Festphasensynthese eines funktionalisierten Bis-Peptids unter Verwendung von "Safety-Catch"-Methodik

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Synthese eines funktionalisierten BSP-Peptids unter Verwendung von Festphasentechniken. Dies wird erreicht, indem eine geschützte BIS-Aminosäure auf Hydroxyethylbenzoesäureharz geladen wird. Dann werden tiefe Schutzkupplungszyklen wiederholt, um funktionalisierte Bis-Aminosäuren zu binden, ein Prozess, der das BIS-Peptid verlängert und die gewünschte Funktionalität zeigt.

Schließlich wird die erste Bis-Aminosäure mit einer Alpha-Aminosäure modifiziert, um das BIS-Peptid durch DI-Keto-Pyrazin-Bildung vom Harz abzuspalten. Es werden Ergebnisse erzielt, die die erfolgreiche Synthese eines funktionalisierten BSP-Peptids in guter Rohreinheit und konsistenten isolierten Ausbeuten von ca. 10% auf der Grundlage der flüssigkeitschromatographischen Massenspektrometrie zeigen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Parallel- und Bibliothekssynthese von Bis-Peptiden, da die BIS-Peptide auf einem festen Harz assembliert werden, das leichter manipulierbar ist als Reaktionen in Lösung und Nebenprodukte lassen sich leicht durch Filtration entfernen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da viele der Schritte schwer zu erlernen sind, da viele wichtige Details erforderlich sind, um sicherzustellen, dass alle Reaktionen so nah wie möglich an den Abschluss herankommen. Bei der Festphasensynthese gibt es keine Möglichkeit, Zwischenprodukte zu reinigen. Um ein sauberes Endprodukt zu erhalten, muss jede Reaktion so weit wie möglich vorangetrieben werden.

Wir empfehlen, eine Checkliste mit experimentellen Verfahren zu erstellen, um Verwirrung zu vermeiden, da sich die Schritte wiederholen. Dieses Protokoll beginnt mit der Beladung des ersten BSP-Peptids, dem Schutz des ersten BSP-Peptids und der gleichzeitigen Harzüberdeckung. Zu Beginn wird das erste BSP-Peptid durch Wiegen von 114 Milligramm H-M-B-A-A-Harz in ein acht Milliliter Reaktionsgefäß geladen und mit einem magnetischen Rührstab versehen.

Verschließen Sie den Deckel des Gefäßes mit dem Gummiseptum und spülen Sie das Röhrchen mindestens fünf Minuten lang mit Argonnen aus. In der Zwischenzeit bereiten Sie die aktivierte BIS-Aminosäurelösung vor, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Zu diesem Video die Lösung über eine Spritze in das Reaktionsgefäß überführen und am nächsten Tag über Nacht unter Argonne rühren, das Septum entfernen und das Reaktionsgemisch abtropfen lassen.

Waschen Sie das Harz, indem Sie dem Harz etwa zwei Milliliter Chlormethan hinzufügen. 30 Sekunden bis eine Minute rühren und dann abtropfen lassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal mit DCM und waschen Sie das Harz dann fünfmal mit Dimethylformamid.

Um einen tiefen Schutz der ersten Bis-Aminosäure und eine gleichzeitige Harzüberdachung durchzuführen, geben Sie langsam zwei Milliliter einer Lösung aus 33%igem Bromwasserstoff in Essigsäure und DCM in das Reaktionsgefäß. Lassen Sie das Harz 15 Minuten lang rühren, nachdem Sie es abgetropft und fünfmal in DCM gewaschen haben. Wiederholen Sie die Schutzsequenz D noch einmal.

Als nächstes waschen Sie das Harz fünfmal in DCM, gefolgt von fünfmal in DMF, neutralisieren Sie das Harz, indem Sie es zweimal mit der Volumenlösung D-I-P-E-A von 5 % Volumen in DMF waschen. Dann waschen Sie sich fünfmal mit DCM und noch einmal fünfmal mit DMF. Nun kann die Kopplung der geschützten funktionalisierten Bis-Aminosäure durchgeführt werden.

Zuerst wird das harzhaltige Reaktionsgefäß wieder einer inerten Atmosphäre zugeführt, indem es dreimal mit wasserfreiem DCM gewaschen wird. Bringen Sie dann ein Septum und eine Argonnenleitung an und waschen Sie das Gefäß, indem Sie ein bis zwei Milliliter wasserfreies DCM hinzufügen und 30 Sekunden lang umrühren. Lassen Sie dann das Gefäß ab, bis der Blasen der Argonnenlinie zu steigen beginnt.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens noch einmal. Als nächstes bereiten Sie eine Lösung aus funktionalisierter Bis-Aminosäure in einem flammgetrockneten Reagenzglas unter Argonnenatmosphäre vor. 47 Mikroliter DIC dazugeben und 90 Minuten rühren.

Geben Sie dann 35 Mikroliter D-I-P-E-A in 666 Mikroliter und hydrus DMF zum Harz und rühren Sie weitere fünf Minuten lang. Übertragen Sie die voraktivierte BIS-Aminosäurelösung per Spritze in das Gefäß und rühren Sie am nächsten Tag über Nacht um. Lassen Sie das Reaktionsgemisch ab und waschen Sie es zweimal mit wasserfreiem DCM, während Sie sich unter Argon befinden.

Ein kritischer Schritt in diesem Verfahren sind die biz-Aminosäure-Kupplungen. Um di keto piperazine Ringverschlüsse zu gewährleisten, setzen wir längere Reaktionszeiten mit zusätzlichen Aktivierungsmitteln ein. Um den Verschluss des Di-Keto-Pyrazins zu fördern, fügen Sie eine HOAT- und DIC-Lösung hinzu und rühren Sie eine Stunde lang unter Argon.

Entfernen Sie anschließend das Septum und lassen Sie das Reaktionsgemisch abtropfen. Waschen Sie das Harz fünfmal mit DCM und fünfmal mit DMF. Dieser Abschnitt befasst sich mit dem Tiefenschutz der funktionalisierten BIS-Aminosäure, dem Tiefenschutz von F moc und der Acylierung der ersten BIS-Aminosäure.

Um einen tiefen Schutz der geschützten funktionalisierten Bis-Aminosäure zu erreichen, geben Sie langsam zwei Milliliter einer Lösung aus TFA und TIPS in das Reaktionsgefäß und rühren Sie nach dem Abtropfen eine Stunde lang um, waschen Sie das Harz etwa 30 Sekunden lang mit DCM und lassen Sie dann die DCM-Wäsche fünfmal abtropfen. Wiederholen Sie dann die gesamte Waschsequenz des Tiefenschutzharzes nach der A-D-C-M-D-M-F-Wäsche. Neutralisieren Sie das Harz, indem Sie es zweimal mit einer Volumenlösung von 5 Vol.-% D-I-P-E-A in DMF waschen.

Führen Sie dann eine weitere D-C-M-D-M-F-Wäsche durch. Von hier aus kann das BIS-Peptid mit anderen funktionalisierten Bis-Aminosäuren elongiert oder auf der führenden Stickstoffcarbonsäure oder beidem funktionalisiert werden. Um die FM-Gruppe zu schützen, fügen Sie eine zwei Milliliter schwere Lösung aus 20 % Pfeifenparidin in DMF hinzu und mischen Sie die Reaktion 20 Minuten lang.

Lassen Sie das Harz abtropfen und waschen Sie es fünfmal in DMF. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach einer weiteren Wäsche des Harzes noch einmal. Man isoliert die erste Bis-Aminosäure, indem man die vorbereitete Aminosäurelösung in das Reaktionsgefäß gibt und als letzten Schritt sechs Stunden lang rührt.

Waschen Sie das Harz fünfmal mit DCM und fünfmal mit DMF. Der letzte Teil dieses Protokolls umfasst die Entfernung der Bach-Gruppe aus der harzgebundenen Aminosäure und die Spaltung aus dem Harz. Geben Sie zunächst zwei Milliliter einer Eins-zu-Eins-Lösung T-F-A-D-C-M in das Reaktionsgefäß und rühren Sie 30 Minuten lang.

Lassen Sie das Harz abtropfen und waschen Sie es fünfmal in DCM. Wiederholen Sie diesen Vorgang dann noch einmal. Waschen und abtropfen Sie das Harz 30 Sekunden lang, fünfmal mit DCM und fünfmal mit DMF.

Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter einer Lösung von 10%igem D-I-P-E-A in wasserfreiem DMF hinzu und rühren Sie 24 bis 48 Stunden lang. Zum Schluss wird das Reaktionsgemisch in einen vorgewogenen Rundkolben gegeben. Übertragen Sie 30 Mikroliter dieser Lösung auf 450 Mikroliter Tetra Hydro FU in einer lc-MS-Datei und senden Sie sie zur Analyse.

Das Harz wird mit zusätzlichen TMF-Aliquoten gewaschen und in den Rundkolben gegeben. Die folgenden Methoden können verwendet werden, um chemische Umwandlungen des Harzes während der gesamten Synthese zu überwachen. Um freie Hydroxylgruppen nachzuweisen, führen Sie den Methylrottest durch, indem Sie zunächst etwa ein Milligramm trockenes Harz mit einer Einwegpipette entfernen.

Spülen Sie es in ein vier Milliliter fassendes Reaktionsgefäß. Fügen Sie eine Methylrotlösung hinzu, die wie im Text beschrieben zubereitet wurde, und rühren Sie fünf bis 10 Minuten lang. Lassen Sie das Harz abtropfen und waschen Sie es fünfmal mit orangefarbenen oder roten DCM-Harzperlen, die auf das Vorhandensein von freien Hydroxylgruppen hinweisen.

Dieser Test kann verwendet werden, um die Belastung der ersten Schritte zum Verschließen von Bis-Aminosäuren und Harzen zu beurteilen. Um sekundäre Mittelwerte nachzuweisen, führen Sie den Chloraltest durch, indem Sie etwa ein Milligramm trockenes Harz mit einer Einwegpipette in ein kleines Fläschchen überführen. Fügen Sie drei Tropfen von 0,8 millimolarem Chloral in DMF-Lösung und 2% saurem Aldehyd in DMF-Lösung hinzu.

Und lassen Sie uns fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen. In diesem Fall sind blaue oder violette Harzkügelchen ein Hinweis darauf, dass freie Sekundärmittel auf der harzgebundenen Verbindung vorhanden sind. Um die Aktivierungseffizienz zu bestätigen, führen Sie den Aktivierungsfallentest durch: Die aktivierte Verbindung kann während der Synthese beurteilt werden, indem fünf bis 10 Mikroliter der aktivierten Lösung in ein Flüssigchromatographie-Massenspektrometriefläschchen mit 50 Mikrolitern Olain gegeben und von Hand gemischt werden.

Die Lösung sollte einige Sekunden lang gelb werden, dann mit 450 Mikrolitern Tetrahydro-Uran verdünnt und zur lc-MS-Analyse vorgelegt werden. Das Endprodukt und die aktivierten Zwischenprodukte können mit einem LCM S-System bewertet werden, das mit einer C 18-Umkehrphasensäule und einem Lösungsmittelsystem aus Wasseracetylnitril und 0,1 % Ameisensäure ausgestattet ist. Diese L-C-M-S-U-V-Spur ist ein Beispiel für die gute Reinheit des Rohprodukts.

Der größte Peak im Spektrum, der bei 21,3 Minuten gefunden wurde, weist eine Maske auf, die mit der erwarteten Produktmasse übereinstimmt. Dies kann im Massenspektrum des Rohprodukts visualisiert werden, wobei der Peak große Peaks zeigt, die der Masse plus der Masse des Natriumions entsprechen, sowie die Masse minus der Masse der IV-DDE-Schutzgruppe. Hier ist die LCMS-UV-Spur der gereinigten Spektren zu sehen, die ein sehr reines Produkt nach 21,3 Minuten zeigt, und das Massenspektrum, das die Identität dieses gereinigten Trier-Peaks bestätigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie feste Gesichtstechniken zur Synthese funktionalisierter Bis-Peptide nach ihrer Entwicklung verwenden können. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der biz-Peptide, um Anwendungen in Protein-Protein-Wechselwirkungen und der Katalyse zu erforschen. Diese Technik kann bei richtiger Durchführung zur Synthese eines funktionalisierten biz-Peptidtrimers in vier bis fünf Tagen führen.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Kügelchen in die Reaktions- und Waschlösungen einzutauchen. Andere Methoden wie Parallel- oder Bibliothekssynthese können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Wirkung der Stereochemie oder alternativer Funktionalitäten auf die Proteinbindung oder katalytische Aktivität zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Reagenzien äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und eines Abzugs getroffen werden sollten.