinkomplexen in der Membran zu unterstützen. Unser Protokoll zeigt, wie Sie mit Hilfe der Elektronen-Kryotomographie die Struktur und Organisation von Proteinkomplexen innerhalb der inneren Mitochondrienmembran bestimmen können. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die Struktur und Organisation anderer membrangebundener Proteine innerhalb verschiedener zellulärer Kompartimente zu bestimmen.

Die Probenvorbereitung ist der Schlüssel zu guten Thermogrammen. Das gefrorene hydratisierte Gitter muss perfekt glasige Augen mit einer Dicke von 70 bis 150 Nanometern enthalten. Normalerweise sieben wir fünf bis sechs Gitter, bis Sie einen Bereich mit optimaler Eisdicke und Probenqualität gefunden haben.

Für die Grammentnahme eignet sich am besten ein 300-Kilovolt-Transmissionselektronenmikroskop mit speziellem Kryotisch und Energiefilter sowie eine Kamera mit direktem Elektronendetektor, aber auch ein 200-Kilovolt-Instrument mit seitlichem Kryotisch und einer CCD-Kamera kann verwendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Cry-M-Gitter vorbereiten. Erfassen Sie eine Neigungsreihe, rekonstruieren Sie ein Thermogramm und berechnen Sie einen Sub-Tommo-Durchschnitt.

Dies sind die grundlegenden Fähigkeiten, die erforderlich sind, um zu untersuchen, wie sich die Organisation von Proteinen in einer Zelle auf die Fähigkeit dieser Zelle auswirkt, biologische Funktionen wie die effiziente A-TP-Synthese auszuführen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff und flüssigem Ethan sehr gefährlich sein kann und dass immer eine Schutzbrille und Handschuhe getragen werden sollten.