Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Kanüle und Mikroinjektoren genau herzustellen und die Mikroinjektion ordnungsgemäß durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kanüle auf eine entsprechende Länge hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, Mikroinjektoren zu schneiden und zusammenzubauen.

Bereiten Sie als Nächstes Mikroinjektoren, Schläuche und eine Pumpe für die Mikroinjektion vor. Der letzte Schritt besteht darin, die Mikroinjektion abzuschließen und eine Diffusionsphase verstreichen zu lassen. Letztendlich wird die Mikroinjektion verwendet, um Reagenzien genau in die gewünschte Gehirnregion zu injizieren, was die richtige Handhabung demonstriert.

Während der Mikroinjektion wird Ryan Poland, ein Student in meinem Labor, sein. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da besondere Sorgfalt geboten ist und alle Schritte große Aufmerksamkeit erfordern, um die richtige Platzierung der Kanüle und die richtige Position der Mikroinjektion zu gewährleisten. Um die Kanüle vorzubereiten, zeichnen Sie zunächst mit einem feinen Stift eine 15 Millimeter große Referenzlinie auf das Band.

Verwenden Sie es dann als Anleitung, um die 15-Millimeter-Abschnitte nacheinander mit einem scharfen Permanentmarker auf dem Rohr zu markieren. Kerben Sie anschließend den Kanülenschlauch ein, indem Sie ihn mit der sich langsam drehenden Trennscheibe des rotierenden Werkzeugs berühren. Drehen Sie die Kanüle an den markierten Stellen um 180 Grad und kerben Sie die gegenüberliegende Seite des Schlauchs ein.

Schneiden Sie den Schlauch nicht vollständig durch, da dies zu Verstopfungen führen kann. Biegen Sie anschließend den Schlauch scharf, um ihn in 15-Millimeter-Abschnitte zu brechen. Halten Sie dann jedes Ende der Kanüle senkrecht zur Trennscheibe zwischen Daumen und Zeigefinger.

Drehen Sie den Kanülenschlauch, während Sie die Spitze mit der Oberfläche der Trennscheibe berühren, um eine stumpfe Spitze zu erzeugen. Reiben Sie anschließend beide Enden der Kanüle mit einer abgeschrägten 26-Gauge-Nadel auf, um sicherzustellen, dass alle Grate entfernt wurden und die Kanüle frei ist. Zur Vorbereitung des Obturators klemmen Sie eine Kanüle in etwa halber Länge mit mittelschweren geraden Hämostaten, legen Sie das verriegelte Hämostat so auf die Bank, dass die Kanüle senkrecht zur Bank steht.

Führen Sie dann ein Ende des Atordrahtes in die Kanüle ein, bis er die Bank erreicht. Biegen Sie den Draht, indem Sie ihn mit den Fingern einklemmen, bis ein Winkel von 30 Grad erreicht ist, während Sie den Kontakt zwischen dem Obturator und der Bank aufrechterhalten. Entfernen Sie danach den Draht von der Kanüle und schneiden Sie den überschüssigen Teil in 2,5 Millimetern Entfernung von der Biegung mit kleinen Seitenschneidern ab.

Halten Sie bei diesem Verfahren ein Ende des Mikroinjektorschlauchs senkrecht mit einem verriegelten geraden Hämostaten. Drehen Sie einen Hämostaten, während Sie die Spannung auf dem Schlauch halten, und wickeln Sie ihn mindestens einmal fest um den Hämostaten. Messen Sie anschließend 32 Millimeter vom gegenüberliegenden losen Ende des Mikroinjektorschlauchs ab und fassen Sie diesen Punkt senkrecht mit einem zweiten Hämostaten.

Biegen Sie den Schlauch hin und her und halten Sie dabei die Spannung, bis er reißt. Überprüfen Sie dann den Mikroinjektorschlauch, um sicherzustellen, dass beide Enden gerade sind und der Innendurchmesser frei ist. Zeichnen Sie eine fünf Millimeter lange Referenzlinie auf das Maßband und markieren Sie fünf Millimeter lange Abschnitte von Kanülenschläuchen nacheinander mit einem Permanentmarker.

Berühren Sie anschließend den Kanülenschlauch an den markierten Stellen mit der langsam drehenden Trennscheibe, um den Schlauch einzukerben. Biegen Sie dann den Schlauch des Mikroinjektorkragens scharf, um ihn in Fünf-Millimeter-Abschnitte zu brechen. Schieben Sie einen Kragen etwa zwei Zentimeter vom Ende entfernt auf jedes Mikroinjektorröhrchen.

Tragen Sie eine kleine Menge Sekundenkleber in einem Abstand von fünf Millimetern von einem Ende auf das Mikroinjektorröhrchen auf. Schieben Sie anschließend den Kragen über die Sekundenkleberraupe, so dass er einen Millimeter vom Ende des Mikroinjektionsschlauchs entfernt ist. Bedecken Sie danach beide Enden des Kragens mit Kleber.

Befestigen Sie dann eine 26-Gauge-Nadel an der Ein-Milliliter-Spritze, die mit sterilem Wasser gefüllt ist. Schieben Sie das acht Zentimeter lange Stück Mikroinjektor-Kunststoffschlauch auf die Nadel und achten Sie darauf, den Schlauch nicht zu durchstechen, und schieben Sie dann das andere Ende des Kunststoffschlauchs über das Kragenende des getrockneten Mikroinjektors. Schieben Sie den wassergefüllten Spritzenkolben auf Patent C.In diesem Schritt, biegen Sie den fertigen Mikroinjektor in einem Abstand von 15 Millimetern vom Ende gegenüber dem Kragen um 95 Grad.

Schneiden Sie anschließend den Kunststoffschlauch auf 70 Zentimeter ab und schieben Sie ihn über den Mikroinjektorkragen. Um die Pumpe für die Mikroinjektion vorzubereiten, stellen Sie den Durchmesser der Mikroinjektionsnadel, die gewünschte Infusionsrate und das Zielinjektionsvolumen auf dem Schlauch ein. Stellen Sie dann den Pumpenmodus auf Lautstärke ein, damit automatisch eine präzise Lautstärke abgegeben wird.

Stellen Sie anschließend den Rücklaufsperre der Pumpe so ein, dass die Spritze auf das Injektionsvolumen zuzüglich zusätzlicher 0,2 Mikroliter gefüllt werden kann. Legen Sie nun die Spitze der gast tighten Spritze in das sterile Wasser, das in einem kleinen Molkeschiffchen enthalten ist, und flattern Sie vorsichtig mit dem Kolben, um den internen Draht gleichmäßig zu schmieren. Ziehen Sie den Kolben zum Anschlag an der Pumpe, um die Mikroinjektionsnadel mit Wasser zu füllen.

Nächste Folie. Der PE 20-Schlauch, der mit dem Mikroinjektor verbunden ist, wird mit einer 26-Gauge-Nadel verbunden, die an einer sterilen, mit Wasser gefüllten Spritze von einem Milliliter befestigt ist. Sprühen Sie steriles Wasser durch den Mikroinjektor und überprüfen Sie das Sprühmuster und den Abstand.

Platzieren Sie dann einen sterilisierten Mikroinjektor auf einem sterilen Feld. Schieben Sie den Schlauch von der Nadel und schneiden Sie den Schlauch unterhalb des durch die Nadel beschädigten Bereichs ab, während Sie ihn aufrecht halten, um ein Heraustropfen von Wasser zu verhindern. Schieben Sie anschließend den Kolben der Mikroinjektorspritze leicht nach vorne, um ein Tröpfchen am Ende der Nadel zu erzeugen, und schieben Sie den wassergefüllten PE 20-Schlauch auf die Nadel.

Schieben Sie danach den Kolben vollständig nach vorne, um die Probenbeladung vorzubereiten und sicherzustellen, dass keine Spuren von Ethanol im Mikroinjektor verbleiben. Überprüfen Sie die Einstellung auf Undichtigkeiten, indem Sie den Wassertropfen, der sich an der Spitze des Mikroinjektors bildet, einige Male mit einem sauberen Labortuch berühren. Ziehen Sie dann den Spritzenkolben um 0,2 Mikroliter zurück, so dass eine Blase zwischen dem sterilen Wasser und dem PE 20-Schlauch und der zu injizierenden Lösung entsteht.

Setzen Sie danach den Mikroinjektor in das zu injizierende Reagenz ein und ziehen Sie den Spritzenkolben langsam zum Rücklaufsperre. Um das Tier auf die Injektion vorzubereiten, halten Sie die Brust der Ratte gegen die Brust des Experimentators. Reinigen Sie den Bereich um die Kanüle mit einem mit Betadine getränkten Watteapplikator.

Tupfen Sie die Kopfkappe dreimal mit Betadin ab und tupfen Sie sie dann zweimal mit Ethanol ab. Setzen Sie dann den gefüllten Mikroinjektor in die Kanüle ein. Drücken Sie auf Start an der Mikroinjektionspumpe und überwachen Sie die Blasenbewegung.

Wenn die Injektion abgeschlossen ist, entfernen Sie den Mikroinjektor aus der Kanüle und ersetzen Sie ihn durch einen Obturator. Diese Abbildung zeigt die Transfektion der Astrozytenregion des Nucleus accumbens durch mikroinjizierte Viren, und diese Abbildung zeigt die Verringerung der Motivation von Ratten zur Selbstverabreichung von Ethanol durch Aktivierung eines Transgens, das im Nucleus accumbens überexprimiert wurde. Die Aktivierung der Angst vor Kern-Astrozyten durch systemische Verabreichung von CNO reduzierte signifikant die Motivation von Ratten, sich nach Abstinenz Ethanol selbst zu verabreichen, im Vergleich zu Vehikel-CNO, was in einer gleich trainierten Kohorte, die GFP exprimierte, keine Wirkung zeigte, anstatt die Angst, die es einmal beherrschte.

Diese Technik kann maßgeschneiderte Mikroinjektionsgeräte für das Gehirn und eine weitere Flexibilität der experimentellen Verfahren ermöglichen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine genaue Position der Mikroinjektion unerlässlich ist, um den gewünschten Effekt zu erzielen.