Plasmid stammende DNA-Strand Displacement Gatter zum Implementieren Chemical Reaction Networks

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA-Strangverdrängungsgatter aus bakteriellen Plasmiden abzuleiten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie bakterielle Plasmide als hochreine Quelle verwendet, um robuste DNA-Gates zu erzeugen. Dieses Verfahren wird von meinen Kollegen Sam Dip und mir demonstriert: Mit der Massenproduktion beginnen und dann enthaltende DNA-Gates isolieren, indem DNA-Isolationskits verwendet werden, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben und in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers nach Ellucian.

Messen Sie die Konzentration von Plasmid-DNA mit Standardtechniken. Dann verdauen Sie die DNA, indem Sie für jedes Milligramm des Plasmids vier Einheiten des Restriktionsenzyms PV U2 HF hinzufügen. Als nächstes fügen Sie der Probe zwei äquivalente Volumina eiskaltes absolutes Ethanol hinzu.

Inkubieren Sie das Gemisch mindestens eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius, um die DNA auszufällen. Pelletieren Sie dann die gefällte DNA, indem Sie die Probe 30 Minuten lang bei 10.000 bis 14.000 G und null Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie das SNAT und geben Sie 1000 Mikroliter 95%iges Ethanol bei Raumtemperatur in die Probe.

Dann drehen Sie die Probe 10 bis 15 Mal um und zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 10.000 bis 14.000 G und vier Grad Celsius. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie die DNA 10 bis 20 Minuten lang an der Luft auf einer Bank. Achten Sie bei der Entfernung des Überstands aus der gefällten DNA darauf, das Pellet nicht zu stören, da sonst die Ausbeute erheblich verringert wird.

Nach dem Trocknen wird das DNA-Pellet in bis zu 200 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser resuspendiert und zum Mischen mit einem Wirbel vermischt. Die Zugabe von mehr als 200 Mikrolitern Wasser führt in der Regel dazu, dass die Probe für die Verwendung verdünnt wird. Messen Sie bei kinetischen Experimenten die resuspendierte DNA mit einem Spektralphotometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Fügen Sie dann vier Einheiten des Nicking-Enzyms M-B-B-S-R-D hinzu, eine pro Mikrogramm Plasmid, und fügen Sie den entsprechenden Enzympuffer hinzu. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius, um die Gelenktore zu verdauen. Als nächstes verdauen Sie die Gabelgatter, indem Sie acht Einheiten des Nicking-Enzyms NT BST mb, eine pro Mikrogramm Plasmid und den entsprechenden Enzympuffer hinzufügen.

Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius. Um die fluoreszierenden Reporter vorzubereiten, resusieren Sie zunächst die Proben, suspendieren und quantifizieren Sie sie, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie dann 10 Mikroliter des unteren Strangs des Reporters mit 13 Mikrolitern des oberen Quencherstrangs in Trisacetat-EDTA-Puffer mit 12,5 Millimolar Magnesium.

Um sicherzustellen, dass die gesamte Flora, also vier markierte Stränge, abgeschreckt werden, sollte ein Überschuss von 30 % des mit Quencher markierten Strangs hinzugefügt werden. Als nächstes wird der Reporter-C-Komplex mit einem Thermocycler aniliert. Kühlen Sie die Probe von 95 Grad Celsius auf 20 Grad Celsius mit einer Geschwindigkeit von einem Grad Celsius pro Minute ab.

Wenn Sie fertig sind, lagern Sie die Probe nach der Kalibrierung bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie mit den Fluoreszenzmessungen, indem Sie den Temperaturregler zunächst auf 25 Grad Celsius einstellen, während sich die Temperatur stabilisiert. Richten Sie die richtigen Parameter für kinetische Messungen in der Datenerfassungssoftware ein.

Nachdem Sie die Software für das spektrale Fluorimeter geöffnet haben, stellen Sie die Gleitbreite sowohl für die Anregung als auch für die Emission monochrom auf 2,73 Nanometer ein. Stellen Sie dann die Integrationszeit für jeden 62. Zeitpunkt auf 10 Sekunden und die Gesamtmesszeit auf 24 Stunden ein. Stellen Sie abschließend die Anregungs- und Emissionswellenlängen so ein, dass sie dem im Experiment verwendeten Florawald entsprechen.

Als nächstes fügen Sie 410,2 Mikroliter nukleasefreies Wasser und 52,8 Mikroliter 10 Extra-Acetat-EDTA-Puffer mit 125 Millimolar Magnesium zu einer synthetischen Quarzzelle hinzu. Fügen Sie außerdem zwei Mikroliter 300 millimolare Poly-T-Stränge hinzu und wirbeln Sie die synthetische Quarzzelle dann 10 bis 15 Sekunden lang durch. Weiter bei neun Mikrolitern der Reporterstränge bei 10 Mikromolaren und sechs Mikrolitern jedes Hilfsstrangs bei 10 Mikromolaren.

Dann bei 45 Mikrolitern sowohl des Gelenks als auch der Gabelgatter einen Mikromolaren anfassen und die Lösung vorsichtig mischen, indem Sie sie mindestens 20 Mal auf und ab pipettieren. Schließlich wird bei neun Mikrolitern 10 % Natrium duktales Sulfat verwendet, um eine Endkonzentration von 0,15 % SDS zu erreichen, die Reaktion durch mindestens 20-maliges Auf- und Abpipettieren sanft zu mischen, sofort die synthetischen Quarzzellen in die Kammer des Spektrenflöten zu legen und die Kinetikmessung zu starten. Fügen Sie nach fünf Minuten Messung drei Mikroliter der Eingangsstränge hinzu.

Geben Sie 10 Mikromolare in die synthetische Quartzelle. Während das Datenerfassungsprogramm pausiert ist, mischen Sie die Reaktion vorsichtig, indem Sie sie mindestens 20 Mal auf und ab pipettieren, schließen Sie dann die Lichtabdeckung und fahren Sie mit der Aufzeichnung der Reaktionskinetik fort, bis sie stabil ist. Zustandskinetikdaten für die aus dem Plasma abgeleiteten Gates und die synthetisierten Gates werden hier in den Experimenten gezeigt.

Die Konzentration des Signalstrangs A ist festgelegt, während die Menge des katalytischen Signals B variiert wird. Signal C wird verwendet, um den Verlauf der Reaktion ohne Unterbrechung auszulesen. Der katalytische Zyklusumsatz ist definiert als die Menge an Signal C, die für jeden Katalysator B zu einem bestimmten Zeitpunkt erzeugt wird.

Für ein ideales katalytisches System sollte diese Umsatzzahl linear mit der Zeit ansteigen und unabhängig von der Katalysatormenge sein, solange das Substrat nicht begrenzt ist. Hier wird beobachtet, dass das synthetisierte System viel früher von der idealen linearen Umsatzsteigerung abweicht als das aus dem Plasma gewonnene System, was auf eine Sequestrierung des Katalysators durch eine unerwünschte Nebenreaktion hinweist. Die Leckage sowohl der aus dem Plasma gewonnenen als auch der synthetisierten Gates wird hier verglichen, und es wird beobachtet, dass das Verhältnis des Lecksignals unter Verwendung von Plasma-abgeleiteten Gates nach 10 Stunden Reaktion etwa 8% geringer ist als das von synthetisierten Gates.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie robuste DNA-Gates aus bakteriellen Plasmiden generieren und die Gates mit Fluoreszenzkinetikmessungen testen können.