Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Struktur und Organisation der mitochondrialen Proteine in C zwei zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein gefrorenes, wasserhaltiges Elektronenmikroskopie-Gitter hergestellt wird, das die Probe enthält. Anschließend wird in einem Kryo-Elektronenmikroskop eine dosisbegrenzte Kipp-Serie der Probe aufgezeichnet.

Dann wird die Kippreihe verarbeitet, um ein tomographisches Volumen zu erzeugen. Schließlich werden die Protein-Dichten gemittelt, um die Struktur der Proteine zu bestimmen, und die Membranen werden segmentiert, um ihre dreidimensionale Struktur aufzudecken. Durch das erneute Einsetzen der gemittelten Proteinstrukturen in die Tom-Grahams wird die Struktur und Organisation der Proteine in der Membran sichtbar.

Wir führen die Elektronen-Kryotomographie von Mitochondrien durch, weil wir verstehen möchten, wie sie auf molekularer Ebene funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie der Elektronenmikroskopie dünner Kunststoffabschnitte, liegt in der höheren Auflösung. Das Material wird keiner chemischen Fixierung unterzogen, und die molekularen Details der Proteine bleiben erhalten.

Die Technik der Elektronen-Cryographie kann einige Zeit in Anspruch nehmen, bis sie beherrscht ist, aber erfahrene Anwender können pro Sitzung fünf bis sechs qualitativ hochwertige TOM-Aufnahmen erhalten. Der schwierigste Teil des Verfahrens besteht darin, gefroren-hydratierte Gitter mit optimaler Eisdicke herzustellen. Nach der Isolierung und Pellettierung der Mitochondrien gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie 250 Millimolar T-Triosen in 10 Millimolar HEPA-Puffer, um das Pellet auf eine Konzentration von etwa fünf Milligramm pro Milliliter Gesamtprotein aufzuschwemmen. Behandeln Sie die Kohlenstoff-Gitter für die Elektronenmikroskopie (EM) mit der Kohlenstoffseite nach oben in einem Vakuumgerät gemäß den Herstelleranweisungen, und verflüssigen Sie einige Milliliter Ethan, indem Sie einen Strom von Ethan-Gas auf die Innenseite eines mit flüssigem Stickstoff gekühlten Aluminiumbehälters leiten.

Verwenden Sie eine Pinzette, um eine glühentladungsbehandelte DM-Netzstruktur aufzuheben und auf die Arbeitsfläche zu legen. Mischen Sie das Protein mit einer konjugierten Gold-Fiducial-Suspension im Verhältnis eins zu eins mit der mitochondrialen Suspension und geben Sie unmittelbar drei Mikroliter der Lösung auf das Netz. Danach platzieren Sie die Pinzette in einer Vitrifizierungsvorrichtung, beispielsweise einer selbstgebauten Guillotine, und verwenden ein Filterpapierdreieck, um die überschüssige Flüssigkeit vom Netz abzubloten. Lösen Sie dann den Auslöser aus, um das Netz sofort in flüssiges Ethan einzutauchen. Anschließend überführen Sie das Netz aus flüssigem Ethan in flüssigen Stickstoff.

Entfernen Sie das überschüssige Ethan vom Gitter, indem Sie die Spitze eines frischen Filterpapierkegels in das flüssige Ethan tauchen. Während die Flüssigkeit aufsteigt, ziehen Sie das Gitter vorsichtig entlang des Filterpapiers nach oben, wobei es stets unterhalb der Flüssigkeitsfront bleibt, und überführen Sie es anschließend unverzüglich in flüssigen Stickstoff, um es für die spätere Verwendung aufzubewahren. Legen Sie das Gitter in eine Gitterbox und lagern Sie es in einem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Doer, um eine tomographische Kippreihen-Aufnahme durchzuführen.

Beginnen Sie damit, sicherzustellen, dass die Flaschen mit flüssigem Stickstoff gefüllt sind, und überprüfen Sie, ob die Temperatur des Probenträgers und der Gitterübertragungsvorrichtung unter 100 Kelvin liegt. Bestätigen Sie die gute Justage des Elektronenmikroskops, indem Sie ein Bild eines Testgitters aufnehmen und die Qualität der Thorn-Ringe überprüfen; die Ringe sollten rund sein und bis zum Rand des Bildes reichen. Danach setzen Sie ein Gitter mit gefriergetrockneten Mitochondrien ein.

Danach im Suchmodus nach Bereichen mit geeigneter Eisdicke und Probengüte suchen. Fertigen Sie ein sechssekündiges Suchbild von aussichtsreichen Bereichen an, um die Eignung für die Datensammlung zu beurteilen. Nachdem ein geeigneter Probem Bereich gefunden wurde, kippen Sie den Probentisch um plus oder minus 60 Grad, um den maximalen Kippbereich zu ermitteln, der verfügbar ist, ohne dass die Belichtungs- oder Fokussierungsfläche durch Gitterstäbe oder Eiskristalle in einem benachbarten, eisgefüllten Loch ähnlicher Erscheinung verdeckt wird. Wechseln Sie dann in den Belichtungsmodus und passen Sie die Strahlintensität oder die Bildaufnahmedauer an.

Daher weist jedes aufgezeichnete Bild eine Elektronendosis von 30 bis 50 Elektronen pro Pixel für CCDs oder sechs bis acht Elektronen pro Pixel und Sekunde auf. Bei direkten Elektronendetektoren berechnen Sie das Dosisverteilungsverhältnis oder I null durch I 60, indem Sie die durchschnittliche Elektronenzahl für ein eine Sekunde dauerndes Bild, das bei null Grad aufgenommen wurde, durch die eines 60-Grad-Bildes über einem leeren Loch dividieren. Nehmen Sie ein eine Sekunde dauerndes Bild im Belichtungsmodus auf und notieren Sie die Elektronenzahl pro Quadratangstrom.

Unter Berücksichtigung des Dosisverteilungsverhältnisses berechnen Sie die Gesamtanzahl der Aufnahmen und das Kippintervall, die für eine bestimmte Gesamtelektronendosis mit geeigneter automatischer Datensammlungssoftware aufgezeichnet werden können. Richten Sie eine Tom-Aufnahme mit den gerade bestimmten Parametern ein und nehmen Sie typische Tomogramme auf. Beginnen Sie bei diesen Proben bei plus oder minus 20 Grad und durchlaufen Sie den Nullpunkt, bevor Sie hohe Kippwinkel erreichen.

Um Tomos zu erstellen und zu segmentieren, konvertieren Sie die Kippreihe in ein für die Rekonstruktionssoftware geeignetes Dateiformat. Richten Sie die Bilder mithilfe eines Tom-Graham-Rekonstruktionsprogramms wie Im mod aus, indem Sie die Position der Gold-Fiducial-Marker markieren. Erstellen Sie nach der Ausrichtung einen Tommo-Graham.

Verbessern Sie den Kontrast des Tomo-Graham, indem Sie einen Bildfilter wie den nichtlinearen anisotropen Diffusionsfilter verwenden, der mit IM o zur Visualisierung bereitgestellt wird. Verwenden Sie handelsübliche Programme, um das Tomo manuell zu segmentieren. Weisen Sie Voxel, die der inneren und äußeren Membran entsprechen, separate Schichten zu. Erstellen Sie nach der Zuweisung eine Oberfläche, um die Membranen zu visualisieren.

Markieren Sie mithilfe der Klicker-Option im EM-Paket-Plugin für emira die Position von TP-Synthase-Partikeln, wobei die markierten Partikel als Eingabe dienen, und verwenden Sie ein geeignetes Softwarepaket wie die Partikelschätzung. Berechnen Sie für das Elektronentomographie-Programm einen Agram-Durchschnitt zur Auflösungsschätzung. Berechnen Sie die Foyer-Shell-Korrelation zwischen zwei unabhängig bestimmten Sub-Tommo-Mittelwerten unter Verwendung des kostenlosen Visualisierungsprogramms.

Chimera passt bekannte Röntgenstrukturen zuerst manuell, dann automatisch mit dem Befehl „fit“ in den Sub-Tom-Agram-Durchschnitt ein, wie in dieser Abbildung dargestellt. Die manuelle Segmentierung der Membranen in einem elektronenkryotomographischen Mitochondrium zeigt die Struktur der Cristae in einem Mitochondrium. Durch die Abbildung von Mitochondrien aus Hefe-Knockout-Stämmen, die bestimmte Proteine fehlen, kann der Einfluss dieser Proteine auf die Cristae-Morphologie bewertet werden.

Hier ist eine Mitochondrie eines Hefestamms dargestellt, der eine TP-Synthese-Untereinheit E fehlt, die für die Bildung von TP-Synthase-Dimeren erforderlich ist. Im Gegensatz zu den normalen Kristen wildtypischer Mitochondrien enthalten diese Organellen eine Reihe von Strukturen der inneren Membran, die entweder keine Kristen aufweisen oder kleine, ballonförmige Membraneinbuchtungen enthalten. In Aufnahmen mit gutem Kontrast sind TP-Synthase-Dimere leicht sichtbar, wie hier durch die gelben Pfeilspitzen angezeigt.

Durch die Segmentierung der Membranen kann die Lokalisation der ATP-Synthese, die nun durch die gelbe Kugel dargestellt wird, in Bezug auf die Morphologie der Cristae visualisiert werden. In diesem Fall bilden die ATP-Synthasen Reihen aus Dimere entlang der stark gekrümmten Ränder der Cristae. Die Subtomogramm-Durchschnittsbildung ermöglicht es, die Strukturen von Proteinen in Auflösungen von vier Nanometern oder besser zu bestimmen. Durch das Einpassen bekannter Röntgenstrukturen in den Subtomogramm-Durchschnitt können atomare Modelle von Protein-Komplexen in ihrem nativen Milieu rekonstruiert werden, wie hier gezeigt.

In diesem Beispiel können durchschnittliche Volumina wieder in den Tomo Graham eingefügt werden, um die Organisation einzelner Komplexe untereinander und gegenüber anderen Protein-Komplexen in der Membran zu unterstützen. Unser Protokoll zeigt, wie Sie die Elektronen-Kryo-Tomographie verwenden können, um die Struktur und Organisation von Protein-Komplexen in der inneren mitochondrialen Membran zu bestimmen. Dieses Protokoll kann ebenfalls verwendet werden, um die Struktur und Organisation anderer membranständiger Proteine in verschiedenen zellulären Kompartimenten zu analysieren.

Die Probenvorbereitung ist entscheidend für die Aufnahme guter Thermogramme. Das gefrorene, hydratisierte Gitter muss vollständig vitrifizierte Bereiche mit einer Dicke von 70 bis 150 Nanometern aufweisen. Üblicherweise untersuchen wir fünf bis sechs Gitter, bis ein Bereich mit optimaler Eisdicke und Probengüte gefunden ist.

Für die Sammlung von Tomogrammen ist ein Transmissionselektronenmikroskop mit 300 Kilovolt, einer dedizierten Kryo-Stage, einem Energiefilter und einer Kamera mit direktem Elektronendetektor am besten geeignet, jedoch kann auch ein Gerät mit 200 Kilovolt, einer seitlichen Kryo-Stage und einer CCD-Kamera verwendet werden. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Kryo-EM-Gitter präpariert, eine Kippserie aufnimmt, das Tomogramm rekonstruiert und einen Subtomogramm-Durchschnitt berechnet.

Dies sind die grundlegenden Fähigkeiten, die erforderlich sind, um zu untersuchen, wie die Organisation von Proteinen in einer Zelle die Fähigkeit dieser Zelle beeinflusst, biologische Funktionen wie die effiziente ATP-Synthese auszuführen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit flüssigem Stickstoff und flüssigem Ethan sehr gefährlich sein kann, weshalb Sicherheitsbrille und Handschuhe stets getragen werden sollten.