Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine mikrofluidische Plattform zu demonstrieren, die resistive Impulsmessung mit Code-Division kombiniert: Mehrfachzugriff auf Multiplex, die Detektion und Größenbestimmung von Partikeln in mehreren mikrofluidischen Kanälen. Diese Technologie, die als mikrofluidische CODES bezeichnet wird, kann dazu beitragen, vollständig integrierte und wirklich tragbare Laborgeräte-Chip-Geräte zu realisieren, die sich gut für die Point-of-Care-Tests von biologischen Proben in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen eignen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die räumliche, zeitliche Manipulation von Partikeln auf dem mikrofluidischen Chip elektronisch verfolgen kann, wodurch ein externes Instrument wie ein Mikroskop überflüssig wird.

Unsere Technologie ist mit der Softlithographie kompatibel und kann leicht in ein mikrophotisches Gerät integriert werden, bei dem die Partikel fraktioniert werden, um eine direkte elektronische Anzeige zu ermöglichen, ähnlich wie beim Coulter-Zähler. Um mit dem Bau des mikrofluidischen Geräts zu beginnen, generieren Sie einen Satz von vier Sieben-Bit-Goldcodes. Entwerfen Sie dann vier einzigartige Elektrodenlayouts basierend auf den Goldcodes mit Hilfe eines computergestützten Designs oder einer CAD-Software wie AutoCAD.

Lassen Sie abschließend die Photomasked mit dem entworfenen Elektrodenlayout von einem Photomask-Lieferanten herstellen. Als nächstes weichen Sie einen vier Zoll großen Borosilikatglaswafer 20 Minuten lang in einer fünf zu eins Piranha-Lösung bei 120 Grad Celsius ein. Nach der Reinigung erhitzen Sie den Wafer auf einer heißen Platte bei 200 Grad Celsius für 20 Minuten, um das restliche Wasser zu verdampfen.

Legen Sie den sauberen, trockenen Wafer in einen Spin Coater. Tragen Sie 2 Milliliter negative Fotolacklösung auf den Wafer auf und schleudern Sie den Lack bei 3000 Umdrehungen pro Minute für 40 Sekunden. Trocknen Sie den geschleuderten Wafer eine Minute lang auf einer heißen Platte bei 150 Grad Celsius.

Dann bedecken Sie den Wafer mit einer Chrommaske im gewünschten Elektrodenmuster. Setzen Sie die maskierte Fotolackoberfläche 365 Nanometer UV-Licht aus, um 225 Millijoule pro Quadratzentimeter zu erreichen. Anschließend den belichteten Fotolack auf einer heißen Platte bei 100 Grad Celsius eine Minute lang backen.

Tauchen Sie den Wafer 15 Sekunden lang in einen Fotolackentwickler, waschen Sie dann den Pattern-Wafer in einem sanften Sprühnebel mit deionisiertem Wasser und trocknen Sie den Wafer unter einem Strom von Stickstoffgas. Legen Sie als Nächstes den gemusterten Wafer in einen Elektronenstrahl-Metallverdampfer. Scheiden Sie eine 20 Nanometer dicke Chromschicht und eine 80 Nanometer dicke Goldschicht mit einer Geschwindigkeit von einem Angström pro Sekunde auf den Wafer ab.

Ätzen Sie dann den darunterliegenden Fotolack durch Ultraschallerhitzen des metallbeschichteten Wafers in Aceton für 30 Minuten bei 40 Kilohertz und 100 % Amplitude. Schneide die Waffel mit einer Würfelsäge nach Bedarf in kleinere Stücke. Um mit der Herstellung der mikrofluidischen Kanalform zu beginnen, reinigen und trocknen Sie einen vier Zoll großen Siliziumwafer auf die gleiche Weise wie den zuvor beschriebenen Borosilikatwafer.

Legen Sie den Siliziumwafer in einen Spin-Coater und tragen Sie vier Milliliter negative Fotolacklösung auf. Schleudern Sie den Wafer 15 Sekunden lang bei 500 U/min, dann 15 Sekunden lang bei 1.000 U/min und schließlich 60 Sekunden lang bei 3.000 U/min. Legen Sie den Wafer mit der Vorderseite nach oben auf ein mit Aceton getränktes Reinraumtuch, um Reste von Fotolack von der Rückseite und den Rändern des Wafers zu entfernen.

Die Waffel eine Minute lang bei 65 Grad Celsius und dann zwei Minuten bei 95 Grad Celsius backen. Platzieren Sie ein Chrommaskenmuster für die mikrofluidischen Kanäle auf dem trockenen Wafer. Setzen Sie den Fotolack 365 Nanometer UV-Licht bei 180 Millijoule pro Quadratzentimeter aus und backen Sie den Wafer dann erneut bei 65 bzw. 95 Grad Celsius für eine bzw. zwei Minuten.

Legen Sie den gemusterten Wafer in einen Behälter mit Fotolackentwickler und schütteln Sie den Behälter drei Minuten lang vorsichtig. Spülen Sie den entwickelten Wafer in Isopropanol und trocknen Sie den Wafer unter einem Strom von Stickstoffgas. Backen Sie den Wafer 30 Minuten lang bei 200 Grad Celsius und überprüfen Sie dann mit einem Profilometer, ob der Muster-Fotolack gleichmäßig dick über den Wafer ist.

Legen Sie den Wafer zusammen mit 200 Mikrolitern Trichlorsilan in eine nicht abgedeckte Petrischale. Lassen Sie den Wafer acht Stunden lang mit dem Trichlorsilan im Exsikkator ruhen, um die Waferoberfläche zu silanisieren. Um mit dem Zusammenbau des Geräts zu beginnen, verwenden Sie universelles Reinraumband, um die Silikonwaferform in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 150 Millimetern zu befestigen.

Geben Sie 50 Gramm einer Mischung aus Polydimethylsiloxan-Präpolymer in die Petrischale und entgasen Sie die Mischung eine Stunde lang in einem Vakuumexsikkator. Härten Sie das entgaste Gemisch mindestens vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius aus. Schneiden Sie mit einem Skalpell die ausgehärtete PDMS-Schicht aus und ziehen Sie dann die ausgehärtete Schicht mit einer Pinzette von der Form ab.

Schneiden Sie das PDMS in kleine Stücke. Stanzen Sie die Einlass- und Auslasslöcher des mikrofluidischen Kanals mit einem Biopsie-Locher. Legen Sie das PDMS-Schichtmuster mit der bedruckten Seite nach unten auf Klarraumband, um die mikrobearbeitete Oberfläche zu reinigen.

Spülen Sie das zuvor vorbereitete elektrodentragende Glassubstrat mit Aceton, Isopropanol und deionisiertem Wasser. Trocknen Sie das Substrat unter einem Strom von Stickstoffgas. Legen Sie die PDMS-Schicht und das Substrat mit den Seiten der Mikromaschine nach oben in einen HF-Plasmagenerator, der auf 100 Milliwatt eingestellt ist.

Aktivieren Sie die Oberflächen der Mikromaschine 30 Sekunden lang im Sauerstoffplasma. Verwenden Sie anschließend ein optisches Mikroskop, um die PDMS-Musterschicht mit den Oberflächenelektroden auszurichten. Lassen Sie die Oberflächen nach dem Ausrichten in physischen Kontakt kommen, um die PDMS-Schicht auf dem Glassubstrat abzudichten.

Es ist von entscheidender Bedeutung, dass das Beschichtungselektrodenmuster auf dem Glassubstrat korrekt mit den mikrofluidischen PDMS-Kanälen ausgerichtet ist. Sobald sie richtig ausgerichtet ist, erzeugt die Partikelwechselwirkung mit der Oberflächenelektrode eine gewünschte Code-Wellenform für das Multiplexing. Backen Sie das zusammengebaute Gerät bei 70 Grad Celsius fünf Minuten lang mit der Glasseite nach unten.

Löten Sie abschließend Drähte an die Elektrodenkontaktpads, um die Gerätemontage abzuschließen. Um das Experiment zu beginnen, stellen Sie das mikrofluidische Gerät auf einen optischen Mikroskoptisch. Schließen Sie die Referenzelektrode des Geräts an den Signalausgang eines Lock-in-Verstärkers an und legen Sie eine Sinuswelle von 400 Kilohertz an.

Verbinden Sie die positiven und negativen Sensorelektroden mit zwei unabhängigen Transimpedanzverstärkern. Verbinden Sie beide Transimpedanzverstärker mit den Differenzspannungseingängen des Lock-in-Verstärkers, wobei das positive Sensorsignal vom negativen Sensorsignal subtrahiert werden soll. Verbinden Sie den Demodulatorausgang des Lock-in-Verstärkers mit einer Datenerfassungseinheit.

Stellen Sie in der Datenerfassungssoftware eine Abtastrate für den Lock-in-Verstärkerausgang von 1 Megahertz ein. Richten Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera ein, um den Betrieb des Geräts unter dem Mikroskop optisch aufzuzeichnen. Ziehen Sie eine vorbereitete Zellsuspension in eine Spritze.

Sichern Sie die Probenspritze in einer Spritzenpumpe und schließen Sie die Spritze an den Einlaufkanal an. Richten Sie den Auslasskanal auf einen Abfallbehälter. Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um die Zellsuspension mit einer konstanten Durchflussrate durch das Gerät zu treiben, während Sie das Impedanzmodulationssignal aufzeichnen.

Verarbeiten Sie nach Abschluss des Experiments die elektrischen Daten mit einer Analysesoftware. Vergleichen Sie das verarbeitete elektrische Signal mit Bildern der Hochgeschwindigkeitskamera, um eine Kalibrierungskurve für die Zellgröße zu erstellen. Eine Zellsuspension wurde durch ein mikrofluidisches Sensorgerät mit vier einzigartigen Elektrodenmustern geströmt, die von orthogonalen Sensorcodes abgeleitet wurden.

Alle vier Sensorsignale wurden von einem einzigen elektrischen Ausgang aufgezeichnet. Der einzelne Sensor, der jedem aufgezeichneten Signal zugeordnet war, wurde durch Korrelation der aufgezeichneten Sensorsignale mit allen möglichen Codes identifiziert, was zu klar unterscheidbaren, autokorrelierenden Spitzen führte. Wellenformen, die durch die Störsignale aus der gleichzeitigen Detektion von Zellen in allen vier Kanälen erzeugt wurden, wurden mit einem iterativen Algorithmus aufgelöst.

Eine aufgezeichnete Wellenform wurde mit allen möglichen Codes korreliert und der größte Autokorrelationspeak identifiziert. Das entsprechende individuelle Sensorsignal wurde rekonstruiert und von der Eingangswellenform subtrahiert. Das Restsignal wurde an die nächste Iteration weitergegeben, während die Eingabe und der Prozess fortgesetzt wurden, bis das Restsignal keine Autokorrelationsspitzen mehr erzeugte.

Die geschätzten Signale wurden auf der Grundlage eines Optimierungsalgorithmus verfeinert, der die beste Anpassung zwischen den rekonstruierten und den ursprünglich aufgezeichneten Wellenformen unter Verwendung der Approximation der kleinsten Quadrate suchte. Die Position, die Größe und die Zeit bis zum Passieren des Sensors wurden dann anhand der Kanalnummer, der Amplitude, der Dauer und des relativen Timings der geschätzten Sensorsignale bestimmt. Das Verfahren wurde durch den Vergleich der elektrischen Signale mit optischen Messungen der Hochgeschwindigkeitskamera validiert.

Einmal gemeistert, ist diese Technik sehr einfach zu implementieren, da sie aus Hardware-Sicht sehr einfach ist. Es hat keine aktive On-Chip-Komponente. Es ist direkt mit der Softlithographie kompatibel und die Signalverarbeitung beruht auf einem einfachen Rechenalgorithmus.

Nach diesem Protokoll können Sie mikrofluidische Chips mit codebasierten elektrischen Multiplexsensoren herstellen und elektrische Signale für bioanalytische Messungen dekodieren. Diese vielseitige, skalierbare, elektronische Sensortechnologie kann problemlos in verschiedene mikrofluidische Geräte integriert werden, um quantitative Assays zu realisieren, indem Partikel während der Verarbeitung auf dem Chip räumlich und zeitlich verfolgt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine mikrofluidische CODES-Technologie entwirft, herstellt und implementiert.