Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Proteinsekretion von einzelnen Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu messen. Dies wird durch lithographisch hergestellte plasmonische Gold-Nanosensoren auf Glasdeckgläsern für die markierungsfreie Abbildung von Einzelzellsekreten erreicht. In einem zweiten Schritt wird der Sensorchip gereinigt und mit der selbstorganisierenden Monoschicht beschichtet und anschließend mit Liganden funktionalisiert, die eine hohe Affinität zu den sezernierten Analytproteinen aufweisen.

Als nächstes werden Zellen auf die funktionalisierten Sensorchips integriert, um ihre Sekrete in Raum und Zeit zu messen. Die Ergebnisse zeigen, dass Proteinsekrete aus einzelnen Zellen sowohl räumlich als auch zeitlich kartiert werden können, ohne dass eine Markierung erforderlich ist. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der interzellulären Kommunikation zu beantworten, z. B. wie parakrine und autokrine Signalwege die Zellmotilität steuern.

Um dieses Verfahren zu starten, wird ein 10 Nanometer dünner Chromfilm durch Elektronenstrahlverdampfung auf zuvor gereinigte Deckgläser aufgebracht, um Ladungseffekte bei der Strukturierung und Abbildung von Nanostrukturen zu vermeiden. Nach dieser Drehung widersteht die erste Schicht der Doppelschicht, die aus Ethyllactat, Methylmethacrylat-Copolymer besteht, bei 2000 U/min für 45 Sekunden. Dann backen Sie das Substrat bei 150 Grad Celsius, nachdem Sie es auf Raumtemperatur abkühlen ließen.

Schleudern Sie die zweite Schicht Polymethylmethacrylat bei 3000 U/min für 45 Sekunden und backen Sie das Substrat bei 150 Grad Celsius. Der Doppelschicht-Resist erfolgt mittels Elektronenstrahllithographie oder EBL. Entwickeln Sie einen Isopropylalkohol oder IPA-Methylisobutylketon oder MIBK im Verhältnis zwei zu eins und spülen Sie es in IPA.

Entfernen Sie Chrom aus dem entwickelten Bereich der Nanostrukturen durch Nassätzen mit CR-Sieben-Ätzen für 10 Sekunden bei Raumtemperatur und spülen Sie es dann in deionisiertem, destilliertem Wasser ab. Nach der Goldabscheidung wird mit dem Elektronenstrahlverdampfer ein Titan-Goldfilm auf dem Substrat abgeschieden. Heben Sie die Copolymer-Doppelschicht ab. Widerstehen Sie, indem Sie das Substrat vier Stunden lang in Aceton einweichen.

Untersuchen Sie anschließend das Substrat mit einem Rasterelektronenmikroskop, um die Form und Größe der Nanostruktur zu bestätigen. Die entstehenden Nanostrukturen sind typischerweise durch einen Abstand von 300 Nanometern voneinander getrennt. 20 x 20 Arrays von Nanostrukturen haben einen Abstand von 30 Mikrometern von Mitte zu Mitte.

Ein typischer Chip enthält 300 Arrays, um viel Platz für die Zellbildgebung zu lassen. Entfernen Sie das restliche Chrom über den Nassrand mit Hilfe des CR-Sieben-Ätzens für 60 Sekunden bei Raumtemperatur vom Substrat. Spülen Sie dann das Substrat mit entionisiertem destilliertem Wasser ab.

Untersuchen Sie dann eine Teilmenge von Arrays mit dem Rasterkraftmikroskop, um Größe und Gleichmäßigkeit zu überprüfen. Dieser gemusterte Glasdeckglas kann mehrfach verwendet werden, solange die richtigen Reinigungsverfahren zur Reinigung und Regeneration der lokalisierten Oberflächenplasma- und Resonanz- oder LSPR-Chips befolgt werden. Plasmaasche mit einer Leistung von 40 Watt in einem Gemisch von 300 Milli auf 5% Wasserstoff und 95% Argon für 45 Sekunden.

Funktionalisieren Sie die Goldoberfläche und die Nanostrukturen unmittelbar nach der Plasmaveraschung. Durch Eintauchen des Chips in eine Zweikomponenten-Ethanol-Thiol-Lösung, die aus einem Verhältnis von drei zu eins von SPO und SPC besteht. Nachdem Sie den Chip über Nacht in der Thiollösung belassen haben, um eine selbstorganisierte Monoschicht zu bilden, spülen Sie ihn mit Ethanol ab und trocknen Sie den LSPR-Chip mit Stickstoffgas in einem speziell angefertigten Mikrofluidik-Halter, indem Sie den Chip auf ein Aluminium-Unterteil legen.

Stecken Sie dann den Chip zwischen dieses untere Stück und eine Silikondichtung und ein durchsichtiges Kunststoffoberteil, indem Sie vier Schrauben verwenden, um die Baugruppe zu klemmen. Für eine typische SPC-basierte Thiolanwendung werden 300 Mikroliter einer Eins-zu-Eins-Mischung aus 133 Millimolar EDC und 33 Millimolar NHS in deionisiertem destilliertem Wasser tropfen lassen, um die Carboxylgruppen der SPC-Thiolkomponente zu aktivieren. Nachdem Sie 10 Minuten gewartet haben, spülen Sie die Oberfläche manuell mit 10 Millimolar PBS ab, gefolgt von diesem Konjugat der aktivierten Carboxylgruppe mit dem interessierenden Liganden, indem Sie 300 Mikroliter der Ligandenlösung tropfen lassen.

Nach einer Stunde Wartezeit und Spülen der Oberfläche mit 10 Millimolare PBS-Drop-Codes, 300 Mikroliter 0,1 molare Ethanolamin in PBS auf dem Chip, um unspezifische Bindungen zu minimieren. Nachdem Sie 10 Minuten gewartet haben, waschen Sie das Ethanolamin mit PBS mit einem Gehalt von 0,005 % zwischen 20 oder PBST 20. Platzieren Sie als Nächstes ein Quarzstück über dem Chip, um Schwankungen in den Daten im Zusammenhang mit einem sich verändernden Meniskus zu reduzieren.

Halten Sie den Chip mit PBST 20-Puffer feucht, während Sie ihn auf das Mikroskop montieren. Befestigen Sie den mikrofluidischen Schlauch an der Baugruppe und dem Durchflusspuffer, bis ein stationärer Zustand erreicht ist. Setzen Sie dann die LSPR-Chip-Baugruppe fest in den beheizten Probenhalter ein.

Der optische Aufbau für diese Methode ist hier dargestellt. Das Licht der Halogenlampe wird durch einen 593-Nanometer-Langpassfilter geleitet, um Wellenlängen zu eliminieren, die nicht zur nanoplasmonischen Reaktion beitragen. Anschließend wird das Licht linear polarisiert und die Probe über ein 40 x 1,4 numerisches Aperturobjektiv zur Anregung der plasmonischen Goldnanostrukturen beleuchtet.

Das Streulicht wird vom Objektiv gesammelt und durch einen gekreuzten Polarisator geleitet, um das Hintergrundsignal vom Glassubstrat zu reduzieren. Ein 50 50 Strahlteiler wird in den gesammelten Strahlengang eingeführt, um gleichzeitig spektroskopische und bildhafte Analysen durchzuführen. Nachdem Sie die Baugruppe und das Mikroskop mindestens zwei Stunden lang äquilibriert haben, richten Sie den Chip mit dem Joystick so aus, dass das zentrale Array mit der Faseroptik für die Spektroskopie ausgerichtet ist.

Nach der Kultivierung und Pelletierung von Hybrid-DOMA-Zellen durch Zentrifugation ernten Sie sie und testen sie dann auf Lebensfähigkeit, bevor Sie sie auf die LSPR-Chips aufbringen. Anschließend werden 50 Mikroliter der Zelllösung manuell mit einer Mikropipette auf die LSPR-Chips aufgebracht. Waschen Sie abschließend die verbleibenden Zellen in Lösung mit frischem serumfreiem Medium unter Verwendung eines mikrofluidischen Profusionssystems ab, um die LSPR-Chips für die Bildgebung vorzubereiten.

Hier ist eine Überlagerung eines LSPR-Bildes, das die quadratischen Arrays hervorhebt, und eines Durchlicht-beleuchteten Bildes, das die Zelle unten links hervorhebt, zu sehen. DHPE ist eine Zelle, die mit dem fluoreszierenden Membranfarbstäbchen Domine gefärbt wurde, und weist filopodienähnliche Fortsätze auf. Wenn sich solche Erweiterungen mit den Arrays überlappen würden, würden sie ein falsch positives Ergebnis für die Proteinsekretionsspektrometriedaten vor und nach der Einführung einer Sättigungslösung von antis-cmic-Antikörpern in die cmic-funktionalisierten Arrays liefern.

Diese Methode wird verwendet, um die Arrays zu kalibrieren. Die Kalibrierung der Arrays hilft bei der Normalisierung des Ansprechverhaltens der Sensoren und der Bestimmung der fraktionellen Belegung auf der Grundlage des Biofunktionalisierungsprofils jedes Laufs. Ein kommerzielles SPR-Instrument wird verwendet, um die Dissoziationskonstante zu bestimmen sowie die Resistenz gegen unspezifische Bindung zu untersuchen, wobei das gleiche Protokoll wie für den LSPR-Chip verwendet wird.

Normalisierte Werte aus zwei Arrays werden hier angezeigt. Ein Array befand sich innerhalb von 10 Mikrometern von der Zelle, während die Kontrolle 130 Mikrometer von der Zelle entfernt war. Der plötzliche Anstieg der normalisierten Reaktion des Arrays, das der Zelle am nächsten ist, relativ zur flachen Reaktion des Kontrollarrays ist ein Hinweis auf einen lokalisierten Ausbruch von sezernierten Antikörpern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proteinsekrete aus einzelnen Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung messen kann.