Name: Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Erfahren Sie eine markierungsfreie Methode zur raum-zeitlichen Abbildung von Proteinsekretionen einzelner Zellen mittels nanoplasmonischer Sensoren. Diese Technik ermöglicht präzise Einblicke in die interzelluläre Kommunikation.

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1. Nanostrukturen <ol><li> Wählen, Durchmesser 25 mm Glasdeckgläsern mit einer ungefähren Dicke von 170 (No. 1,5) &amp; mgr; m als Substrate zur Nanofabrikation. </li><li> Tauchen Sie die Deckgläser in Piranha-Lösung (3: 1 Verhältnis von Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid) für mindestens 6 Stunden. Mit reichlich Reinstwasser 18,2 MOhm entionisiertes destilliertes Wasser (DDW) Waschen Sie den piranha getränkt Deckglas. ACHTUNG: Piranha-Säure reagiert heftig mit organischen Materialien und müssen mit äußerster Vorsicht gehandhabt werden. </li><li> Beträgt 10 nm Chrom-Dünnfilm auf den Deckgläschen durch Elektronenstrahlverdampfung, um Ladungseffekte während der Strukturierung und Abbildung von Nanostrukturen zu vermeiden. </li><li> Drehen die erste Schicht der Doppelschicht Resist, bestehend aus Ethyllactat Methylmethacrylat (MMA_EL6) -Copolymer bei 2.000 rpm für 45 sec, und dann bei 150 ° C backen. Spin der zweiten Schicht aus Poly-Methylmethacrylat (950PMMA_A2) bei 3000 Upm für 45 sec bei 180 ° C backen. </li><li> Prasselnn die Doppelschicht Resist unter Verwendung des Elektronenstrahl-Lithographie (EBL) bei 25 kV mit einer Fläche von 300 &amp; mgr; C-Dosis / cm 2. Entwickeln Sie in Isopropylalkohol (IPA) / Methylisobutylketon (MIBK): 2/1 und spülen in IPA. </li><li> Ablagerung Ti (5 nm) / Au (80 nm) auf dem Substrat unter Verwendung eines E-Strahl-Verdampfer. </li><li> Nach der Goldabscheidung, heben Sie das Copolymer-Doppelschicht zu widerstehen durch Eintauchen des Substrats in Aceton 4 Stunden. </li><li> Überprüfen Sie das Substrat mit dem Rasterelektronenmikroskop (SEM), um Nanostruktur Form und Größe zu bestätigen, nehmen Sie das übrige Chrom aus dem Substrat über Nassätzung mit CR-7 Ätzmittel für 60 Sekunden bei Raumtemperatur und dann in DDW ausspülen. </li><li> Entwerfen Sie ein Mitte-zu-Mitte-Array-Abstand von 33 &amp; mgr; m, um Platz für Cell Imaging zwischen Arrays zu verlassen. Pattern die Nanostrukturen in 20 x 20 Muster für jedes Feld mit einem Abstand von 300 nm unter Verwendung eines E-Strahl-Schriftsteller. Jeder Chip enthält 300 Arrays mit einer typischen Nanostrukturdimension von 80 ± 2,5 nm Höhe und 70 ± 2,5 nm Durchter. </li><li> Inspizieren eine Untermenge von Anordnungen unter Verwendung des Atomkraftmikroskops (AFM) zur Überprüfung der Größe und Gleichförmigkeit. </li><li> Bringen Sie einen Stützring, in der Regel Silizium, auf der Rückseite des Deckglases mit einem UV-härtenden Epoxy. </li></ol> 2. Chip Reinigung und Anwendung von selbstorganisierten Monoschicht <ol><li> Zum Reinigen und Regenerieren der Chips, Plasma Asche bei einer Leistung von 40 W in einem 300 mTorr Gemisch aus 5% Wasserstoff, 95% Argon für 45 sec nach dem Reinigen der Kammer für 5 min unter den gleichen Bedingungen. </li><li> Funktionalisieren die Gold-Nanostrukturen unmittelbar nach Plasmaveraschung durch Eintauchen des Chips in einem Zweikomponenten-ethanolische Thiollösung bestehend aus einem 3: 1-Verhältnis von SH- (CH 2) 8 -EG 3 -OH (SPO) und eine Komponente mit entweder einem Amin oder carboxylfunktionelle Gruppe, nämlich SH- (CH 2) 11 -EG 3 -NH 2 (SPN) oder SH- (CH 2) 11 -EG 3 -COOH (SPC). </li><li> Verlassen Sie die Chip-in die Thiollösung O / N, um eine selbstorganisierte Monoschicht (SAM) zu bilden. </li><li> Spülen Sie den Chip mit Ethanol und mit Stickstoffgas trocken. </li><li> Falls erforderlich, speichern Sie die funktionalisierten Chip für bis zu 2 Wochen bei 4 ° C. </li><li> Wenn Sie bereit sind für den Einsatz reagieren die SPN oder SPC-Komponente mit dem Liganden unter Verwendung einer Chemie in Abhängigkeit von der Ligand der Wahl (siehe unten). Anmerkung: Die Chips können regeneriert und re-funktionalisierten Dutzende Male. Eine gegebene Chip kann für Zeiträume, die von 6 Monaten bis zu einem Jahr reichen eingesetzt werden. Die Spektren, gemessen an einem bestimmten Array werden zuverlässig nach wiederholten Regenerationen durch Plasmaveraschung, gefolgt von Biofunktionalisierung wiedergegeben. 29 </li></ol> 3. Oberflächenfunktionalisierung und kinetische Charakterisierung Hinweis: Mit der funktionalisierten Chip in das Handels SPR Instrument, um die Geschwindigkeitskonstanten zwischen dem Liganden und dem Analyten zu charakterisieren, als auch um den Widerstand der SAM, um unspezifische b studiereninding. Es gibt eine Vielzahl von Durchflussraten und mikrofluidischen Designs, die für eine effiziente Oberflächenfunktionalisierung ermöglichen. Da haben wir einen im Handel erhältlichen SPR wir standardisiert um seine empfohlene Durchflussmengen. Wir stellen fest, dass diese Flussraten sind typisch für alle SPR Instrumente und so sind nicht einschränkend. Die SPR-Gerät ist nicht notwendig, da alle Funktionalisierung kann direkt auf der LSPR-Chip durchgeführt werden, aber es hat zu reduzieren unsere Arbeitsbelastung, weil es ein Multiplex-Instrument ist, während unsere LSPR Mikrofluidik-Setup nicht. <ol><li> Funktionalisieren Kommerzielle blanken Goldchip mit dem SAM wie in Abschnitt 2 beschrieben. </li><li> Bei Verwendung eines SPC anhand SAM Aktivieren der Carboxylgruppe mit einem 1: 1-Mischung aus 133 mM 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) und 33 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) in DDW 10 Minute </li><li> Konjugieren des aktivierten Carboxylgruppe mit dem Antikörper / Liganden von Interesse für 300 Sekunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ul / min. Bereiten Sie die Liganden inpH 6 Phosphatpuffer, typischerweise, aber dies kann in Abhängigkeit von dem Molekül variieren. </li><li> Nach der Liga Konjugation, fließen 0,1 M Ethanolamin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) als ein Desaktivator für den Schritt 300 sec mit einer Rate von 30 ul / min. Ethanol hilft bei der Minimierung der nicht-spezifischen Bindung. </li><li> Präsentieren den interessierenden Analyten mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml / min mit einem Bereich von Konzentrationen und berechnen Sie die Geschwindigkeitskonstanten mit einer kinetischen Analyse-Software. </li><li> Wenn nicht-spezifische Bindung ist problematisch, erhöhen das Verhältnis der SPO zu SPC oder SPN. </li></ol> 4. LSPR Allgemeine Einstellungen <ol><li> Mikroskopeinstellungen: <ol><li> Verwenden Sie ein 100-W-Halogenlampe zu Koehler beleuchten die Probe. Verwenden Sie einen Langpassfilter (typischerweise 593 nm cutoff) in den Strahlengang, um Wellenlängen, die nicht auf die Resonanzverschiebung (Abbildung 2) beitragen, zu eliminieren. </li><li> Für die LSPRi Datensammlung, verwenden Sie ein inverses Mikroskop mit einem 40x Öl Immersion Ziel (1,4 NA) und einem thermoelektrisch gekühlten 16-Bit-CCD-Kamera. </li><li> Legen Sie einen Strahlteiler am Ausgang des Mikroskops zu Imagery und Spektren gleichzeitig zu erhalten. </li><li> Stellen Sie die Temperatur gesteuert Mikroskoptisch bis 37 ° C ins Gleichgewicht für 4 Stunden. </li><li> Beinhalten eine zusätzliche Inkubation Anordnung auf dem Mikroskop, um die CO 2 -Konzentration und der Feuchtigkeit auf 5% bzw. 95% zu regeln. </li></ol></li><li> Chip-Herstellung und Montage: <ol><li> Funktionalisierung der LSPR-Chip, wie in Abschnitt 2 mit den optimalen Zweikomponenten-SAM-Verhältnisse aus den SPR-Experimente bestimmt beschrieben. </li><li> Laden Sie den Chip in einem maßgeschneiderten mikrofluidischen Halter wie folgt. Platzieren Sie den Chip auf einer Aluminiumunterteil. Sandwich den Chip zwischen diesem Unterteil und einem Silikondichtung und einem durchsichtigen Kunststoff-Oberteil. Verwenden Sie 4 Schrauben, um die Montage zu klemmen. </li><li> Für eine typische SPC-basierte Anwendung Thiol, Tropfenlack 300 ul einer 1: 1-Mixtur von 133 mM EDC und 33 mM NHS in DDW die Carboxylgruppen des SPC Thiolkomponente zu aktivieren. </li><li> Warten Sie 10 min und die Oberfläche mit 10 mM PBS Hand spülen. </li><li> Konjugieren des aktivierten Carboxylgruppe mit dem Liganden (üblicherweise ein Antikörper oder Antikörper-Fragment) von Interesse durch Tropfbeschichtung 300 ul Ligandenlösung. </li><li> Warten Sie 30 Minuten und von Hand mit 10 mM PBS spülen. </li><li> Drop Mantel 300 ul 0,1 M Ethanolamin in PBS auf dem Chip nicht-spezifische Bindung zu minimieren. 10 Minuten warten. </li><li> Mit PBS, enthaltend 0,005% Tween 20 (PBS-T20), waschen Ethanolamin. </li><li> Legen Sie ein Quarzstück oberhalb des Chips, um Schwankungen in den Daten zu einem Wechsel Meniskus Verwandte reduzieren. </li><li> Halten Sie die Chip-nass mit PBS-T20-Puffer, während die Montage auf Mikroskop. </li><li> Setzen Sie den LSPR Chip-Montage fest in den beheizten Bühne Probenhalter und befestigen mikrofluidischen Schläuche. </li><li> Befestigen Sie den Schlauch an die Mikrofluidik Montage und Strömungs buffer (oder serumfreie Medien für Zellstudien), bis ein Gleichgewichtszustand erreicht ist. </li><li> Ermöglichen die Montage und Mikroskops, für mindestens 2 Stunden äquilibrieren. </li><li> Ausrichten der Chips mittels Joystick so dass der Zentralanordnung mit dem Lichtleiter zur Spektroskopie ausgerichtet sind. Spektroskopiedaten unter Verwendung eines Spektrometers und Spektralanalyse Software übernommen. </li><li> Halten Sie Arrays im Fokus während des gesamten Experiments unter Verwendung von Software-Autofokus, Zeiss Definite Focus oder gleichwertige Autofokuseinrichtung. </li></ol></li></ol> 5. LSPR Imaging von Anti-c-myc Sekrete aus 9E10 Hybridomzellen Anmerkung: Die Hybridomzellinie für diese Studie verwendete Ausdruck anti-c-myc-Antikörper konstitutiv und daher keine chemische Auslöser erfordern <ol><li> Funktionalisieren der Nanostrukturen mit c-myc-Peptid. Dies hat einen K D -Wert von 1,77 nM für die Anti-c-myc-Antikörper, die von Klon 9E10 Hybridom-Zellen sezerniert. </li><li> Kultur die Hybridomzellen in complete Wachstumsmedium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotikum in einem T75-Kolben bei 37 ° C unter 5% CO 2. Aufrechterhaltung einer Zelldichte von 4 × 10 5 Zellen / ml. </li><li> Für die Zellsekretion Studien Pellet Zellen von der T75-Flasche durch Zentrifugation, wasche zweimal mit RPMI-1640-serumfreiem Medium (SFM), um die sekretierten Antikörper zu entfernen, und Einstellen der Zelldichte auf 4 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Ernten Sie die Zellen und Test für die Lebensfähigkeit vor der Einführung sie an die LSPR-Chips. </li><li> Einzuführen 50 ul der Zelllösung von Hand auf den LSPR Chips mit einer Mikropipette. Nach wenigen Minuten 25 bis 50 Zellen haften an der Oberfläche der LSPR Chips. </li><li> Wegwaschen die restlichen Zellen in Lösung mit frischem SFM mit dem mikrofluidischen Perfusionssystem. </li><li> Wählen Sie die LSPR-Arrays für die Bildgebung, die in der Nähe sind, innerhalb von 10 &amp; mgr; m, aber nicht mit den Zellen überlappen. </li><li> Um sicherzustellen, dass das Signal spezifisch auf die sekretierten anti-c-myc ANTIB istodies Einführung der Zellkulturmedien mit und ohne die vorliegende Antikörpern sowie mit den Antikörpern, aber mit ihren Bindungsstellen durch die Anwesenheit einer sättigenden Konzentration von c-myc-Peptid in der Lösung blockiert. </li><li> Kalibrieren der Sensoren am Ende jedes Durchlaufs mit einer sättigenden Lösung von anti-c-myc-Antikörper (250 nM). Dies hilft bei der Normierung der Antwort der Sensoren und bestimmen fraktionale Besetzung bezogen auf die Biofunktionalisierung Profil von jedem Lauf. </li><li> Korrektur der Drift in der X- und Y-Richtung unter Verwendung der Bildausrichtung Software. </li></ol>

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<li>Bramswig, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Carcinoembryonic+Antigen+Activates+Endothelial+Cells+and+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis.</a> Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).</li>
</ol>

Wir danken George Anderson für hilfreiche Kommentare und Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom Institute for Nanoscience des Naval Research Laboratory und dem National Research Council Research Associateship Award unterstützt.

Das in dieser Arbeit beschriebene LSPR-Bildgebungsverfahren hat zahlreiche Vorteile gegenüber traditionelleren Methoden zum Nachweis von Zellsekreten. Erstens liegt die Zeitauflösung unserer Technik in der Größenordnung von Sekunden, während die kommerzielle Alternative, ein Immunosand-Assay, der als EliSpot bekannt ist, eine typische Zeitauflösung von 2 bis 3 Tagen hat. 7,32 Als Ergebnis konnten wir plötzliche Veränderungen in der Rate der Proteinsekretion auflösen, wie in Abbildung 6 gezeigt. Zweitens ermöglicht die Verteilung von Arrays über den Chip die Verfolgung des sekretierten Signals in Raum und Zeit, was einen genaueren Vergleich mit diffusionsbasierten Modellen der Zellsekretion ermöglicht. Darüber hinaus können Arrays wie das in Abbildung 6 gezeigte Kontrollarray verwendet werden, um globale Änderungen im Bild zu subtrahieren, die typischerweise durch instrumentelle Faktoren wie Fokusdrift entstehen. Drittens erfordert unsere Technik keine Modifikation der Zellen. Falls gewünscht, kann das Experiment häufig verwendete Tags wie fluoreszierende Proteine einbeziehen, aber wenn Bedenken bestehen, dass solche Tags die Zellviabilität oder die Homöostase negativ beeinflussen könnten, sind sie aufgrund der markierungsfreien Natur unseres Ansatzes nicht erforderlich. Viertens haben wir mit Hilfe der spektroskopischen Daten gezeigt, dass quantitative Informationen über die fraktionelle Belegung von oberflächengebundenen Liganden berechnet werden können.
Es gibt zahlreiche alternative Methoden zu EBL zur Herstellung von metallischen Nanopartikeln. Wir haben jedoch festgestellt, dass die EBL eine beträchtliche Flexibilität bei der Optimierung der Nanostruktur und der Array-Abmessungen bietet, um die Optik und die zu untersuchenden Zellen optimal zu unterstützen. Entscheidend ist auch, dass die Chips durch Plasmaveraschung leicht regeneriert werden können. Auf diese Weise kann ein typischer Chip dutzende Male verwendet werden. Die Details der Biofunktionalisierung müssen für die jeweilige Anwendung modifiziert werden. Das hier vorgestellte Protokoll konjugierte die Oberfläche mit relativ kleinen c-myc-Peptidliganden. Größere Liganden, wie z. B. ganze Antikörper, erfordern in der Regel mehr Abstand und damit ein höheres Verhältnis von SPO zu SPN/SPC. Unabhängig davon ist eine gut ausgebildete SAM-Schicht unerlässlich, um unspezifische Bindungen in Lebendzellexperimenten zu verhindern. Im Allgemeinen werden Analyten mit größerem Molekulargewicht mit LSPR leichter nachgewiesen. Daher ist diese Technik in ihrer Einzelzellmanifestation möglicherweise nicht geeignet, um die Sekretion von kleinen Proteinen, wie z. B. Zytokinen, nachzuweisen. 
Der aktuelle Aufbau wurde für die Untersuchung einzelner nicht-adhärenter Zellen verwendet. Es gibt eine signifikante Anzahl von sezernierten Signalproteinen und Vesikel, auf die die in dieser Arbeit berichteten Ergebnisse direkt anwendbar sind. Zum Beispiel das karzinoembryonale Antigen (CEA), das seit Jahrzehnten ein diagnostischer Marker für Krebs ist. Es ist bekannt, dass Darmkrebszellen CEA mit einer Geschwindigkeit von Tausenden von Molekülen/Zelle/Stunde sezernieren, und das Molekulargewicht beträgt 180 kDa, was das von IgG-Antikörpern übersteigt. Es wird angenommen, dass CEA an autokrinen und parakrinen Signalwegen beteiligt ist, aber die räumlich-zeitliche Natur dieser Sekrete wurde noch nie gemessen. Unsere Technik kann diese Signalfragen direkt beantworten. Eine Erweiterung dieser Arbeit wird darin bestehen, die räumlich-zeitliche Natur der CEA-Sekretion aus einzelnen Zellen zu messen. 33 Zukünftige Arbeiten werden sich auch auf die Integration von LSPRi in zwei- und dreidimensionale Zellkulturen adhärenter Zellen konzentrieren. Durch die Integration von Multiplex-Arrays, die in der Lage sind, eine Reihe von sekretierten Proteinen parallel zu detektieren, hat diese Technik das Potenzial, ein neues Fenster in die Zellsekrete und deren Einfluss auf benachbarte Zellen zu öffnen.

Interzellulären Kommunikation ist wichtig für die Regulierung von vielen physiologischen Aktivitäten innerhalb und außerhalb der Zelle. Eine Vielzahl von Proteinen und Vesikel können ausgeschieden werden, daß anschließend auslösen komplexen zellulären Prozessen wie Differenzierung, Wundheilung, Immunantwort, Migration und Proliferation. 1-5 Störungen des interzelluläre Signalwege sind bei zahlreichen Erkrankungen einschließlich Krebs, Atherosklerose in Verbindung gebracht und Diabetes, um nur einige zu nennen. Die optimale Zellsekretion Test sollte in der Lage, räumlich und zeitlich Kartierung des sekretiertes Protein von Interesse ohne Beeinträchtigung der entsprechenden Signalwege sein. Auf diese Weise kann kausalen Beziehungen zwischen den Konzentrationsprofilen und der Reaktion der Aufnahmezellen ableiten. Leider sind viele der am häufigsten verwendeten fluoreszierenden basierende Techniken nicht diese Kriterien erfüllen. Fluoreszierende Fusionsproteine ​​können verwendet werden, um den Analyten zu markieren, werden wnnerhalb die Zelle kann aber den sekretorischen Weg zu stören, oder sezerniert wird, ergibt sich ein diffuses Glühen außerhalb der Zelle, die schwierig zu quantifizieren ist. Fluoreszenz immunosandwich basierende Tests sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum Erfassen der Zellabsonderungen aber typischerweise die Isolation einzelner Zellen 6-11. Darüber hinaus ist die Einführung des Fühl Antikörper typischerweise anhält oder endet, das Experiment und die Größe der Antikörper markiert, 150 kDa für IgG ist ein Hindernis für die nachgeschalteten Signal. Wegen dieser Hindernisse ist es vorzuziehen, dass eine markerfreie Technik zur Bild Protein Sekreten und unter den bestehenden Label-freie Technologien verwendet werden, Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) Sensoren sind ausgezeichnete Kandidaten. 12-17 Diese Sensoren sind in großem Umfang für Analyt-Bindungsstudien von Proteinen, Exosomen und andere Biomarker verwendet. 18-24 Bei LSPR, das Plasmonen nanostructures können lithographisch auf Deckgläser strukturiert und aufgeregt mit sichtbarem Licht über Standard-Weitfeldmikroskopie Konfigurationen werden. Aufgrund ihrer nanoskaligen Platz, ist der Hauptteil des Glassubstrats für gemeinsame Abbildungstechniken wie Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie Herstellung dieser Sonden gut für die Integration mit Lebendzell-Mikroskopie geeignet erhältlich. 25-28 Wir haben die Echtzeitmessung nachgewiesen Antikörpersekrete aus Hybridomzellen funktionalisierte Gold plasmonic Nanostrukturen mit räumlichen und zeitlichen Auflösung von 225 msec und 10 um betragen. Der grundlegende Chip-Konfiguration ist in 1 veranschaulicht. 28 die Ausgangsstrahlengang des Mikroskops zwischen einer CCD-Kamera zur Bild verwendet und ein faser optisch gekoppelten Spektrometer für die quantitative Bestimmung von fraktionale Besetzung einer gegebenen Anordnung von Nanostrukturen (Abbildung 2 aufgeteilt ). Die Protocol in diesem Papier wird die Versuchsanordnung zur Echtzeitmessung von Einzelzellsekrete, während gleichzeitig die Kontrolle der Reaktion der Zellen unter Verwendung des Standardhellfeldmikroskopie. Der multidisziplinäre Ansatz umfasst die Herstellung von Nanostrukturen, Funktionalisierung der Nanostrukturen für die hochaffine Bindung von Analyten, Oberflächenoptimierung sowohl für die Minimierung nicht-spezifische Bindung und Charakterisierung von Geschwindigkeitskonstanten unter Verwendung eines kommerziellen Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Instrument, die Integration von Zelllinien auf das Substrat, und die Analyse der Bilder und Spektraldaten. Wir erwarten, dass diese Technik, um eine Technologie für die räumlich-zeitliche Zuordnung der Zellsekrete und ihrer kausalen Beziehungen mit Aufnahmezellen sein.

<table><tbody><tr><td>25&#160; Glasdeckgläser mit mm Durchmesser Bioscience</td><td>Tools&nbsp;</td><td>CSHP-Nr. 1.5-25</td><td>&nbsp; 170&plusmn; 5 & Mikro; m ist optimal</td></tr><tr><td>Polymethylmethacrylat</td><td>Microchem</td><td>PMMA 950 A4</td><td></td></tr><tr><td>Ethyllactatmethylmetacrylat</td><td>Microchem</td><td>MMA EL6</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenstrahlverdampfer</td><td>Temescal</td><td>FC-2000</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenstrahllithographie</td><td>Raith</td><td>Serie 150</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320110</td><td></td></tr><tr><td>CR-7 Chromätzmittel</td><td>Cyantek</td><td>CR-7</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td></td></tr><tr><td>Rasterkraftmikroskop</td><td>Veeco</td><td>Nanoscope III</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Veraschungssystem</td><td>Technics</td><td>Series 85 RIE</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)</td><td>Prochimia</td><td>TH 001-m8.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)11EG3-COOH (SPC)</td><td>Prochimia</td><td>TH 003m11n3-0.1</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)</td><td>Prochimia</td><td>TH 002-M11.N3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>Oberflächenplasmonen-Resonanzsystem</td><td>Biorad</td><td>XPR36</td><td></td></tr><tr><td>Bare-Gold-Chip</td><td>Biorad</td><td>GLC-Chip</td><td>Plasma-Asche zur Entfernung der Monoschicht</td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid</td><td>Thermo</td><td>22980<</td><td></td></tr><tr><td>em>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Pentylamin-Biotin &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21345</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Neutraavidin</td><td>Thermo</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Thermo</td><td>28374</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td>Das Mikroskop ist mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv ausgestattet. CO2 und Feuchtigkeitsinkubation von Pecon GmbH</td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca R2</td><td>Thermoelektrisch gekühlt (16 bit)</td></tr><tr><td>Spektrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>QE65Pro</td><td></td></tr><tr><td>Spectrasuite</td><td>Ocean</td><td>Optics Version1.4</td><td></td></tr><tr><td>c-myc Peptid HyNic Tag</td><td>Solulink</td><td>SP-E003</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-c-myc Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4439</td><td></td></tr><tr><td>Hybridom-Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-1729</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotische Antimykotikum Lösung (100&mal;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Serum freie Medien RPMI 1640&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11835-030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin DHPE</td><td>Life Technologies</td><td>L-1392</td><td></td></tr></tbody></table>

ein markierungsfreie technik für die raum-zeitliche imaging von single cell sekrete

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Interzelluläre Kommunikation ist ein integraler Bestandteil eines komplexen Systems, das bei der Aufrechterhaltung grundlegender zellulärer Aktivitäten hilft. Infolgedessen kann die Fehlfunktion einer solchen Signalübertragung zu vielen Störungen führen. Um die Signalübertragung von Zelle zu Zelle zu verstehen, ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Natur der aus der Zelle sezernierten Moleküle zu untersuchen, ohne die lokale Umgebung zu stören. Um die Proteinsekretion zu untersuchen, wurden verschiedene Assays entwickelt, die jedoch in der Regel auf Fluoreszenzsonden basieren, die die relevanten Signalwege stören. Um diese Einschränkung zu überwinden, ist eine markierungsfreie Technik erforderlich.
In diesem Artikel beschreiben wir die Herstellung und Anwendung einer markierungsfreien lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanztomographie (LSPRi)-Technologie, die in der Lage ist, Proteinsekrete aus einer einzelnen Zelle zu detektieren. Die plasmonischen Nanostrukturen sind lithographisch auf ein Standard-Glasdeckglas aufgebracht und können mit kommerziell erhältlichen Lichtmikroskopen mit sichtbarem Licht angeregt werden. Nur ein kleiner Teil des Deckglases wird von den Nanostrukturen bedeckt, so dass sich diese Technik gut für die Kombination gängiger Techniken wie Fluoreszenz- und Hellfeld-Bildgebung eignet.
In diesem Protokoll wird ein multidisziplinärer Ansatz verwendet, der die Nanofabrikation von Sensoren und die anschließende Biofunktionalisierung, die Charakterisierung der Bindungskinetik von Liganden und Analyten, die Integration des Chips und der lebenden Zellen sowie die Analyse des gemessenen Signals umfasst. Insgesamt ermöglicht diese Technologie einen allgemeinen, markierungsfreien Ansatz zur Kartierung zellulärer Sekrete und deren Korrelation mit den Reaktionen benachbarter Zellen.

In einem typischen Live Zellsekretion Studie gibt es mehrere Betriebsarten der Datensammlung stattfindet, Fig. 3 zeigt eine Überlagerung von einer LSPRi Bild, das die quadratische Anordnungen herausstellt, und ein übertragenes Lichtbild belichtet, die die Zelle an der linken unteren hervorhebt. Daten werden typischerweise über eine 3-Stunden-Periode, gefolgt von der Einführung einer sättigenden Lösung des Analyten für den unten beschriebenen Normalisierungsberechnung gesammelt. Fluoreszenzbilder können auch durch das automatische Schalten eines Filterwürfel in die Datensammelroutine integriert werden. In Figur 4 eine Zelle mit dem fluoreszierenden Membranfarbstoff Rhodamin DHPE gefärbten aufweist Lamellipodia artigen Verlängerungen (Pfeile). Wenn solche Erweiterungen sollten mit den Arrays überlappen sie ein falsch-positiv für Protein-Sekretion geben würde. Nachdem mehrere Modi der Bildsprache kann dazu beitragen, solche Vorkommnisse. Figur 5 zeigt Spektrometrie Daten vor und achterner die Einführung einer sättigenden Lösung (400 nM) von kommerziell erworben anti-c-myc-Antikörper gegen den c-myc-funktionalisierten Arrays. Es wurden keine Zellen in diesem Versuch vor. Das Spektrum zeigt sowohl eine Rotverschiebung und eine Zunahme der Intensität. Die Differenz der Flächen unter den beiden Kurven führt zu einem Anstieg in der Anordnung der Bildintensität in LSPRi Modus auf der CCD-Kamera. Eine nichtlineare Kleinste-Quadrate-Datenanalyseansatz wurde entwickelt, um fraktionale Besetzung der Oberfläche gebundenen Liganden aus der Spektren herzuleiten. 30,31 Am Ende des Experiments wurden die gesättigten Intensitätswerte (dh fraktionale Besetzung ≈ 1) verwendet werden, um eine normierte Antwort für jedes Feld unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Wo sind die normierte Intensität zum Zeitpunkt t, Anfangsintensität zu Beginn des Versuchs, endgültige gesättigte Intensität und gemessene Intensität des Arrays zum Zeitpunkt t </em&gt; sind. Normalisierte Werte von zwei Anordnungen sind in Fig. 6 gezeigt ist eine Anordnung innerhalb von 10 &amp; mgr; m der Zelle in Untersuchung während der andere, als Kontrolle verwendet wurde, war ein Abstand von 130 um aus der Zelle. Der plötzliche Anstieg der normalisierten Antwort der Anordnung am nächsten an der Zelle relativ zu dem flachen Verlauf der Steueranordnung ist ein Hinweis auf eine lokalisierte Explosion der sekretierten Antikörper. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig1.jpg" /> Abbildung 1. Sensor-Design. Eine Zeichnung, die die Geometrie eines typischen Live-Cell-Sekretion Experiments. Die Zelle (blau Sphäroid) wird an den LSPR-Chip, der Arrays von biofunktionalisierten Gold-Nanostrukturen enthält, abgeschieden. In der vergrößerten Ansicht der Zelle Sekretion von Interesse, in diesem wie Y-förmige Moleküle gezeigten Fall Antikörper, wird gemessen, wie sie an die Oberfläche bindender funktionalisierten Nanostrukturen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig2.jpg" /> Abbildung 2. Optical-Setup. Das beleuchtete Licht aus einer Halogenlampe wird zunächst durch einen Langpassfilter (LP) filtriert. Das Licht wird linear polarisiert (P1) und beleuchtet die Probe über ein 40X / 1,4 NA-Objektiv. Das gestreute Licht wird durch das Objektiv durch einen gekreuzten Polarisator (P2) gesammelt und weitergeleitet. Eine 50/50 Strahlteiler (BS) in den gesammelten Lichtpfad zum gleichzeitigen spektroskopischen und Bildanalyse eingesetzt. Oben rechts:. Ein Rasterkraftmikroskopie Bild von 9 individuellen Nanostrukturen mit einem Abstand von 300 nm abgetrennt <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a>um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig3.jpg" /> Abbildung 3. Live Cell LSPRi Study. A verschmolzen Durchlicht und LSPRi Bild, das einen einzigen Hybridomzelllinie (unten links) um 12 Arrays umgeben. Dies ist eine kontrastverstärkten Bild. Maßstabsbalken ist 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig4.jpg" /> Abbildung 4. Live Cell Fluorescence Studie. Eine Leuchtstofffalschfarbenbild eines einzelnen Hybridomzelllinie mit Rhodamin DHPE, die eine Membran-Farbstoff angefärbt. In Fluoreszenz-Imaging-Modus die Arrays sind im Allgemeinen nicht sichtbar ist, ist jedoch ein in der Nähe Array hier beobachten, wie abfehlt Quadrat in der rechten unteren Ecke. Die Zelle kann gesehen werden, aus dem Array obwohl tentakelartige Verlängerungen (möglicherweise Filopodien oder Lamellipodia) nach außen von den Zellen (Pfeile), die sich trennen. Maßstabsbalken ist 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig5.jpg" /> Figur 5. Spectral Modalität. Die von einem c-myc-funktionalisierten Array vor und nach der Einführung von 400 nM Lösung von anti-c-myc-Antikörper erhaltenen Spektren. Keine Zellen in dieser Studie vor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src= &quot;/ files / ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg&quot; /&gt; Abbildung 6. Single Cell-Sekretion. Die Antwort eines Arrays innerhalb von 15 &amp; mgr; m aus einer einzigen Zelle und eines sich 130 &amp; mgr; m entfernt (Kontrolle) entfernt. Maßstabsbalken ist 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Interzellulären Kommunikation ist wichtig für die Steuerung verschiedener physiologischer Aktivitäten innerhalb und außerhalb der Zelle. Dieser Aufsatz beschreibt ein Protokoll zum Messen der räumlich-zeitliche Art der Einzelzellsekrete. Um dies zu erreichen, ist ein multidisziplinärer Ansatz verwendet, der markierungsfreien nanoplasmonische Erfassung mit Live Cell Imaging integriert.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Proteinausscheidung einzelner Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu messen. Dies wird erreicht, indem mittels Lithografie goldene plasmonische Nanosensoren auf Glasdeckeln hergestellt werden, um die markierungsfreie Abbildung von Einzelzell-Ausscheidungen zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt wird der Sensorchip gereinigt und mit einer selbstassemblierten Monoschicht beschichtet, anschließend wird er mit Liganden funktionalisiert, die eine hohe Affinität zu den sezernierten Analytproteinen aufweisen.Anschließend werden Zellen auf funktionalisierte Sensorchips integriert, um ihre Sekretionen räumlich und zeitlich zu messen. Die Ergebnisse zeigen, dass Proteinsekretionen einzelner Zellen sowohl räumlich als auch zeitlich abgebildet werden können, ohne dass eine Markierung erforderlich ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der interzellulären Kommunikation zu beantworten, beispielsweise, wie parakrine und autokrine Signalwege die Zellmotilität steuern.Um dieses Verfahren zu beginnen, wird ein 10 Nanometer dünner Chromfilm auf zuvor gereinigten Deckgläsern durch Elektronenstrahlverdampfung abgeschieden, um Ladungseffekte während der Strukturierung und Abbildung von Nanostrukturen zu vermeiden. Danach wird die erste Schicht des Zweischicht-Resists aus Ethyllaktat, Methylmethacrylat-Copolymer bei 2000 U/min für 45 Sekunden aufgespint. Anschließend wird das Substrat nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur bei 150 Grad Celsius ausgeglüht.Die zweite Schicht aus Polymethylmethacrylat mit 3000 U/min für 45 Sekunden auftragen und das Substrat bei 150 Grad Celsius aushärten. Strukturierung des Zweischicht-Resists mittels Elektronenstrahllithografie oder EBL. Mit Isopropylalkohol oder IPA und Methylisobutylketon oder MIBK im Verhältnis zwei zu eins entwickeln und mit IPA nachspülen.Entfernen Sie Chrom aus dem strukturierten Bereich der Nanostrukturen durch nasse Ätzung mit CR Seven-Ätzer für 10 Sekunden bei Raumtemperatur und spülen Sie anschließend mit entionisiertem, destilliertem Wasser ab. Sputtern Sie einen Titan-Gold-Film auf das Substrat auf, indem Sie den Elektronenstrahl-Verdampfer nach der Goldabscheidung verwenden. Lösen Sie die Copolymer-Bilage durch Einweichen des Substrats in Aceton über vier Stunden ab.Als Nächstes untersuchen Sie das Substrat mithilfe eines Rasterelektronenmikroskops, um Form und Größe der Nanostruktur zu bestätigen. Die resultierenden Nanostrukturen sind typischerweise durch einen Abstand von 300 Nanometern voneinander getrennt. 20 × 20-Arrays von Nanostrukturen weisen einen mittelpunktbezogenen Abstand von 30 Mikrometern auf.Um ausreichend Platz für die Zellbildgebung zu schaffen, enthält ein typischer Chip 300 Arrays. Entfernen Sie das verbleibende Chrom vom Substrat mittels Nassrandschritt unter Verwendung von CR Seven-Ätzmittel für 60 Sekunden bei Raumtemperatur. Anschließend spülen Sie das Substrat mit entionisiertem destilliertem Wasser ab.Danach überprüfen Sie eine Teilmenge der Arrays mithilfe des Rasterkraftmikroskops, um Größe und Gleichmäßigkeit zu verifizieren. Dieser strukturierte Deckglasmikroskopträger kann mehrfach verwendet werden, solange die entsprechenden Reinigungsverfahren zur Reinigung und Regenerierung der lokalisierten Oberflächenplasma- und Resonanzchips (LSPR) eingehalten werden. Plasma-Ätzung bei einer Leistung von 40 Watt in einer 300 Milli umfassenden Mischung aus 5 % Wasserstoff und 95 % Argon für 45 Sekunden.Funktionalisieren Sie die Goldoberfläche und die Nanostrukturen unmittelbar nach dem Plasma-Ätzen, indem Sie den Chip in eine zweikomponentige Ethanollösung aus Thiolen mit einem Verhältnis von drei zu eins aus SPO und SPC eintauchen. Nachdem der Chip über Nacht in der Thiolösung belassen wurde, um eine selbstorganisierte Monoschicht zu bilden, spülen Sie ihn mit Ethanol ab und trocknen ihn mit Stickstoffgas. Bringen Sie den LSPR-Chip in einem eigens angefertigten mikrofluidischen Halter unter, indem Sie den Chip auf ein Aluminium-Unterteil legen.Dann klemmen Sie den Chip mithilfe von vier Schrauben zwischen diesem unteren Teil, einer Silikondichtung und einem durchsichtigen Kunststoffdeckel. Für eine typische SPC-basierte Thiol-Anwendung geben Sie 300 µL einer 1:1-Mischung aus 133 mmolarem EDC und 33 mmolarem NHS in deionisiertem destilliertem Wasser auf, um die Carboxylgruppen der SPC-Thiol-Komponente zu aktivieren. Nach einer Wartezeit von 10 Minuten spülen Sie die Oberfläche manuell mit 10 mmolarer PBS ab, anschließend konjugieren Sie die aktivierten Carboxylgruppen durch Aufgeben von 300 µL der Ligandenlösung an den Liganden der Wahl.Nach einer Wartezeit von einer Stunde und Spülen der Oberfläche mit 10 Millimolar PBS-Tropfencode werden 300 Mikroliter 0,1 molar Ethanolamin in PBS auf den Chip gegeben, um unspezifische Bindungen zu minimieren. Nach einer Wartezeit von 10 Minuten wird das Ethanolamin mit PBS, das 0,005 % Tween 20 oder PBST 20 enthält, abgewaschen. Danach wird ein Quarzstück über den Chip platziert, um Schwankungen in den Daten aufgrund eines sich verändernden Meniskus zu reduzieren.Halten Sie den Chip während der Montage am Mikroskop mit PBST 20-Puffer benetzt. Schließen Sie die mikrofluidische Schlauchleitung an die Vorrichtung an und leiten Sie Puffer, bis ein stationärer Zustand erreicht ist. Danach setzen Sie die LSPR-Chip-Vorrichtung fest in den Probenträger der beheizten Probebühne ein.Die optische Anordnung für diese Methode ist hier dargestellt. Das Licht der Halogenlampe wird durch einen 593 Nanometer langwelligen Durchlassfilter geleitet, um Wellenlängen zu eliminieren, die nicht zur nano-plasmonischen Antwort beitragen. Das Licht wird anschließend linear polarisiert und die Probe wird über ein Objektiv mit 40-facher Vergrößerung und einer numerischen Apertur von 1,4 zur Anregung der plasmonischen Goldnanostrukturen beleuchtet.Das gestreute Licht wird vom Objektiv gesammelt und durch einen gekreuzten Polarisator geleitet, um das Hintergrundsignal des Glas-Substrats zu reduzieren. Ein 50-50-Strahlteiler wird in den gesammelten Lichtpfad eingebracht, um gleichzeitige spektroskopische und bildgebende Analysen durchzuführen. Nachdem die Anordnung und das Mikroskop mindestens zwei Stunden lang zum Gleichgewicht gekommen sind, richten Sie den Chip mithilfe des Joysticks aus, sodass die zentrale Anordnung mit der Glasfaser für die Spektroskopie ausgerichtet ist.Nachdem die hybriden DOMA-Zellen kultiviert und durch Zentrifugation pelletiert wurden, sammeln Sie sie ein und prüfen anschließend die Lebensfähigkeit, bevor Sie sie auf die LSPR-Chips aufbringen. Danach geben Sie manuell 50 Mikroliter der Zellsuspension mit einer Mikropipette auf die LSPR-Chips. Schließlich spülen Sie die verbleibenden Zellen in Lösung mit frischem, serumfreiem Medium mittels eines mikrofluidischen Perfusionsystems ab, um die LSPR-Chips für die Bildgebung vorzubereiten.Hier ist eine Überlagerung eines LSPR-Bildgebungs-Bildes zu sehen, das die quadratischen Arrays hervorhebt, und eines durchtransmittierten beleuchteten Bildes, das die Zelle unten links betont. Eine Zelle, die mit dem fluoreszierenden Membranfarbstoff rodamin DHPE angefärbt wurde, weist fadenförmige Fortsätze auf. Wenn solche Fortsätze mit den Arrays überlappen würden, ergäbe sich ein falsch-positives Ergebnis für die Proteinausscheidungs-Spektrometriedaten. Vor und nach der Zugabe einer sättigenden Lösung von anti-cmic-Antikörpern zu den cmic-funktionalisierten Arrays wird dies hier dargestellt.Diese Methode wird zur Kalibrierung der Arrays verwendet. Die Kalibrierung der Arrays hilft dabei, die Antwort der Sensoren zu normalisieren und die fraktionale Besetzung basierend auf dem biofunktionalisierten Profil jedes Durchlaufs zu bestimmen. Ein kommerzielles SPR-Gerät wird verwendet, um die Dissoziationskonstante zu ermitteln sowie die Resistenz gegenüber unspezifischer Bindung mithilfe desselben Protokolls wie für den LSPR-Chip zu untersuchen.Normalisierte Werte von zwei Arrays werden hier gezeigt. Ein Array befand sich innerhalb von 10 Mikrometern von der Zelle, während die Kontrolle 130 Mikrometer von der Zelle entfernt war. Der plötzliche Anstieg der normalisierten Antwort des dem Zellnäheren Arrays im Vergleich zur flachen Antwort des Kontrollarrays deutet auf eine lokalisierte Freisetzung von Antikörpern hin.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteinausscheidungen einzelner Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung gemessen werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video demonstriert die lokalisierte Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie, um Proteinsekrete von einer einzelnen Zelle zu detektieren. Unter Verwendung eines mikrofluidischen Aufbaus und eines peptidgebundenen plasmonischen Nanostruktur-Chips zeigen Änderungen der reflektierten Lichtintensität am Resonanzwinkel Wechselwirkungen mit sezernierten Proteinen aus einer einzelnen Zelle.

Lokalisierte Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie zum Nachweis von Proteinsekreten aus einer einzelnen Zelle

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

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Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Um die Strömungsgeschwindigkeiten und die Richtungsabhängigkeit von filamentösem Aktin an der immunologischen T-Zell-Synapse zu untersuchen, wird die hochauflösende Bildgebung lebender Zellen mit Totalreflexionsfluoreszenz kombiniert und mit räumlich-zeitlicher Bildkorrelationsspektroskopie quantifiziert.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Ein mikrofluidischer Chip wurde hergestellt, um Paare von Goldpunkten für die Tandem-Blasenerzeugung und Fibronektin-beschichtete Inseln für die Einzelzellstrukturierung in der Nähe herzustellen. Das resultierende Strömungsfeld wurde durch Particle Image Velocimetry charakterisiert und zur Untersuchung verschiedener Bioeffekte eingesetzt, einschließlich der Zellmembranporation, der Membranverformung und der intrazellulären Calciumreaktion.

Einem mikrofluidischen System mit Oberflächenstrukturierung zur Untersuchung Kavitationsblase (e) -Cell Interaktion und die Resultierende Bioeffects auf der Ebene einzelner Zellen

Wir präsentieren ein Protokoll für die Echtzeit-optische Erkennung von einzelnen unbeschriftete Proteine, wie sie von lebenden Zellen abgesondert werden. Grundlage hierfür ist interferometrischen Streuung (iSCAT) Mikroskopie, die auf eine Vielzahl von unterschiedlichen biologischen Systemen und Konfigurationen angewendet werden können.

Markierungsfreie Imaging der einzelnen Proteine abgesondert von lebenden Zellen über iSCAT Mikroskopie

Die 3D-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie wird verwendet, um die räumlichen Positionen und Bewegungsbahnen fluoreszierend markierter Proteine in lebenden Bakterienzellen zu untersuchen. Das hier beschriebene experimentelle und Datenanalyseprotokoll bestimmt das vorherrschende diffusive Verhalten von zytosolischen Proteinen auf der Grundlage gepoolter Einzelmolekülbahnen.

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Die Live-Bildgebung der lysosomalen Exozytose auf mikromusterten Zellen ermöglicht eine räumliche Quantifizierung dieses Prozesses. Morphologie-Normalisierung mit Mikromustern ist ein hervorragendes Werkzeug, um allgemeine Regeln über die räumliche Verteilung zellulärer Prozesse aufzudecken.

Quantifizierung der raumzeitlichen Parameter der zellulären Exozytose in mikrogemusterten Zellen

Wir stellen eine Methode zur Erfassung von Fluoreszenz-Reporter-Zeitkursen aus einzelnen Zellen mit mikrostrukturierten Arrays vor. Das Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Einzelzellarrays, den Aufbau und Betrieb der Live-Cell-Scanning-Zeitraffermikroskopie und ein Open-Source-Bildanalyse-Tool zur automatisierten Vorauswahl, visuellen Kontrolle und Verfolgung von zellintegrierten Fluoreszenzzeitverläufen pro Adhäsionsstelle.

Live-Cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - eine vielseitige Technik zur Quantifizierung der zellulären Kinetik

Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

Erfahren Sie eine markierungsfreie Methode zur raum-zeitlichen Abbildung von Proteinsekretionen einzelner Zellen mittels nanoplasmonischer Sensoren. Diese Technik ermöglicht präzise Einblicke in die interzelluläre Kommunikation.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

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