Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine mikrofluidische Plattform zu demonstrieren, die resistive Pulsdetektion mit Code-Division-Multiple-Access kombiniert, um die Detektion und Größenbestimmung von Partikeln in mehreren mikrofluidischen Kanälen zu multiplexen. Diese Technologie, mikrofluidische CODES genannt, kann zur Realisierung vollständig integrierter und wirklich tragbarer Lab-on-a-Chip-Geräte beitragen, die sich besonders gut für die punktgenaue Analyse biologischer Proben in ressourcenarmen Umgebungen eignen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die elektronische Verfolgung räumlicher und zeitlicher Partikelmanipulationen auf dem mikrofluidischen Chip ermöglicht und dadurch den Einsatz externer Instrumente wie eines Mikroskops überflüssig macht.

Unsere Technologie ist mit der weichen Lithografie kompatibel und kann problemlos in ein mikrophotisches Gerät integriert werden, bei dem Partikel fraktioniert werden, um eine direkte elektronische Auslesung ähnlich einem Coulter-Zähler bereitzustellen. Um mit dem Aufbau des mikrofluidischen Geräts zu beginnen, erzeugen Sie einen Satz von vier, sieben Bit umfassenden Gold-Codes. Entwerfen Sie anschließend vier eindeutige Elektrodenanordnungen basierend auf den Gold-Codes mithilfe einer computergestützten Konstruktion (CAD-Software) wie AutoCAD.

Schließlich lässt man die Photomasken mit dem entworfenen Elektrodenlayout von einem Photomaskenhersteller anfertigen. Danach wird eine vier Zoll große Borosilikatglaswafer für 20 Minuten in einer fünf zu eins-Piranha-Lösung bei 120 Grad Celsius behandelt. Nach der Reinigung wird die Wafer 20 Minuten lang auf einer Heizplatte bei 200 Grad Celsius erhitzt, um restliches Wasser zu verdampfen.

Legen Sie die saubere, trockene Wafer in einen Spin-Beschichter. Geben Sie 2 Milliliter der negativen Photoresist-Lösung auf den Wafer und beschichten Sie ihn durch Spin-Beschichtung bei 3000 Umdrehungen pro Minute für 40 Sekunden. Trocknen Sie den spin-beschichteten Wafer eine Minute lang auf einer Heizplatte bei 150 Grad Celsius.

Decken Sie die Wafer mit einer Chrommaske in dem gewünschten Elektrodenmuster ab. Belichten Sie die maskierte Photoresist-Oberfläche mit 365 Nanometer UV-Licht, um 225 Millijoule pro Quadratzentimeter zu erreichen. Danach backen Sie den belichteten Photoresist auf einer Heizplatte bei 100 Grad Celsius für eine Minute.

Das Wafer in Photolackentwickler für 15 Sekunden eintauchen, anschließend das strukturierte Wafer mit einem sanften Strahl deionisiertem Wasser abwaschen und unter einem Strom aus Stickstoffgas trocknen. Danach das strukturierte Wafer in einen Elektronenstrahl-Metallverdampfer geben. Eine 20 Nanometer dicke Chromschicht und eine 80 Nanometer dicke Goldschicht auf das Wafer mit einer Rate von einem Ångström pro Sekunde aufdampfen.

Ätzen Sie dann den darunterliegenden Photoresist, indem Sie die metallbeschichtete Waferplatte 30 Minuten lang bei 40 Kilohertz und 100 % Amplitude im Ultraschallbad in Aceton erhitzen. Schneiden Sie die Wafer mit einer Trennsäge nach Bedarf in kleinere Stücke. Um mit der Herstellung der Form für den mikrofluidischen Kanal zu beginnen, reinigen und trocknen Sie eine vier Zoll große Siliziumwaferplatte auf dieselbe Weise wie zuvor die Borosilikatwaferplatte beschrieben.

Legen Sie den Siliziumwafer in einen Spin-Beschichter und geben Sie vier Milliliter einer negativen Photoresist-Lösung auf. Beschichten Sie den Wafer bei 500 U/min für 15 Sekunden, anschließend bei 1.000 U/min für 15 Sekunden und schließlich bei 3.000 U/min für 60 Sekunden. Legen Sie den Wafer mit der Oberseite nach oben auf ein mit Aceton getränktes Reinraumtuch, um rückständigen Photoresist von der Rückseite und den Kanten des Wafers zu entfernen.

Backen Sie das Wafer bei 65 Grad Celsius eine Minute lang und anschließend bei 95 Grad Celsius zwei Minuten lang. Legen Sie eine Chrommaske mit dem Muster für die mikrofluidischen Kanäle auf das trockene Wafer. Belichten Sie den Photoresist mit 365 Nanometer UV-Licht bei 180 Millijoule pro Quadratzentimeter und backen Sie das Wafer danach erneut bei 65 und 95 Grad Celsius jeweils eine und zwei Minuten lang.

Legen Sie den strukturierten Wafer in einen Behälter mit Fotolackentwickler und schütteln Sie den Behälter sanft für drei Minuten. Spülen Sie den entwickelten Wafer mit Isopropanol ab und trocknen Sie den Wafer unter einem Strom von Stickstoffgas. Backen Sie den Wafer bei 200 Grad Celsius für 30 Minuten und überprüfen Sie anschließend mit einem Profilometer, ob der strukturierte Fotolack gleichmäßig dick über den gesamten Wafer verteilt ist.

Legen Sie die Wafer in einen Vakuum-Exsikkator zusammen mit 200 µL Trichlorsilan in einer offenen Petrischale. Lassen Sie die Wafer acht Stunden lang im Exsikkator mit dem Trichlorsilan, um die Waferoberfläche zu silanisieren. Um mit dem Zusammenbau des Geräts zu beginnen, verwenden Sie allgemeines Reinraum-Klebeband, um die Silizium-Wafer-Form in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 150 mm zu befestigen.

Fügen Sie 50 Gramm einer 10:1-Mischung aus Polydimethylsiloxan-Prepolymer der Petrischale hinzu und entgasen Sie die Mischung eine Stunde lang im Vakuum-Exsikkator. Härten Sie die entgaste Mischung bei 65 Grad Celsius mindestens vier Stunden lang aus. Schneiden Sie die ausgehärtete PDMS-Schicht mit einem Skalpell aus und lösen Sie die ausgehärtete Schicht anschließend mit einer Pinzette von der Form ab.

Schneiden Sie das PDMS in kleine Stücke. Stanzen Sie die Einlass- und Auslasslöcher des mikrofluidischen Kanals mit einem Biopsie-Stanzer aus. Legen Sie die PDMS-Schicht mit der Musterseite nach unten auf durchsichtiges Raumband, um die mikromaschinell bearbeitete Oberfläche zu reinigen.

Spülen Sie das zuvor präparierte Elektroden-Trägersubstrat aus Glas mit Aceton, Isopropanol und entionisiertem Wasser. Trocknen Sie das Substrat unter einem Strom aus Stickstoffgas. Platzieren Sie die PDMS-Schicht und das Substrat in einen RF-Plasmagenerator, der auf 100 Milliwatt eingestellt ist, wobei die Seiten mit den Mikromaschinen nach oben zeigen.

Aktivieren Sie die Mikromaschinenoberflächen 30 Sekunden lang in Sauerstoffplasma. Verwenden Sie anschließend ein optisches Mikroskop, um die strukturierte PDMS-Schicht mit den Oberflächenelektroden auszurichten. Bringen Sie die Oberflächen nach der Ausrichtung in physischen Kontakt, um die PDMS-Schicht auf dem Glas-Substrat abzudichten.

Es ist entscheidend, dass das Beschichtungselektrodenmuster auf dem Glas-Substrat korrekt mit den PDMS-Mikrofluidik-Kanälen ausgerichtet ist. Sobald eine korrekte Ausrichtung erreicht ist, erzeugt die Wechselwirkung der Partikel mit der Oberflächenelektrode ein gewünschtes Codewellensignal für die Multiplexierung. Backen Sie das montierte Gerät bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten, wobei die Glasseite nach unten zeigt.

Verlöten Sie abschließend die Drähte an den Elektrodenkontaktflächen, um die Gerätebestückung abzuschließen. Um das Experiment zu beginnen, stellen Sie das mikrofluidische Gerät auf den Objekttisch eines optischen Mikroskops. Schließen Sie die Bezugselektrode des Geräts an den Signal-Ausgangsanschluss eines Lock-in-Verstärkers an und geben Sie eine Sinuswelle mit 400 Kilohertz an.

Schließen Sie die positiven und negativen Sensorelektroden an zwei unabhängige Transimpedanzverstärker an. Verbinden Sie beide Transimpedanzverstärker mit den differentiellen Spannungseingängen des Lock-in-Verstärkers, wobei das positive Sensorsignal vom negativen Sensorsignal subtrahiert wird. Schließen Sie den Demodulatorausgang des Lock-in-Verstärkers an eine Datenerfassungseinheit an.

Stellen Sie in der Datenerfassungssoftware eine Abtastrate für den Ausgang des Lock-in-Verstärkers auf 1 Megahertz ein. Richten Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera ein, um den Betrieb des Geräts optisch aufzuzeichnen, wie er unter dem Mikroskop zu sehen ist. Ziehen Sie eine vorbereitete Zellsuspension in eine Spritze ein.

Befestigen Sie die Probenspritze in einer Spritzenpumpe und verbinden Sie die Spritze mit dem Einlasskanal. Leiten Sie den Auslasskanal in einen Abfallbehälter. Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um die Zellsuspension mit einer konstanten Flussrate durch das Gerät zu leiten, während Sie das Signal der Impedanzmodulation aufzeichnen.

Nach Abschluss des Experiments bearbeiten Sie die elektrischen Daten mit Analysesoftware. Vergleichen Sie das verarbeitete elektrische Signal mit den Bildern der Hochgeschwindigkeitskamera, um eine Kalibrierungskurve für die Zellgröße zu erstellen. Eine Zellsuspension wurde durch eine mikrofluidische Sensoreinrichtung mit vier eindeutigen Elektrodenmustern, die aus orthogonalen Sensorkodierungen abgeleitet waren, geleitet.

Alle vier Sensorsignale wurden von einem einzigen elektrischen Ausgang aufgezeichnet. Der einzelne Sensor, der jedem aufgezeichneten Signal zugeordnet war, wurde durch Korrelation der aufgezeichneten Sensorsignale mit allen möglichen Codes identifiziert, wodurch deutlich unterscheidbare Autokorrelationspeaks entstanden. Wellenformen, die durch überlappende Signale bei der gleichzeitigen Detektion von Zellen in allen vier Kanälen erzeugt wurden, wurden mithilfe eines iterativen Algorithmus aufgelöst.

Ein aufgezeichneter Wellenverlauf wurde mit allen möglichen Codes korreliert, und der größte Autokorrelationspeak wurde identifiziert. Das entsprechende individuelle Sensorsignal wurde rekonstruiert und vom Eingangssignal subtrahiert. Das resultierende Restsignal wurde als Eingang an die nächste Iteration übergeben, und der Vorgang wurde fortgesetzt, bis das Restsignal keine Autokorrelationspeaks mehr ergab.

Die geschätzten Signale wurden anhand eines Optimierungsalgorithmus verfeinert, der die beste Übereinstimmung zwischen den rekonstruierten und den ursprünglich aufgezeichneten Wellenformen mittels der Methode der kleinsten Quadrate suchte. Anschließend wurden Ort, Größe der Zelle und die Zeit zum Durchqueren des Sensors aus der Kanalnummer, der Amplitude, Dauer und relativen Zeitpunkten der geschätzten Sensorsignale bestimmt. Das Verfahren wurde durch den Vergleich der elektrischen Signale mit optischen Messungen der Hochgeschwindigkeitskamera validiert.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, ist sie sehr einfach zu implementieren, da sie aus hardwaretechnischer Sicht sehr einfach ist. Sie verfügt über keine aktiven Bauelemente auf dem Chip. Sie ist direkt mit der weichen Lithografie kompatibel, und die Signalverarbeitung basiert auf einem einfachen Berechnungsalgorithmus.

Mithilfe dieses Protokolls können Sie mikrofluidische Chips mit codebasierten multiplex elektrischen Sensoren herstellen und elektrische Signale für die bioanalytische Messung entschlüsseln. Diese vielseitige, skalierbare elektronische Sensortechnologie kann leicht in verschiedene mikrofluidische Vorrichtungen integriert werden, um quantitative Assays durch räumlich-zeitliche Verfolgung von Partikeln während der Verarbeitung auf dem Chip zu realisieren. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine mikrofluidische CODES-Technologie entwirft, herstellt und implementiert.