Name: Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektion in das Gehirn wacher Nagetiere, um molekulare Substrate von Verhalten und psychiatrischen Störungen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht präzise Reagenzienlieferung für die Verhaltensneurowissenschaft.

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MSB wird unterstützt von der Alcohol Beverage Medical Research Foundation, einem Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), den National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537) und Startkapitalern, die vom Virginia Higher Education Equipment Trust Fund und der VCU School of Medicine bereitgestellt werden.

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Keiner der Autoren hat konkurrierende oder widersprüchliche Interessen.

Das hier vorgestellte Verfahren ist ein effizientes Mittel, um die Mikroinjektion Kanülen und Mikroinjektoren, die bei der Aufklärung der molekularen Substrate motivierten Verhaltens helfen werden zu fertigen. Diese Methode bietet mehrere Vorteile. Erstens, durch die Herstellung der eigenen Implantate und Mikroinjektoren, neuartige experimentelle Parameter können schnell optimiert werden, dh, braucht man nicht, um maßgeschneiderte Komponenten warten. Zweitens aufgrund des kleinen Durchmessers der Kanüle mehr Kanülen können gleichzeitig implantiert werden. Dies verkürzt die erforderliche Operationszeit, die Überlebensfähigkeit verbessern kann, und ermöglicht auch mehrere Implantate pro Tier. Drittens, die verwendet werden, die operanten Kammern steuern Software leicht aufnimmt Stufensprung Pläne, da ein festes Verhältnis Paradigma kann schnell auf eine progressive Verhältnis Paradigma, indem einfach ein Ereignis Gangsparameterliste, die die gewünschte Verstärkungsschema enthält umgewandelt werden. Seinim Großen und Ganzen nützlich, wurde ein generischer Mikroinjektionsverfahren vorgestellt, die breit anwendbar für die Mikroinjektion von nahezu jedem Reagenz zur Zeit zur Verfügung stehen soll. Daher erwarten wir, dass diese Technik wird auch weiterhin von ähnlichen hohen Nutzen in der Zukunft mit geringen Modifikationen sein. Indem nur einige Variablen, kann dieser Ansatz auf eine große Anzahl von Reagenzien angewendet werden. Parameter, die am häufigsten betätigt werden würde, sind die Länge, die der Mikroinjektor ragt aus der Kanüle, Injektionsvolumen und die Geschwindigkeit der Injektion. Beispielsweise kann gewünscht sein, um die Einspritzvorrichtung weiter von der Kanülenspitze vorstehen, um die Glianarbe die typischerweise bildet sich um chronische Implantate zu vermeiden. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, ein größeres Volumen zu injizieren. Für Striatum Virus Mikroinjektionen wird ein Volumen von 1 &amp; mgr; l der Regel verwendet, und dieses Volumen wird in der Regel über einen längeren Zeitraum eingespritzt (häufig 7-10 min plus 3 - 10 min zusätzliche Diffusionszeit) im Vergleich zu dem Einsatzd für die pharmakologische Reagenzien (in der Regel 0,3 bis 0,5 &amp; mgr; l mehr als 2 - 3 Minuten plus 1 - 3 Minuten zusätzliche Diffusionszeit). Der Benutzer sollte die Literatur zu konsultieren und / oder empirisch ermitteln, die am besten für ihre Bedürfnisse Parameter. Unabhängig davon ist der Erfolg dieses Verfahrens kritisch abhängig von 4 Variablen: 1) Kanülenlänge, 2) Mikroinjektor Länge, 3) Qualität der Mikroinjektor Sprühbild, und 4) die Integrität des Systems vor der Injektion. Weil die Mikroinjektion Lage ist abhängig von der Tiefe, die der Mikroinjektor ragt aus der Kanüle, ist es zwingend notwendig, dass beide Kanülen (Schritt 1.2.8) und Mikroinjektor Länge (post-Biege, Schritt 2.2.1) beide genau bekannt und einheitlich zwischen allen Fächern . Dies kann leicht durch leicht Ablehnung jeder implementieren, die nicht die erforderliche Länge an der letzten Nachmessen gesteuert werden. Darüber hinaus kann der Einspritzstelle lediglich vorhergesagt werden kann, wenn sie auftritt unmittelbar unterhalb der Führungskanüle. So jede Mikroinjektor dass does nicht einen langen, feinen Strahl auf Testspray (Schritte 2.4.6) ist abzulehnen. Ein Qualitäts Einspritzung wird auch auf die Integrität des Systems vor der Injektion zusammen. Wenn nach der Abgabe das gesamte Wasser aus dem Injektor (vor dem Füllen mit Reagenz) mehrere Punkte auf dem Lab-wischen beobachtet, dann muss ein Leck behoben werden (Hinweis zu Schritt 2.4.8). Ferner, wenn die Blase (Schritt 2.4.9), die das Medikament aus dem Wasser in dem PE20 Schlauch trennt, ist nicht eine, einzige Blase (nach dem Füllen der Mikroinjektorkopf mit Reagenz), dann wird das Einspritzventil teilweise verstopft. Diese verstopfen könnte entweder verhindern oder umleiten die Injektion. Auch dies kann leicht behoben werden (Hinweis auf Schritt 2.4.8). Sollte man wünschen, microinject während sich das Tier in den stereotaktischen Rahmen gibt es drei Möglichkeiten. Zunächst könnte man die Länge der Mikroinjektor Kragens, so daß er fest von dem stereotaktischen Manipulator gehalten und erstrecken sich weit genug, um den Anschluss an PE20 Schlauch erlauben erhöhen. Zweitens aufE könnte zeitlich implantieren eine Kanüle und verwenden Sie die Standard Mikroinjektor hier vorgestellt. Drittens, eine gezeichnete und polierten Glaspipetten verwenden. 16,17 Eine erhebliche Einschränkung der hier vorgestellten Verfahren ist, dass es am besten in gut gehandhabt Ratten, die mit dem Verfahren vertraut sind, durchgeführt. Ratten für den im Ergebnisteil beschriebenen Daten verwendet wird, benötigt keine speziellen Handhabungsverfahren, weil die gleiche Sucher gehandhabt die Ratten täglich für mehr als 2 Monate. Dies beinhaltete tägliche Beobachtung und Manipulation des chirurgischen Implantats für mindestens 2 Wochen. Jedoch können Ratten rasch durch eine Anzahl von Techniken, die vor dem Vorimpuls-Hemmtest verwendet werden, die durch Stress beeinflusst werden kann gewöhnt werden. Diese speziellen Gewöhnung Techniken wurden gut vorher beschrieben. 43 Zusätzlich zu diesen Verfahren ist es ratsam, dass Ratten, die Mikroinjektion Verfahren, bei dem verkürzte Mikroinjektoren verwendet du gewöhnt werdenRing &#39;Schein&#39; Injektionen. Während dieser Scheininjektionen ist es kritisch, daß der Mikroinjektor, um Gewebeschäden zu begrenzen nicht in das Gewebe hineinragen. Mit anderen Worten sollte der Mikroinjektor nicht mehr als 14 mm gebogen werden. Somit könnte die gründliche Gewöhnung für eine optimale Implementierung dieser Technik benötigt als Einschränkung betrachtet werden. Während mehrere Verhaltensparadigmen existieren, um die Motivation zu messen, wird der Stufensprung häufig verwendet, um den Aufwand, die Gegenstand bereit ist, auszuüben, um einen Verstärker quantifizieren. Die fortschreitende Verhältnis Paradigma erzeugt eine Maßnahme als Haltepunkt bekannt, die oft als die maximale Anzahl von Hebelpressen in der letzten abgeschlossen Verhältnis definiert ist;.. Dh maximale reagiert, dass generiert einen Verstärker 21 der Stufensprung ist es, Stärke Verstärker empfindlich. Beispielsweise höhere Kokain (oder Saccharose) Dosen produzieren eine höhere Haltepunkt und unteren Kokain (oder Saccharose) Dosen ergeben eine niedrigere breakpunkt. 21,22 Dementsprechend ist Haltepunkt ein routinemäßig verwendet Proxy für die Motivation und / oder Verstärkungs Wirksamkeit. 21,23-26 Da die Absicht der Haltepunkt ist, um zu bestimmen, wenn das Tier nicht mehr reagiert, ein wichtiger Parameter, der fortschreitenden Verhältnis Paradigma Sitzungslänge. Finite-Sitzung Längen können eine falsche Mütze auf Breakpoint-Werte setzen und dies kann durch Vorbehandlungen, die abnorm die Rate der Selbstverwaltung oder dieser Erhöhung post-Verstärkung Pausieren verringern verstärkt werden. . Dieses verwechseln kann durch eine beliebige Anzahl von Ansätzen überwunden werden;. B. Sitzungen, die beendet wird, wenn das Tier zurückgehalten reagieren mit einem Vielfachen der durchschnittlichen Zwischeninfusionsintervall 44 A häufiger angewendet Variante dieses Ansatzes besteht darin, Sitzungen einmal beenden reagiert hat durch eine empirisch ermittelte Wert, der über Themen konstant gehalten wird einbehalten. Wir haben die Methode, diesen Ansatz in Schritt 4.4.9.11 gelten vorgesehen.

Nagetiere und Menschen reagieren auf bemerkenswert ähnliche Weise auf verhaltensrelevante Reize1-3. Dies deutet darauf hin, dass Nagetiere geeignete Probanden sind, um die molekularen Substrate des Verhaltens und komplexer psychiatrischer Erkrankungen aufzuklären4. Um die molekularen Substrate komplexer Verhaltensprozesse, wie z. B. der Motivation, zu verstehen, ist häufig eine Mikroinjektion des Gehirns erforderlich. Sowohl die Mikroinjektionstechnik des Gehirns als auch ein primärer Motivationsassay werden hier vorgestellt. Als Versuchspersonen werden Ratten verwendet, aber diese Verfahren können leicht an gut gehandhabte Mäuse angepasst werden. Hierin enthalten sind Verfahren zur Herstellung der erforderlichen Kanülen, Obturatoren (Dummy-Kanülen oder Stilette) und Mikroinjektoren. Das vorgestellte Verfahren ist deutlich flexibler und kostengünstiger als vorgefertigte Geräte. Diese Flexibilität wird sich bei der Optimierung der Bedingungen als wertvoll erweisen. Wichtig, weil das Mikroinjektionsverfahren verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Hypothesen zu testen; Die hier vorgestellten Techniken sollen breit anwendbar sein. Zum Beispiel können Rezeptorliganden mikroinjiziert werden, um die Neurochemie zu verstehen3,5,6; zellpermeable Peptide und kleine Moleküle können mikroinjiziert werden, um intrazelluläre Signalwegezu verstehen 7-10; Toxine, Ionenkanalblocker oder Antagonistencocktails können mikroinjiziert werden, um die Schaltkreise1,11,12 zu verstehen.
Während das hier vorgestellte generische Protokoll vom Benutzer leicht an seine speziellen Bedürfnisse angepasst werden kann, ist das Verfahren besonders gut für Verhaltenstests geeignet, da Mikroinjektionen bei wachen Nagetieren auftreten, die nur unter leichter Handfessel stehen. Es sind keine Anästhesie oder spezielle Fixierungen erforderlich. Dies ist möglich, weil dem Gehirn selbst das Schmerzempfinden fehlt. Wird jedoch keine Narkose angewendet, muss die Mikroinjektion durch Kanülen erfolgen, die zuvor stereotaktisch implantiert wurden. Dies liegt daran, dass Nozizeptoren auf der Kopfhaut vorhanden sind, die Hirnhäute13, die das Gehirn umgeben, und das Periost14, die den Schädel bedeckt. Es ist zu beachten, dass eine Mikroinjektion unter Narkose manchmal wünschenswert ist. Ein Beispiel ist, wenn das Virus injiziert wird und man das Virus direkt entweder durch Edelstahlnadeln15 oder Glaspipetten injizieren möchte, da dies Gewebeschäden reduzieren und die Transduktionseffizienz verbessern kann. 16,17 Die im Folgenden beschriebenen Mikroinjektoren können zu diesem Zweck modifiziert werden und Vorschläge dazu finden Sie in der Diskussion. Da andere JoVE-Artikel die stereotaktische Implantation von Hirnkanülen gezeigt haben,18-20 werden diese Verfahren hier nicht behandelt.
Wir präsentieren diese Mikroinjektionsverfahren zusammen mit einem Assay, der die Motivation quantifiziert. Mehrere Nagetiermodelle für motiviertes Verhalten sind derzeit im Einsatz, wie z. B. die Runway Box und die Barriereskalierung. Hier beschreiben wir, wie man einen operanten progressiven Verhältnis-Verstärkungsplan verwendet, um die Motivation zu quantifizieren, wenn die operante Reaktion durch einen Verstärker aufrechterhalten wird. Das Ansprechen auf das progressive Verhältnis reagiert auf die Größe des Verstärkers. 21,22 Dementsprechend wird dieser Assay routinemäßig als Proxy für die Motivation und/oder verstärkende Wirksamkeit verwendet. 21,23-30 Da mehrere ausgezeichnete Rezensionen dieses Thema ausführlich behandelt haben,21,24 werden wir uns hauptsächlich auf praktische Belange konzentrieren.

<table><tbody><tr><td>Kanülenschlauch</td><td>Amazon Supply/ Kleinteile</td><td>HTXX-26T-60</td><td>26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA</td></tr><tr><td>Obturator</td><td>Amazon Supply/ Kleinteile</td><td>GWXX-0080-30-05</td><td>33 Gauge, Draht S/S 316LVM 0,008 IN</td></tr><tr><td>Microinjector Wire</td><td>MicroGroup</td><td>33RW 304</td><td>33 Gauge</td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Loctite</td><td>3924AC</td><td>Flüssigkeit, nicht geliert, kann autoklaviert werden</td></tr><tr><td>Mikroinjektor Kunststoffschlauch</td><td>Becton Dickson</td><td>427406</td><td>PE20</td></tr><tr><td>Mittelschwere Hämostaten</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241-G</td><td></td></tr><tr><td>Lineal</td><td>Fisher</td><td>09-016</td><td>150 mm</td></tr><tr><td># 7 Pinzette</td><td>Stoelting</td><td>52100-77</td><td>Dumont, Dumostar</td></tr><tr><td>Rotationswerkzeug</td><td>Dremmel</td><td>285</td> Trennscheibe mit <td>zwei Geschwindigkeiten</td></tr><tr><td></td><td>McMaster Carr</td><td>3602</td><td>15/16" x 0,025"</td></tr> <tr><td>Mikroinjektionspumpe</td><td>Harvard Apparat</td><td>PhD 2000</td><td></td></tr><tr><td>1 ul Glasspritze</td><td>Hamilton</td><td>7001KH</td><td>Nadelstil: 25s / 2,75" / 3</td></tr><tr><td>Applikator mit Baumwollspitze</td><td>Fisher</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Labortücher</td><td>Kimwipes</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Operant Software</td><td>Coulbourn</td><td>Grafik Zustand</td><td></td></tr><tr><td>Operant Kammern</td><td>Coulborun</td><td>Habitest</td><td></td></tr></tbody></table>

nagetier gehirn-mikroinjektion, um molekulare substrate motiviertes verhalten studieren

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Gehirn-Mikroinjektion kann helfen, die molekularen Substrate komplexer Verhaltensweisen, wie z.B. Motivation, aufzuklären. Zu diesem Zweck können Nagetiere als geeignete Modelle dienen, unter anderem, weil die Reaktion auf verhaltensrelevante Reize und die Schaltkreise, die die Reiz-Handlungs-Ergebnisse analysieren, zwischen Menschen und Nagetieren erstaunlich ähnlich sind. Bei der Untersuchung molekularer Substrate komplexer Verhaltensweisen ist die Mikroinjektion von Reagenzien, die bestimmte Systeme modifizieren, verstärken oder zum Schweigen bringen, eine unschätzbare Technik. Es ist jedoch entscheidend, dass die Mikroinjektionsstelle genau anvisiert wird, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern. Wir stellen ein Verfahren zur Herstellung von chirurgischen Instrumenten und Mikroinjektionsnadeln vor, das eine genaue Mikroinjektion und unbegrenzte Anpassbarkeit bei minimalen Kosten ermöglicht. Wichtig ist, dass diese Technik bei wachen Nagetieren erfolgreich durchgeführt werden kann, wenn sie in Verbindung mit anderen JoVE-Artikeln durchgeführt wird, die die erforderlichen chirurgischen Eingriffe abdecken. Darüber hinaus gibt es viele Verhaltensparadigmen, die sich gut zur Messung der Motivation eignen. Das progressive Verhältnis ist eine häufig verwendete Methode, die die Wirksamkeit eines Verstärkers quantifiziert, um trotz eines (oft exponentiell steigenden) Arbeitsbedarfs die Reaktion aufrechtzuerhalten. Dieser Assay reagiert empfindlich auf die Größe des Verstärkers und pharmakologische Manipulationen, wodurch die verstärkende Wirksamkeit und/oder Motivation bestimmt werden kann. Wir stellen auch einen einfachen Ansatz zur Programmierung operanter Software vor, um einen progressiven Zeitplan für die Verhältnisverstärkung zu ermöglichen.

Hier veranschaulichen wir Beispiele der Ergebnisse, die mit dem obigen Verfahren erhalten werden können. Gezeigten ersten ist ein typischer Bereich, der durch virale Vektoren (Abbildung 3) transfiziert. Im allgemeinen wird eine transfizierte Volumen von ~ 1 mm 3 in Striatum-Gewebe erhalten. Das Volumen der transfizierten Bereich kann für Serienteile mit Cavalieri Methode quantifiziert werden 32 Wichtig ist, hängt die transfizierten Volumen von vielen Faktoren ab, wie der Art des Gewebes, transfiziert. viralen Serotyp; Promotor; Rate und das Volumen eingespritzt wird; Anzahl der Teilchen eingespritzt wird; Injektat pH; und ob hyperosmolaren Reagenzien, wie Mannit, wurden verwendet. 33,34 Typischerweise microinject wir 10 12 Partikel / ml, 1 ul / Seite über 10 min, und ermöglichen weitere 7 min vor dem Austausch Obturatoren. Zusätzlich ist das Injektat im allgemeinen etwa pH 8. Weiter wird gezeigt, dass die Motivation kann entweder durch transgene Expression manipuliert werden (Figur 4)oder pharmakologische Reagenz Mikroinjektion (Abbildung 5). In Abbildung 4, ausgedrückt wir einen Designer Receptor Exklusiv von Designer Drugs (DREADDs) aktiviert. Die DREADD Rezeptor-kodierende Region wurde von einem Internal Ribosome Entry Site und mCitrine Kassetten gefolgt. Die mCitrine erlaubt eine komfortable Visualisierung von transfizierten Zellen. Die DREADD wurde der heterotrimeren G-Protein-gekoppelten Gaq. Aktivierung des Gaq gekoppelten DREADD können Astrozyten 28,35 und DREADD selbst stimulieren kann durch systemische Verabreichung von Clozapin-N-oxid (CNO, 3 mg / kg, ip) aktiviert werden. 14,22,36 Ratten wurden trainiert Hebel reagieren für Ethanol Verstärkung, wo 3 Hebelpressen ergab 1 Chance, während der täglichen 1 Stunde Sitzungen mehr als 60 zusammenhängende Tage trinken. Als nächstes wurden die Ratten in Abstinenz gezwungen, und Gaq gekoppelten DREADDs wurden ausgedrückt in Nucleus accumbens Kern Astrozyten. Nach 3 Wochen der Abstinenz, die Motivation, Selbst admi<html> Nister Ethanol wurde durch Haltepunkt gemessen. 21,27-30 Aktivierung des Nucleus accumbens Kern Astrozyten über systemische CNO Verwaltung, verringert die Motivation von Ratten nach Enthaltsamkeit im Vergleich zu Vehikel, um Ethanol Selbstverwaltung wieder aufzunehmen. Wichtig ist, hatte CNO keine Wirkung in einer ebenso geschult Kohorte, die Green Fluorescent Protein anstelle des DREADD exprimiert, wurde. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig3.jpg" /> Figur 3. Repräsentative ventralen Striatum Region von mikroinjizierten Virus transfiziert. Dieses Bild stellt die Region des Nucleus accumbens Astrozyten, die durch Befolgen des obigen Verfahrens transfiziert wurden. Die Daten werden von Bull et al. 13 mit der Erlaubnis des Urheberrechtsinhabers nachgedruckt. Details finden Sie in der Veröffentlichung und dem zugehörigen Zusatzmaterial gefunden werden.blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig4.jpg" /> Abbildung 4. Motivation von Ratten selbst verwalten Ethanol wurde durch die Aktivierung eines Transgens, das überexprimiert im Nucleus accumbens Kern Astrozyten. Das Virus wurde mikroinjiziert und nach Berücksichtigung einer Woche für das Virus, um auszudrücken, Motivation über Haltepunkt gemessen wurde, reduziert. Das Transgen exprimiert wurde, eine Designer-Rezeptor Exklusiv von Designer Drugs (DREADDs) aktiviert. Ein Einweg-ANOVA (F (2,30) = 3,29, p = 0,04), gefolgt von einer Scheffé post-hoc ergab, dass die Aktivierung des DREADD durch systemische Verabreichung von Clozapin-N-oxid (CNO, 3 mg / kg, ip ) reduzierte signifikant die Motivation der Ratten, die Selbstadministration Ethanol nach Enthaltsamkeit im Vergleich zum Fahrzeug CNO keine Wirkung in einer ebenso geschult Kohorte, die Green Fluorescent Protein (GFP exprimiert, wurde hatte) anstelle der DREADD. Die Daten werden von Bull et al. 13 mit der Erlaubnis des Urheberrechtsinhabers nachgedruckt. Details finden Sie in der Veröffentlichung und dem zugehörigen Zusatzmaterial gefunden werden. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig5.jpg" /> Abbildung 5. Mikroinjektion von Gap Junction-Blocker erhöht die Motivation der Ratten, die selbst verabreichen Ethanol nach Abstinenz Zwei Gap Junction-Blocker wurden auf ihre Wirkung auf die Motivation (via Haltepunkt gemessen) von Ratten, die selbst verabreichen Ethanol bewertet:. Mefloquin und 18- alpha-Glycyrrhetinsäure (18-α). Ein Zwei-Wege ANOVA zeigte, dass Mikroinjektion von Gap-Junction-Blocker in den Nucleus accumbens Kern erhöht die Motivation des Ratten selbst verabreichen Ethanol nach Abstinenz (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Die Daten werden von Bull et al. 13 mit der Erlaubnis des Urheberrechtsinhabers nachgedruckt. Details finden Sie in der Veröffentlichung zu finden unddie begleitende Zusatzmaterial.

Nagetiere sind ein geeignetes Modell, um die molekularen Substrate von Verhalten und komplexen psychiatrischen Störungen zu untersuchen. Die Mikroinjektion des Gehirns bei wachen Nagetieren kann zur Aufklärung von Krankheitssubstraten verwendet werden. Es wird eine effiziente und anpassbare Mikroinjektionsmethode für das Gehirn sowie die Ausführung eines operanten Paradigmas vorgestellt, das die Motivation quantifiziert.

Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Kanüle und Mikroinjektoren präzise herzustellen sowie die Mikroinjektion korrekt durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kanüle auf die geeignete Länge hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Mikroinjektoren zu schneiden und zusammenzubauen.Bereiten Sie als Nächstes Mikroinjektoren, Schläuche und eine Pumpe für die Mikroinjektion vor. Der letzte Schritt besteht darin, die Mikroinjektion abzuschließen und eine Diffusionsphase verstreichen zu lassen. Letztendlich wird die Mikroinjektion verwendet, um Reagenzien präzise in die gewünschte Hirnregion zu injizieren, wobei die korrekte Handhabung gezeigt wird.Während der Mikroinjektion wird Ryan Poland, ein Student in meinem Labor, assistieren. Personen, die mit dieser Methode neu sind, werden in der Regel Schwierigkeiten haben, da besondere Sorgfalt erforderlich ist und alle Schritte große Aufmerksamkeit erfordern, um eine korrekte Kanülenplatzierung und Mikroinjektionsstelle sicherzustellen. Zunächst zeichnen Sie mit einem feinen Stift eine 15 Millimeter lange Referenzlinie auf das Klebeband.Verwenden Sie dies anschließend als Vorlage, um mit einem scharfen Permanentstift nacheinander 15 Millimeter lange Abschnitte auf dem Schlauch zu markieren. Danach ritzten Sie den Kanülschlauch, indem Sie ihn an die langsam rotierende Trennscheibe des Rotationstools führen. An den markierten Stellen drehen Sie die Kanüle um 180 Grad und ritzen die gegenüberliegende Seite des Schlauchs ein.Schneiden Sie den Schlauch nicht vollständig durch, da dies zu einer Okklusion führen könnte. Biegen Sie den Schlauch danach scharf, um ihn in 15 Millimeter lange Abschnitte zu zerbrechen. Halten Sie dann jedes Ende der Kanüle mit Daumen und Zeigefinger senkrecht zur Trennscheibe. Drehen Sie den Kanülschlauch, während Sie dessen Spitze an die Oberfläche der abgeschnittenen Scheibe anlegen, um eine stumpfe Spitze zu erzeugen. Weiten Sie anschließend beide Enden der Kanüle mit einer 26-Gauge-schräg geschliffenen Nadel auf, um sicherzustellen, dass alle Grate entfernt wurden und die Kanüle frei ist. Zum Vorbereiten des Obturators klemmen Sie eine Kanüle etwa in der Mitte mit mittelschweren geraden Hämorrhagieklemmen, und legen Sie die verschlossene Klemme so auf den Tisch, dass die Kanüle senkrecht zum Tisch steht.Danach führen Sie ein Ende des Ator-Drahts in die Kanüle ein, bis es die Arbeitsfläche erreicht. Biegen Sie den Draht durch Zusammendrücken mit den Fingern, bis ein Winkel von 30 Grad erreicht ist, wobei stets Kontakt zwischen dem Obturator und der Arbeitsfläche bestehen bleibt. Anschließend entfernen Sie den Draht aus der Kanüle und schneiden den überschüssigen Teil 2,5 Millimeter hinter der Biegung mit einer kleinen Seitenschneiderzange ab.Halten Sie bei diesem Verfahren ein Ende des Mikroinjektor-Schlauchs mit einer verriegelten geraden Hämostaseklemme senkrecht. Drehen Sie die Klemme, während Sie Zug auf den Schlauch ausüben, und wickeln Sie ihn mindestens einmal eng um die Klemme. Messen Sie anschließend 32 Millimeter vom gegenüberliegenden losen Ende des Mikroinjektor-Schlauchs ab und greifen Sie diese Stelle mit einer zweiten Hämostaseklemme senkrecht. Biegen Sie den Schlauch hin und her, während Sie die Spannung aufrechterhalten, bis er bricht. Prüfen Sie anschließend das Mikroinjektionsschlauchstück, um sicherzustellen, dass beide Enden gerade sind und der Innendurchmesser frei von Verstopfungen ist. Zeichnen Sie eine Fünf-Millimeter-Referenzlinie auf das Maßband und markieren Sie nacheinander Fünf-Millimeter-Abschnitte des Kanülenschlauchs mit einem Permanentstift.Berühren Sie anschließend das Kanülenrohr an den markierten Stellen mit der langsam rotierenden Trennscheibe, um das Rohr einzuritzen. Biegen Sie dann das Mikroinjektor-Hülsenrohr scharf, um es in Fünf-Millimeter-Abschnitte zu zerbrechen. Stecken Sie eine Hülse auf jedes Mikroinjektorrohr, jeweils etwa zwei Zentimeter vom Ende entfernt.Tragen Sie eine kleine Menge Sekundenkleber fünf Millimeter von einem Ende des Mikroinjektionsrohrs auf. Danach schieben Sie die Hülse über den Sekundenkleber, sodass sie sich einen Millimeter vom Ende des Mikroinjektionsrohrs entfernt befindet. Anschließend verschließen Sie beide Enden der Hülse mit Kleber.Befestigen Sie dann eine 26-Gauge-Nadel an der mit steriler Flüssigkeit gefüllten Ein-Milliliter-Spritze. Stecken Sie das acht Zentimeter lange Stück Mikroinjektor-Kunststoffschlauch auf die Nadel, wobei darauf zu achten ist, dass der Schlauch nicht durchstochen wird. Danach wird das andere Ende des Kunststoffschlauchs über das Halsende des trockenen Mikroinjektors geschoben. Drücken Sie den Kolben der mit Wasser gefüllten Spritze, um die Durchgängigkeit zu überprüfen. In diesem Schritt wird der fertige Mikroinjektor 15 Millimeter vom Ende gegenüber dem Halsende aus um 95 Grad gebogen.Schneiden Sie als Nächstes das Plastikrohr auf eine Länge von 70 Zentimetern zu und schieben Sie es über den Mikroinjektor-Kragen. Um die Pumpe für die Mikroinjektion vorzubereiten, stellen Sie den Durchmesser der Mikroinjektionsnadel, die gewünschte Infusionsgeschwindigkeit und das Zielinjektionsvolumen am Schlauch ein. Danach stellen Sie den Pumpmodus auf „Volumen“, sodass automatisch ein genaues Volumen abgegeben wird.Als Nächstes stellen Sie den Pumpenanschlag so ein, dass die Spritze auf das Injektionsvolumen plus zusätzliche 0,2 Mikroliter gefüllt werden kann. Tauchen Sie nun die Spitze der gastdichten Spritze in das sterile Wasser, das sich in einem kleinen Wannenboot befindet, und bewegen Sie den Kolben sanft hin und her, um den inneren Draht gleichmäßig zu schmieren. Ziehen Sie den Kolben bis zum Anschlag an der Pumpe, um die Mikroinjektionsnadel mit Wasser zu füllen.Nächste Folie. Die PE 20-Schläuche, die mit dem Mikroinjektor an eine 26-Gauge-Nadel angeschlossen sind, die an einer mit einem Milliliter steriler Wasser gefüllten Spritze befestigt ist. Sprühen Sie steriles Wasser durch den Mikroinjektor und überprüfen Sie das Sprühmuster und die Reichweite. Danach einen sterilisierten Mikroinjektor auf ein steriles Feld stellen. Das Schlauchstück von der Nadel abziehen, den Schlauch unterhalb des durch die Nadel beschädigten Bereichs abschneiden, wobei er aufrecht gehalten wird, um ein Heruntertropfen von Flüssigkeit zu verhindern. Anschließend den Kolben der Mikroinjektorspritze leicht nach vorne drücken, um einen Tropfen an der Nadelspitze zu bilden, und das mit Wasser gefüllte PE-20-Schlauchstück auf die Nadel aufschieben.Danach den Kolben vollständig nach vorne drücken, um die Probeaufgabe vorzubereiten, und sicherstellen, dass kein Spurenethanol mehr in der Mikroinjektionsspritze verbleibt. Überprüfen Sie die Einstellung auf Undichtigkeiten, indem Sie die an der Spitze der Mikroinjektionsspritze entstandene Wassertropfen mehrmals mit einem sauberen Laborabwischtüchlein berühren. Ziehen Sie danach den Spritzenkolben um 0,2 Mikroliter zurück, um eine Blase zwischen dem sterilen Wasser und dem PE-20-Schlauch sowie der zu injizierenden Lösung zu erzeugen.Danach das Mikroinjektionsgerät in das zu injizierende Reagenz geben und den Spritzenkolben langsam bis zum Anschlag nach hinten ziehen. Um das Tier für die Injektion vorzubereiten, halten Sie die Brust der Ratte gegen die Brust des Experimentators. Reinigen Sie den Bereich um die Kanüle mit einem mit Betadine getränkten Wattestäbchen.Desinfizieren Sie die Kopfkappe dreimal mit Betadine und anschließend zweimal mit Ethanol. Danach setzen Sie den gefüllten Mikroinjektor in die Kanüle ein. Drücken Sie auf Start an der Mikroinjektionspumpe und überwachen Sie die Blasenbewegung.Wenn die Injektion abgeschlossen ist, entfernen Sie den Mikroinjektor von der Kanüle und ersetzen Sie ihn durch einen Obturator. Diese Abbildung zeigt die Transfektion des Astrozytenbereichs im Nucleus accumbens mittels mikroinjiziertem Virus, und diese Abbildung zeigt die Verringerung der Motivation von Ratten, Ethanol selbst zu verabreichen, durch Aktivierung eines Transgens, das im Nucleus accumbens überexprimiert wurde. Die Aktivierung der Astrozyten im Kernbereich des Nucleus accumbens durch systemische Verabreichung von CNO verringerte die Motivation der Ratten, Ethanol nach einer Abstinenzphase selbst zu verabreichen, signifikant im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, die CNO ohne Wirkstoff erhielt und keinerlei Effekt zeigte, bei einer gleich trainierten Kohorte, die stattdessen GFP statt des DREADD-Transgens exprimierte.Diese Technik ermöglicht die Anfertigung maßgeschneiderter Instrumente für mikroinjektive Eingriffe im Gehirn und bietet eine zusätzliche Flexibilität bei experimentellen Verfahren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass der genaue Ort der Mikroinjektion entscheidend ist, um die gewünschte Wirkung zu erzielen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Die Überwachung der extrazellulären Neurotransmitter Ebenen in verschiedenen Hirnregionen der frei beweglichen Tieren bietet Einblicke über den Zusammenhang zwischen Neurotransmittern und Verhalten. In-vivo-Mikrodialyse mit elektrochemischer Detektion gekoppelt bietet eine hervorragende anatomische und chemische Auflösung, und Informationen darüber, wie basale Neurotransmission wird durch pharmakologische oder physiologische Manipulationen verändert.

Survivable stereotaktischen Chirurgie in Nagetiere

Quelle: Poland, R. et al. Mikroinjektion des Gehirns von Nagetieren zur Untersuchung molekularer Substrate motivierten Verhaltens. J. Vis. Exp. (2015)In diesem Video wird ein wassergefüllter Mikroinjektionsaufbau, bestehend aus einer Spritze und einem Mikroinjektorschlauch, für eine präzise Wirkstoffabgabe verwendet. Eine Ratte mit einer präimplantierten Führungskanüle wird einer gezielten Mikroinjektion im Gehirn unterzogen, die eine genaue Verabreichung von Therapeutika bei wachen Tieren mit...

Mikroinjektionsbasierte Verabreichung eines Therapeutikums in ein waches Nagetiergehirn

Dieses Protokoll beschreibt den Zusammenbau und die Verwendung einer Injektionsrode für die präzise Verabreichung von Medikamenten in gezielte Gehirnregionen einer anästhesierten Ratte, gefolgt von der Überwachung der neuronalen Aktivität durch aufgezeichnete elektrische Signale.

Wirkstoff-Mikroinjektion mit elektrophysiologischer Aufzeichnung in einem Rattengehirn

Quelle: Paolone, G., et al. Personalisierte Nadeln für Mikroinjektionen im Gehirn von Nagetieren. J. Vis. Exp. (2018).Dieses Video zeigt die Injektion einer Mikronadel in das Gehirn eines Nagetiers mit einer Quarz-Mikronadel mit Löchern. Die Mikronadel wird an einer Spritze und einer Mikropumpe befestigt, um die Fördermenge zu steuern. Die Nadel mit der Injektionslösung wird mit niedriger Einführgeschwindigkeit in das Gehirn eingeführt. Einmal positioniert, wird die Liefergeschwindigkeit erhöht.

Mikroinjektion des Gehirns von Nagetieren mit einer Quarz-Mikronadel

MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung...

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

Dieser Artikel beschreibt, wie man virale Vektoren in Mäusegehirn microinject und dann in einem konditionierten Platzpräferenz Paradigma, das eine Akquisition, Aussterben und Wiedereinstellung Phase umfasst testen.

Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren

Hier stellen wir eine Glaspipette mit doppelter Funktion her: Hemmung tiefer Hirnstrukturen durch Mikroinjektionen von Medikamenten und Echtzeitüberwachung ihrer Wirkung durch gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnungen.

Gleichzeitige Elektrophysiologische Aufzeichnung und Micro-Injektionen von Hemmstoffe im Gehirn von Nagetieren

Stereotaktische Injektion von Lentiviren ausdrücken cDNAs oder shRNAs die Genexpression in spezifischen Hirnarealen von Mäusen zu modulieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur stereotaktischen Injektionen mit Verhaltensaufgaben, wie der Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) zu kombinieren.

Anwenden Stereotaktische Injektionstechnik zu genetischen Auswirkungen auf die Tier Behaviors Studie

Dieses Verfahren beschreibt die Sammlung diskreter gefrorener Hirnregionen, um hochwertiges Protein und RNA mit kostengünstigen und allgemein verfügbaren Werkzeugen zu erhalten.

Sammlung von gefrorenen Nagetier-Hirnregionen für Downstream-Analysen

Hier wird ein stereotaktisches Verfahren beschrieben, das mit einem abgewinkelten koronalen Ansatz auf herausfordernde und schwer zugängliche Hirnregionen (aufgrund räumlicher Einschränkungen) abzielen kann. Dieses Protokoll ist sowohl an Maus- als auch an Rattenmodelle anpassbar und kann auf verschiedene neurowissenschaftliche Anwendungen angewendet werden, einschließlich Kanülenimplantation und Mikroinjektionen viraler Konstrukte.

Anpassbarer winkelster stereotaktischer Ansatz für vielseitige neurowissenschaftliche Techniken

Lernen Sie die Mikroinjektion in das Gehirn wacher Nagetiere, um molekulare Substrate von Verhalten und psychiatrischen Störungen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht präzise Reagenzienlieferung für die Verhaltensneurowissenschaft.

Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren

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