Visuell evozierten Potential-Aufnahme in einem Rattenmodell für Experimentelle Optic Nerve Demyelinisierung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Demyelinisierung im Sehnerv in vivo zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zuerst Mikroelektroden über dem visuellen Kortex implantiert werden. Im zweiten Schritt wird Lyin in den Sehnerv mikroinjiziert, was eine fokale Läsion mit Demyelinisierung hervorruft.

Danach können visuell evozierte Potenzialaufnahmen durchgeführt werden. Abschließend zeigt die Regressionsanalyse eine starke lineare Korrelation zwischen der Latenzverzögerung des visuell evozierten Potenzials und dem Volumen. Dieses Video wird unsere Technik zur Ableitung visuell evozierter Potenziale von Ratten demonstrieren.

Mithilfe implantierten Schädelelektroden werden wir außerdem eine Technik zur fokalen Demyelinisierung des Sehnervs mittels Mikroinjektion demonstrieren. Alle Experimente werden hier in unserem Labor an der Fakultät für Medizin der Macquarie University durchgeführt. Die Technik wird von Nitin Chichi, unserem Doktoranden, vorgeführt. Beginnen Sie damit, eine erwachsene Ratte, die älter als 12 Wochen ist, vor der Operation durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin zu anästhesieren.

Überprüfen Sie das Fehlen von Withdrawal-Reflexen. Seien Sie bereit, bei Bedarf 10%-Dosen Ketamin zu verabreichen, um eventuelle Reflexe zu behandeln, die während der Operation zum Tier zurückkehren könnten. Rasieren Sie anschließend die Haut an der Operationsstelle und legen Sie das Tier zur Vervollständigung der Vorbereitungen auf eine Wärmeunterlage.

Reinigen Sie die Haut mit Povidon-Iod, legen Sie das Tier ab und tragen Sie einen Augensalbe auf. Achten Sie außerdem darauf, die Asepsis durch die Verwendung steriler Instrumente aufrechtzuerhalten. Um die Operation zu beginnen, führen Sie einen longitudinalen Hautschnitt entlang der Mittellinie des Kopfes durch.

Danach das Bindegewebe entfernen, um eine gute Sicht auf den Schädel zu erhalten. Anschließend mit einem mikrochirurgischen Handbohrer vorsichtig kleine Bohrlöcher setzen, sieben Millimeter hinter dem bgma und drei Millimeter seitlich zur Mittellinie. Schraubelektroden durch den Schädel und etwa 0,5 Millimeter in die Hirnrinde einsetzen.

Dann implantieren Sie eine Referenzschraubenelektrode auf der Mittellinie, drei Millimeter rostral zum bgma, wie erforderlich. Tragen Sie Zement auf, um die Schraubenelektroden einzukapseln und zu fixieren. Schließen Sie zuletzt die Haut mit einer Naht.

Die Elektroden können freiliegen gelassen werden, sodass die Haut bei jeder Ableitung nicht erneut geöffnet werden muss. Verabreichen Sie nun schnell ein nicht-steroidales entzündungshemmendes Medikament oder NSAR beziehungsweise ein opioides Analgetikum, bevor sich das Tier von der Anästhesie erholt. Behandeln Sie abschließend die Haut mit einer antibiotischen Salbe.

Stellen Sie das Tier in einen Wiederaufnahmekäfig mit einer Wärmematte und überwachen Sie es kontinuierlich, bis es vollständig bewegungsfähig ist. Anschließend sollte es mindestens eine Woche lang zur Erholung Zeit erhalten. Vor der Ableitung von VEP bereiten Sie das Tier wie zuvor beschrieben für die Operation vor und führen einen ein bis 1,5 cm langen Hautschnitt über dem Orbita des Auges durch, indem Sie mit feinen Iris-Scheren arbeiten.

Öffnen Sie das subkutane Gewebe und gelangen Sie zur Augenhöhle. Öffnen Sie dann unter dem Stereomikroskop die Bindehaut und die vordere Sehnenscheide. Danach ziehen Sie die Augenmuskeln und die intraorbitalen Tränendrüsen zurück.

Um etwa drei Millimeter des Sehnervs um den Sehnerv freizulegen, öffnen Sie mit einem Augenchirurgie-Messer die Dura- und Arachnoidea-Schichten longitudinal. Führen Sie dann eine mit einer Hamilton-Spritze verbundene Glas-Mikropipette zwei Millimeter hinter der Bulbusgegend in den Nerv ein. Injizieren Sie über einen Zeitraum von 30 Sekunden einen Bolus aus Lyin mit Farbstoff, um den Vorgang abzuschließen.

Nähen Sie den Hautschnitt. Tragen Sie antibiotische Salbe auf, um eine Infektion zu verhindern. Bringen Sie das Tier auf eine Wärmematte und überwachen Sie es, bis es sich erholt hat.

Nach der Anästhesie des Tieres und der Vorbereitung der Haut wie zuvor beschrieben, bringen Sie es in einen dunklen Raum. Halten Sie die Körpertemperatur innerhalb eines halben Grades von 37 Grad Celsius mithilfe eines homöothermen Deckensystems und einer Temperatursonde aufrecht, während das Tier im Dunkeln überwacht wird. Akklimatisieren Sie das Tier fünf bis 30 Minuten lang.

Nach einer halben Stunde weiten Sie die Pupillen mit 1 % Tropicamid-Augentropfen. Anschließend öffnen Sie mit einer Schere und einer Pinzette die Haut über dem Schädel und greifen auf die vorab platzierten NC-Zwei-Schrauben-Elektroden zu.

Verbinden Sie die Schrauben mit dem Impedanzmessgerät. Messen und halten Sie die Elektrodenimpedanz dann unter fünf Kilohm. Verbinden Sie nun die Schraube über dem kontralateralen visuellen Kortex des stimulierten Auges.

Als Nächstes führen Sie eine Nadelelektrode in den Schwanz ein, um die Erdung herzustellen. Platzieren Sie nun einen kalibrierten Mini-Ganzfeld-Stimulator auf der Haut um die Augenlider, um die Augenisolation zu verbessern. Anschließend führen Sie eine photische Stimulation mit 100 Lichtblitzen bei einem Hertz durch, wobei ein Tiefpassfilter bei einem Hertz und der Hochpass verwendet wird.

Bei 100 Hertz filtern. Nach Abschluss die Haut vernähen und das Tier zur Erholung von der Anästhesie auf einer Wärmematte liegen lassen. Wiederholte Ableitungen, von mehreren pro Woche bis zu einer alle paar Wochen, sind durchführbar.

Bei Interposition zeigen VEP-Ableitungen eine signifikante Verzögerung der N1-Latenz. Nach der Injektion in den Sehnerv wurden täglich Ableitungen durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit zu belegen. Teilweise konnten im Sehnerv durch Demyelinisierung bedingte Läsionen in Gewebeschnitten, die mit Luxol Fast Blue gefärbt wurden, beobachtet werden.

Nach der Messung des Läsionsvolumens zeigte sich eine Korrelation zwischen der Latenzverzögerung und der Größe der Läsion. Diese Technik kann verwendet werden, um Läsionen im Sehnerv zu erzeugen und diese mit Veränderungen im VP zu korrelieren; sie kann als Modell einer fokalen Demyelinisierung dienen. Da die induzierte Läsionsgröße recht variabel ist, ist es wichtig, die Veränderungen histologisch zu korrelieren.