Name: Plasmid stammende DNA-Strand Displacement Gatter zum Implementieren Chemical Reaction Networks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie DNA-Strangverdrängungsgatter aus bakteriellen Plasmiden gewinnen und deren Leistung mittels Fluoreszenzkinetik testen. Diese Methode ermöglicht robuste molekulare Schaltkreise mit geringerer Leckage.

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Figuren 1, 2, 3, 4, 6, 8 und den Tabellen 2, 3, 10, 15, 16 sind aus Lit. 29 modifiziert. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (NSF gewähren CCF-1.117.143 und NSF-CCF 1.162.141 auf GS). Y.-JC wurde vom taiwanesischen Regierung Stipendien unterstützt. SDR wurde von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) unterstützt.

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<li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zum Ableiten ndsDNA Gates aus hochreiner Plasmid-DNA. Darüber hinaus wird ein Protokoll zur Charakterisierung Gate Leistung durch einen Fluoreszenz-Assay-Kinetik dargestellt. Experimentelle Daten zeigen, dass das Plasmid stammSystem trifft sein synthetisches Gegenstück, selbst wenn das synthetische System ist aus Strängen mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigt, montiert. Wahrscheinlich ist die verbesserte Leistung von Plasmid stammende Gates vor allem auf die hohe Reinheit der biologischen DNA. Synthetische DNA enthält eine Vielzahl von Fehlern, insbesondere Deletionen, die Oligonukleotide mit einer Länge von n-1, und solche Nebenprodukte entstehen, werden in der Regel nicht vollständig PAGE oder Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) Reinigungsverfahren entfernt. Ähnliche Verbesserungen bei den hier berichteten wurden in einer früheren Studie von einer katalysierten Haarnadel-Verstärker, der aus biologischen Quellen 21 abgeleitete DNA verwendet beobachtet. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Aber auch die Verwendung von Plasmid-abgeleitete Gatter können nicht vollständig beseitigen Fehler in der Gate Leistung, für die es mindestens zwei Gründe: Erstens über Verdauung oder Mangel an Schnittgenauigkeit können die Gates mit zu vielen führen Einschnitte oder Kerben in den falschen Positionen. In jedem Fall sind Gates eher in unerwünschter Reaktionen teilzunehmen. Solche Probleme können durch eine Optimierung der Menge des verwendeten Enzyms (siehe Abbildung 4) gelockert werden. Zweitens, in diesen Experimenten am Ein- und Hilfsstränge wurden synthetische DNA und enthielt Deletionen und Mutationen bei. Prinzipiell sind alle Einzelstrang Antriebs- und Hilfs Stränge könnte auch aus Phagemid-DNA durch eine Nicking-Enzym-Verdauung des vorcodierten m13 Virusgenom 26 erhalten werden. Vielleicht die Leistungsfähigkeit der Schaltung kann ferner unter Verwendung von ssDNA aus dem Bakteriengenom abgeleitet verbessert werden. Während die Verwendung von Plasmid-abgeleitete Gattern wurde gefunden, daß die Schaltungsleistung zu verbessern, eine Analyseder Kosten und Bearbeitungszeiten ergeben, dass, während die Herstellung von Plasmid stammende Gates etwas günstiger ist (Tabelle 15), dauert es 2-3 mal längere Verarbeitungszeit im Vergleich zur Montage und Reinigung von Gattern aus kommerziell synthetisiert Oligos (Tabelle 16). Die primären Kosten von Plasmid stammende Gates Gensynthese und die Verwendung von Restriktionsenzymen. 300 pmol von Gattern (ausreichend für 15 Reaktionen bei 30 nM), die geschätzten Kosten für die Join-Gatter ist ungefähr $ 170 und $ 200 für Gabel Tore, die Kostendifferenz wobei aufgrund der Verwendung von unterschiedlichen Nicking-Enzyme. Im Gegensatz dazu ist die chemische Synthese der Stränge für die gleiche Gate kostet rund 260 $ einschließlich einer PAGE Reinigungsgebühr. Die primären Zeitkosten für Plasmid stamm Toren ist in der Klonierung, die, genau wie die DNA-Synthese, kann zu einer Gensynthese Unternehmen ausgelagert werden. Haben jedoch nach der Montage Plasmid stamm Gatter den Vorteil, dass der Host-Plasmide können leicht zu einem replizierendennd in Form von bakteriellen Glycerinstamm gespeichert werden. Dadurch ist es möglich, um die Gates mehrfach wieder verwenden. Wir freuen uns, könnte die verbesserte Leistung von Plasmid stamm Toren einen wesentlich größeren Dynamikbereich als Verhaltensweisen sind experimentell bisher mit DNA CRNs gezeigt zu ermöglichen. Zum Beispiel schlug den letzten theoretischen Arbeit 47,48, dass selbstorganisierte räumliche Muster auf der Makroskala kann mit DNA CRNs durch eine Reaktionsdiffusionsmechanismus realisiert werden. Die hier vorgestellte Methode bietet eine praktikable Weg zum Aufbau der zugrunde liegenden molekularen Komponenten für solche Selbst Strukturieren DNA Materialien. Obwohl anspruchsvoll, die Entwicklung Makromaßstab Morphologien in einer programmierbaren Weise würde erhebliche Auswirkungen in Bereichen wie Biomaterialforschung an der regenerativen Medizin haben.

Die Vorhersehbarkeit der Watson-Crick-Basenpaarung konnten dynamischen DNA-Nanotechnologie als eine programmierbare Weg zu molekularen Geräte mit dynamischen Eigenschaften 1,2 entwerfen entstehen. Insbesondere DNA Strangverdrängung - eine programmierbare, wettbewerbsfähige Hybridisierungsreaktion - hat sich als leistungsfähigen Mechanismus für das Engineering dynamischer DNA Systeme sein. In einem DNA-Strang Verdrängungsreaktion, verdrängt ein eingehender Oligonukleotid eine zuvor gebunden &quot;output&quot; Strang aus einem komplementären Bindungspartner. Mehrere solche Reaktionen können zusammen in mehrstufigen Reaktorkaskaden mit einem hohen Grad an Kontrolle über die Reihenfolge und das Timing der einzelnen Reaktionsschritte 3 verkettet werden. DNA-Strangverdrängungs Kaskaden verwendet worden, um digitale und analoge Schaltungen Molekular 4-7, umschaltbar Nanostrukturen 8-10 autonome molekulare Motoren 11-15, und nicht-kovalente katalytischer Verstärker 13,16-21 erstellen. Außerdem DNA Geräte mit Strangverdrängungsreaktionen können simuliert und für vielfältige Anwendungen unter Verwendung von computergestützten Design-Software 22-24 ausgelegt sein. Derzeit ist chemisch synthetisierte DNA als Hauptmaterial für die DNA-Nanotechnologie. Jedoch Fehler in der DNA-Syntheseverfahren und die so erhaltenen unvollkommen Oligonukleotiden wird angenommen, dass die Leistung von dynamischen DNA von Geräten durch fehlerhafte Nebenreaktionen zu begrenzen. Zum Beispiel &quot;Leck&quot; Reaktionen können in der Freisetzung eines Ausgangs Oligonucleotid selbst in der Abwesenheit eines Reaktionstrigger führen. Solche Effekte werden in autokatalytischen Reaktionskaskaden, wo auch nur eine minimale Menge von anfänglichen Leck wird schließlich in die vollständige Aktivierung des Kaskaden 19,20 führen offensichtlichsten. Umgekehrt Reaktionen oft nicht zu dem erwarteten Ausmaß der Aktivierung zu erreichen, da einige Komponenten nicht einmal in Anwesenheit von die beabsichtigte Eingabe 7,25 auszulösen. Um die Leistung zu machen DNA basierendenNanovorrichtungen vergleichbar zu biologischen Proteinbasis benötigen solche Fehlerarten, drastisch reduziert werden. Bakterielle Plasmide oder andere biologische DNA konnte als relativ billige Quelle für hochreine DNA für Nanotechnologie-Anwendungen dienen. Große Mengen von DNA können durch Replikation in Bakterien erzeugt werden, und die Grenzkorrekturlesen Fähigkeiten lebender Systeme sorgen für die Reinheit des erhaltenen DNA. In der Tat haben einige neue Papiere den potenziellen Nutzen der biologischen DNA für Nanotechnologie-Anwendungen 21,26-28 anerkannt. Jedoch die vollständig doppelsträngige Art der Plasmid-DNA hat bisher die Verwendung als Material zur Herstellung von dynamischen DNA-Geräte, die typischerweise aus mehreren Oligonukleotiden und enthalten sowohl doppelsträngige und einzelsträngige Bereiche gestattet. In einem kürzlich erschienenen Papier 29 wurde diese Frage angesprochen und eine neue DNA-Gate-Architektur, die in erster Linie aus geklaut doppelsträngige DNA (ndsDNA) aus war einzuführend. Wichtig ist, dass Systeme der ndsDNA Tore ausgelegt sein, dass die durch jede formale chemische Reaktion Netzwerk (CRN) 29 angegeben Dynamik zu realisieren. ndsDNA Gates könnte also verwendet werden, grundsätzlich auf dynamische Systeme, die Schwingungen und Chaos, Bistabilität und Gedächtnis, Boolesche Logik oder algorithmische Verhaltensweisen 30-38 aufweisen erstellen. Zum Beispiel 29 Ref. Gezeigt, eine dreiReaktions CRN, die ein Molekular Implementierung eines &quot;Konsensus&quot; Protokoll an, das der verteilten Rechenalgorithmus 29,39,40 vorgesehen. Diese Arbeit erstmals gezeigt werden eine neue Verwendung für die CRN-Formalismus als eine &quot;Programmiersprache&quot; zur schnellen Synthese von funktionalen molekularen Systemen (Abbildung 1A). Hier ist ein detailliertes Protokoll zum Ableiten ndsDNA Gates von Plasmid-DNA ist. Zunächst ist eine Überprüfung der Sequenz Design-Prozess. Es folgt eine Erläuterung, wie synthetische Oligonukleotide enthaltendie Gate-Sequenzen in Plasmide kloniert und die Sequenz verifiziert und durch Bakterienkultur amplifiziert. Als nächstes wird gezeigt, wie ndsDNA Tore können aus den Plasmiden durch enzymatische Verarbeitung abgeleitet werden (siehe Abbildung 2). Schließlich wird ein Verfahren zum Testen von Gate Verhaltens mit Fluoreszenzkinetiken Assays beschrieben. Reaktionsmechanismus Als ein Beispiel setzt das Protokoll auf die katalytische chemische Reaktion A + B-&gt; B + C. Die Arten A, B und C (&quot;Signale&quot;, 1B) entsprechen alle einem anderen Einzelstrang-DNA-Moleküls. Die Sequenzen dieser Moleküle sind völlig unabhängig und die Stränge nicht direkt miteinander reagieren. Die Sequenzen aller Signale weisen zwei verschiedene funktionelle Domänen, das heißt, Teilsequenzen, die in Strangverdrängungsreaktionen zusammenwirken: 1) eine kurze toehold Domäne (labels ta, tb, tc), die für die Initiation der Strangverdrängung r verwendet wirdeAction, und 2) eine lange Domain (Etiketten a, b, c), die das Signal Identität bestimmt. Wechselwirkungen zwischen Signalstränge durch geklaut doppelsträngige DNA (ndsDNA) Gate-Komplexe vermittelte (genannt anmelden AB und Gabel BC) und Hilfseinzelstrang-Arten (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;c tb&gt; und &lt;i tc &gt;). Die formale Reaktions A + B-&gt; B + C wird durch eine Reihe von Strangverdrängungsreaktionsschritten, wobei jeder Reaktionsschritt setzt einen Ansatzpunkt für eine anschließende Reaktion (1B) ausgeführt. In diesem Beispiel werden Signale A und B sind anfänglich frei in Lösung, während das Signal C dem Gabel Gate gebunden. Am Ende der Reaktion B und C sind in Lösung. Allgemeiner Signale, die an ein Gate gebunden sind inaktiv, während Signale, die frei in Lösung aktiv sind, das heißt, sie können in einer Strangverdrängungsreaktion als teilnehmenein Eingang. Der zeitliche Verlauf der Reaktion wird unter Verwendung eines fluoreszierenden Reporterstrategie (Abbildung 1C), gefolgt. In früheren Arbeiten 29 wurde gezeigt, dass diese Reaktion Mechanismus realisiert sowohl die korrekte Stöchiometrie als auch die Kinetik der Zielreaktion.

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF Puffer</td><td>NEB</td><td>M0531S</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S Grandiose</td><td></td></tr><tr><td>Brühe, modifiziert</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Hispeed Maxi-Prep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doppelsträngige Genomblöcke</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 Fluorimeter</td><td>Horiba/Jobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synthetische Quarzzellen&nbsp;</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Gel-Extraktionskit</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Rückgrate</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>Plasmid mit hoher Kopienzahl und Ampicillin-Resistenz. Die Sequenz finden Sie bei http://parts.igem.org</td></tr></tbody></table>

plasmid stammende dna-strand displacement gatter zum implementieren chemical reaction networks

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA-Nanotechnologie erfordert große Mengen an hochreiner DNA als technisches Material. Plasmid-DNA könnte diesen Bedarf decken, da sie mit hoher Genauigkeit repliziert wird, leicht durch Bakterienkulturen amplifiziert werden kann und in Form von bakteriellen Glycerinbrühen unbegrenzt gelagert werden kann. Die doppelsträngige Natur der Plasmid-DNA hat jedoch bisher ihre effiziente Verwendung für die Konstruktion von DNA-Nanostrukturen oder -Geräten behindert, die typischerweise einzelsträngige oder verzweigte Domänen enthalten. In neueren Arbeiten wurde festgestellt, dass genickte doppelsträngige DNA (ndsDNA) Strangverdrängungsgatter aus Plasmid-DNA gewonnen werden können. Im Folgenden finden Sie ein Protokoll, das detailliert beschreibt, wie diese ndsDNA-Gatter effizient in Plasmiden kodiert und durch eine kleine Anzahl enzymatischer Verarbeitungsschritte von den Plasmiden abgeleitet werden können. Ebenfalls enthalten ist ein Protokoll zum Testen von ndsDNA-Gattern mittels Fluoreszenzkinetikmessungen. NdsDNA-Gatter können verwendet werden, um beliebige chemische Reaktionsnetzwerke (CRNs) zu implementieren und so einen Weg zur Verwendung des CRN-Formalismus als präskriptive molekulare Programmiersprache zu ebnen. Um diese Technologie zu demonstrieren, wird eine mehrstufige Reaktionskaskade mit katalytischer Kinetik konstruiert. Des Weiteren wird gezeigt, dass Plasmid-abgeleitete Komponenten besser abschneiden als identische Komponenten, die aus synthetischer DNA zusammengesetzt sind.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Ableitung von DNA-Strang-Verschiebungstoren aus Plasmiden und deren Test mit Hilfe von Fluoreszenz-Kinetik-Messungen. Gatter können modular zu Mehrkomponentensystemen zusammengesetzt werden, um das Verhalten formaler chemischer Reaktionsnetzwerke (CRN) zu approximieren, was eine neue Verwendung von CRNs als molekulare Programmiersprache demonstriert.

Plasmid stammende DNA-Strand Displacement Gatter zum Implementieren Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA-Strangverdrängungsgatter aus bakteriellen Plasmiden abzuleiten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie bakterielle Plasmide als hochreine Quelle verwendet, um robuste DNA-Gates zu erzeugen. Dieses Verfahren wird von meinen Kollegen Sam Dip und mir demonstriert: Mit der Massenproduktion beginnen und dann enthaltende DNA-Gates isolieren, indem DNA-Isolationskits verwendet werden, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben und in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers nach Ellucian.Messen Sie die Konzentration von Plasmid-DNA mit Standardtechniken. Dann verdauen Sie die DNA, indem Sie für jedes Milligramm des Plasmids vier Einheiten des Restriktionsenzyms PV U2 HF hinzufügen. Als nächstes fügen Sie der Probe zwei äquivalente Volumina eiskaltes absolutes Ethanol hinzu.Inkubieren Sie das Gemisch mindestens eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius, um die DNA auszufällen. Pelletieren Sie dann die gefällte DNA, indem Sie die Probe 30 Minuten lang bei 10.000 bis 14.000 G und null Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie das SNAT und geben Sie 1000 Mikroliter 95%iges Ethanol bei Raumtemperatur in die Probe.Dann drehen Sie die Probe 10 bis 15 Mal um und zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 10.000 bis 14.000 G und vier Grad Celsius. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie die DNA 10 bis 20 Minuten lang an der Luft auf einer Bank. Achten Sie bei der Entfernung des Überstands aus der gefällten DNA darauf, das Pellet nicht zu stören, da sonst die Ausbeute erheblich verringert wird.Nach dem Trocknen wird das DNA-Pellet in bis zu 200 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser resuspendiert und zum Mischen mit einem Wirbel vermischt. Die Zugabe von mehr als 200 Mikrolitern Wasser führt in der Regel dazu, dass die Probe für die Verwendung verdünnt wird. Messen Sie bei kinetischen Experimenten die resuspendierte DNA mit einem Spektralphotometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.Fügen Sie dann vier Einheiten des Nicking-Enzyms M-B-B-S-R-D hinzu, eine pro Mikrogramm Plasmid, und fügen Sie den entsprechenden Enzympuffer hinzu. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius, um die Gelenktore zu verdauen. Als nächstes verdauen Sie die Gabelgatter, indem Sie acht Einheiten des Nicking-Enzyms NT BST mb, eine pro Mikrogramm Plasmid und den entsprechenden Enzympuffer hinzufügen.Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius. Um die fluoreszierenden Reporter vorzubereiten, resusieren Sie zunächst die Proben, suspendieren und quantifizieren Sie sie, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie dann 10 Mikroliter des unteren Strangs des Reporters mit 13 Mikrolitern des oberen Quencherstrangs in Trisacetat-EDTA-Puffer mit 12,5 Millimolar Magnesium.Um sicherzustellen, dass die gesamte Flora, also vier markierte Stränge, abgeschreckt werden, sollte ein Überschuss von 30 % des mit Quencher markierten Strangs hinzugefügt werden. Als nächstes wird der Reporter-C-Komplex mit einem Thermocycler aniliert. Kühlen Sie die Probe von 95 Grad Celsius auf 20 Grad Celsius mit einer Geschwindigkeit von einem Grad Celsius pro Minute ab.Wenn Sie fertig sind, lagern Sie die Probe nach der Kalibrierung bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie mit den Fluoreszenzmessungen, indem Sie den Temperaturregler zunächst auf 25 Grad Celsius einstellen, während sich die Temperatur stabilisiert. Richten Sie die richtigen Parameter für kinetische Messungen in der Datenerfassungssoftware ein.Nachdem Sie die Software für das spektrale Fluorimeter geöffnet haben, stellen Sie die Gleitbreite sowohl für die Anregung als auch für die Emission monochrom auf 2,73 Nanometer ein. Stellen Sie dann die Integrationszeit für jeden 62. Zeitpunkt auf 10 Sekunden und die Gesamtmesszeit auf 24 Stunden ein. Stellen Sie abschließend die Anregungs- und Emissionswellenlängen so ein, dass sie dem im Experiment verwendeten Florawald entsprechen.Als nächstes fügen Sie 410,2 Mikroliter nukleasefreies Wasser und 52,8 Mikroliter 10 Extra-Acetat-EDTA-Puffer mit 125 Millimolar Magnesium zu einer synthetischen Quarzzelle hinzu. Fügen Sie außerdem zwei Mikroliter 300 millimolare Poly-T-Stränge hinzu und wirbeln Sie die synthetische Quarzzelle dann 10 bis 15 Sekunden lang durch. Weiter bei neun Mikrolitern der Reporterstränge bei 10 Mikromolaren und sechs Mikrolitern jedes Hilfsstrangs bei 10 Mikromolaren.Dann bei 45 Mikrolitern sowohl des Gelenks als auch der Gabelgatter einen Mikromolaren anfassen und die Lösung vorsichtig mischen, indem Sie sie mindestens 20 Mal auf und ab pipettieren. Schließlich wird bei neun Mikrolitern 10 % Natrium duktales Sulfat verwendet, um eine Endkonzentration von 0,15 % SDS zu erreichen, die Reaktion durch mindestens 20-maliges Auf- und Abpipettieren sanft zu mischen, sofort die synthetischen Quarzzellen in die Kammer des Spektrenflöten zu legen und die Kinetikmessung zu starten. Fügen Sie nach fünf Minuten Messung drei Mikroliter der Eingangsstränge hinzu.Geben Sie 10 Mikromolare in die synthetische Quartzelle. Während das Datenerfassungsprogramm pausiert ist, mischen Sie die Reaktion vorsichtig, indem Sie sie mindestens 20 Mal auf und ab pipettieren, schließen Sie dann die Lichtabdeckung und fahren Sie mit der Aufzeichnung der Reaktionskinetik fort, bis sie stabil ist. Zustandskinetikdaten für die aus dem Plasma abgeleiteten Gates und die synthetisierten Gates werden hier in den Experimenten gezeigt.Die Konzentration des Signalstrangs A ist festgelegt, während die Menge des katalytischen Signals B variiert wird. Signal C wird verwendet, um den Verlauf der Reaktion ohne Unterbrechung auszulesen. Der katalytische Zyklusumsatz ist definiert als die Menge an Signal C, die für jeden Katalysator B zu einem bestimmten Zeitpunkt erzeugt wird.Für ein ideales katalytisches System sollte diese Umsatzzahl linear mit der Zeit ansteigen und unabhängig von der Katalysatormenge sein, solange das Substrat nicht begrenzt ist. Hier wird beobachtet, dass das synthetisierte System viel früher von der idealen linearen Umsatzsteigerung abweicht als das aus dem Plasma gewonnene System, was auf eine Sequestrierung des Katalysators durch eine unerwünschte Nebenreaktion hinweist. Die Leckage sowohl der aus dem Plasma gewonnenen als auch der synthetisierten Gates wird hier verglichen, und es wird beobachtet, dass das Verhältnis des Lecksignals unter Verwendung von Plasma-abgeleiteten Gates nach 10 Stunden Reaktion etwa 8% geringer ist als das von synthetisierten Gates.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie robuste DNA-Gates aus bakteriellen Plasmiden generieren und die Gates mit Fluoreszenzkinetikmessungen testen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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