Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Moleküle und ultrakleine Nanopartikel ohne Verwendung von Markierungen mithilfe einer auf optischer Resonatortechnologie und Frequenzstabilisierung basierenden Technik nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in biochemischen Bereichen wie der Proteinfaltung und der Bindungskinetik zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das Zielmolekül nicht markiert werden muss, um es detektieren zu können.

Die Einrichtung dieser Technik umfasst die Kopplung eines mikro OID-Chips an eine optische Faser. Zunächst muss ein mikro OID-Chip beschafft werden. Dabei handelt es sich um einen etwa 6,5 Millimeter mal 5,5 Millimeter großen Siliziumchip, auf dem ein mikro OID hergestellt ist.

Wie in diesem Bild zu sehen ist, hat der mikroskopische OID einen Außendurchmesser von 80 bis 100 Mikrometern und einen Innendurchmesser von zwei Mikrometern. Legen Sie den Chip vorerst beiseite und bereiten Sie die Faser vor, um den Chip zu koppeln. Arbeiten Sie mit einer Einmodenfaser auf einer Spule und wickeln Sie etwa einen Meter der Faser ab.

Beschaffen Sie sich einen Abisolierzange und positionieren Sie sie ungefähr in der Mitte der entrollten Faser. Nutzen Sie die Zange, um einen 2,5 cm langen Abschnitt der Polymerbeschichtung von der Faser zu entfernen. Dieser abisolierte Bereich ist der Kopplungsbereich der Faser.

Nach dem Abisolieren verwenden Sie einen fusselfreien Wisch und Isopropanol, um den abisolierten Bereich zu reinigen. Verwenden Sie anschließend einen Faseraltern mit magnetischen Klemmen, um den gereinigten Bereich festzuhalten. Für den nächsten Schritt richten Sie Schrittmotoren so ein, dass sie die Faser in entgegengesetzte Richtungen ziehen.

Positionieren Sie den Fasermontagehalter so, dass die Schrittmotoren an beiden Seiten des abisolierten Bereichs an der Faser befestigt werden können. Befestigen Sie zudem einen Laser an einem Ende der Faser, der als Lichtquelle dient. Lassen Sie die Schrittmotoren in entgegengesetzte Richtungen laufen, um die Faser zu dehnen, und verwenden Sie eine Wasserstoffflamme, um den abisolierten Teil der Faser zu schmelzen.

Überwachen Sie kontinuierlich das seitlich von der Faser gestreute Licht. Ein Blinken weist darauf hin, dass die Lichtübertragung durch die Faser schwankt und eine stärkere Verjüngung erforderlich ist. Wenn das Blinken aufhört, beenden Sie das Erhitzen und Ziehen der Faser, die dann auf etwa 500 Nanometer verjüngt sein wird.

Nachdem die Faser gedünnt wurde, trennen Sie die Lichtquelle ab und entfernen Sie die Faser zusammen mit ihrem magnetischen Klemmhalter von den robusten Motoren. Danach bringen Sie die Faser auf eine pneumatisch isolierte Bank, die mit einem Positionierungsständer ausgestattet ist. Stellen Sie die Faser in ihrem magnetischen Klemmhalter auf einen Stützblock vor dem Probenchip ab.

Die Positionierbühne ist eine dreidimensionale Nano-Positionierbühne, die auf einer dreidimensionalen Mikrometerschraube montiert ist. Zusätzlich zur Nano-Positionierbühne verfügt das System über Abbildungssäulen für die Draufsicht und Seitenansicht, die bei der Ausrichtung helfen. Arbeiten Sie weiter mit der Faser, indem Sie sicherstellen, dass ihr abisoliertes Stück in der Nähe der Positionierbühne liegt.

Bereiten Sie ein, das freie Ende der Faser in das Messsystem einzuführen. Nachdem das freie Ende abgeflacht wurde, führen Sie es in einen Bare-Fiber-Adapter ein. Verwenden Sie den Adapter, um die Faser mit dem Eingang eines automatisch abgeglichenen Photodetektors zu verbinden, der an ein Oszilloskop angeschlossen ist.

Jetzt konzentrieren Sie sich auf das andere Ende der Faser. Befestigen Sie zunächst dieses Ende an einem optischen Kuppler. Koppeln Sie dann die Faser mit dem Ausgang eines in Reihe geschalteten Polarisators, der über einen 50-50-Strahlteiler und eine abstimmbarer Diodenlaser gespeist wird.

Hier ist ein Schema der bis zu diesem Punkt hergestellten Verbindungen. Beachten Sie, dass der zweite Ausgang des Strahlteilers durch einen Inline-Polarisator verläuft und als Referenz für den automatisch abgeglichenen Photodetektor verwendet wird. Der nächste Schritt besteht darin, die Montage des mikroskopischen OID-Chips unter Verwendung eines Probenhalters aus rostfreiem Stahl vorzubereiten.

Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um den Chip am Probenträger zu befestigen. Dann platzieren Sie den Mikrochip auf dem Probenträger. Bringen Sie nun den Probenträger mit dem Chip auf der Oberseite der Nano-Positionierbühne an.

Hier befinden sich der Halter und der Chip auf der Positionierbühne mit dem Dreifach-Mikrometer. Positionieren Sie den Probenchip grob in Bezug auf die Faser. Hier sind der Chip und die Faser nach Abschluss der Grobpositionierung zu sehen.

Als Nächstes passen Sie die Positionierung weiter an und nutzen Sie die Abbildungsspalten, um den Chip parallel zur optischen Faser auszurichten. Bei einem Mikro-Objektabstand (OID) mit einer Laserwellenlänge der Faser zeigt diese Aufnahme die Faser und das Mikroresonator-Element. Nach dem Feinpositionierungsschritt dient der kreisförmige Aufkleber nahe der Bildmitte als Hilfsmittel zur Positionierung. Gehen Sie nun dazu über, nach der Resonanzwellenlänge des Mikroresonators zu suchen.

Erzeugen Sie ein dreieckförmiges Spannungssignal, um die Laserwellenlänge bei etwa 635 Nanometern ± 2,5 Nanometer zu regulieren. Scannen Sie nun die Wellenlängen, um nach einer Resonanz zu suchen. Beobachten Sie die Transmission durch die Faser auf dem Oszilloskop.

Beachten Sie, dass die Transmission bei der Resonanzwellenlänge abnimmt. Passen Sie an dieser Stelle die Polarisation des Laserlichts an. Stellen Sie die integrierten Polarisationsregler ein, um die Polarisation des Laserlichts in der optischen Faser zu optimieren.

Zeigen Sie die Ausgabe des Fotodetektors mit dem Oszilloskop an und justieren Sie die Polarisation, bis die gemessene Transmissionseinbruchsnut am schmalsten erscheint. Nach der Optimierung der Polarisation bauen Sie eine Probenkammer auf dem Probentisch auf.

Die Kammer besteht aus einem Glasdeckel, der mit Epoxidharz auf einem Objektträger befestigt ist. Der Objektträger fungiert als Abstandshalter, sodass der Deckel über den Chip und die Faser hinausragen kann. Richten Sie eine Ein-Milliliter-Spritzenpumpe mit Schlauchsystem ein, um Proben mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute in die Kammer einzuführen.

Als Nächstes eine ein Milliliter große Probe bei Raumtemperatur entnehmen, die an die Pumpe angepasst ist. In diesem Fall handelt es sich um eine Lösung mit fünf Nanometer großen Silikabeads. Nach dem Befüllen beobachten Sie die Probenkammer und injizieren die Probe, wobei Sie stoppen, sobald die Kammer gefüllt ist. Die Probeneinspeisung hat in dieser Kammer gestoppt, die mit einer Lösung gefüllt ist, die fünf Nanometer große Silikabeads enthält.

Nach einer Wartezeit von 30 Sekunden, um den Einfluss von Vibrationen zu minimieren, suchen Sie nach der Resonanzwellenlänge des Mikroresonators. Beobachten Sie erneut das Absorptionsminimum und die Transmission durch die Faser bei Resonanz mithilfe des Oszilloskops. Dies ist eine schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus zu diesem Zeitpunkt, einschließlich des Proportional-Integral-Differenzial- oder PID-Reglers.

Der Integrator und der Dither. Betreiben Sie die Steuerung im Automatik-Verriegelungsmodus mit Spitzenwertverriegelung. Stellen Sie die Dither-Frequenz auf zwei Kilohertz ein und setzen Sie die Amplitude der Wellenlängenmodulation auf 19 Femtometer.

Nachdem die PID-Einstellungen empirisch ermittelt wurden, sperrt das System automatisch die Wellenlänge des Lasers auf die Resonanzwellenlänge des Mikro-Oids. Sammeln Sie Daten, indem Sie die Ausgabe des Rückkopplungsreglers aufzeichnen. Hier sind repräsentative Spuren der Resonanzverschiebung in Femtometern über die Zeit in Sekunden, die mit einem Protokoll unter Verwendung von drei verschiedenen Bindungspartikeln in aufsteigender Größe erzeugt wurden.

Die Partikel sind Exosome oder nanoskalige Vesikel. Fünf Nanometer große Silikabeads und menschliche Interleukin-2-Moleküle. Beachten Sie die unterschiedlichen Skalen sowohl der vertikalen als auch der horizontalen AE in jedem Datensatz.

Das Beobachten unterschiedlicher Skalen in den Daten bei verschiedenen Partikelgrößen ist ein Hinweis darauf, dass die Technik korrekt durchgeführt wurde. Wenn ein Partikel an den OID bindet, erhöht sich die Resonanzwellenlänge des OID, was zu einem Anstieg in der Kurve führt. Wenn ein Partikel sich ablöst, verringert sich die Resonanzwellenlänge, was zu einem Abfall führt.

Die Höhe jedes Wellenlängenschritts wird durch die Größe des Partikels und seine Position auf dem Mikro-oid bestimmt. Die Zeitskalen werden durch die Partikel-oid-Dynamik festgelegt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa drei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alles so sauber und staubfrei wie möglich zu halten.