Name: Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie die markierungsfreie Einzelmoleküldetektion mit FLOWER-Technologie für biochemische Forschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Protein-Faltung und Bindungskinetik ohne Veränderung der Zielmoleküle.

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Diese Forschung wurde teilweise durch einen National Research Service Award (T32GM07616) des National Institute of General Medical Sciences unterstützt.

1. Versuchsaufbau und die Probenvorbereitung <ol><li> Herzustellen Mikrotoroide Verwendung der Lithographie, Ätzen und Schmelzvorgang, wie zuvor. 6 beschrieben Herzustellen Mikrotoroide auf einem Silizium-Wafer (Chip), die typischerweise einen Außendurchmesser von 80-100 um und einem kleineren Durchmesser von 2 um. </li><li> Entspannen etwa einen Meter von single-mode optische Faser (125 um Verkleidungen, 4,3 um Modenfelddurchmesser) von ihrer Faserspule. </li><li> In der Mitte des abgewickelten Abschnittes der optischen Faser, Streifen ein kleines Segment (2,5 cm) der Polymerbeschichtung auf der optischen Faser mit Abisolierzange. Anmerkung: Dies ist der Teil der optischen Faser, die evaneszent Licht in Mikrotoroid verwendet wird. </li><li> Reinigen Sie die abisolierten Faser mit Isopropanol Alkohol und einem fusselfreien wischen. </li><li> Halten Sie diese Abschnitt der Faser an Ort und Stelle mit einem Faserhalter des Haftmagneten gemacht. </li><li> Thin das abgestreifte Faser bis ~ 500 nm von Melting und das Ziehen unter Verwendung eines Wasserstoffbrenner und zwei Schrittmotoren gegenläufig in 60 &amp; mgr; m / min. Positionieren der optischen Faser im Inneren des oberen Teils der Flamme, die sein sollte ~ 10 mm hoch. Stoppen Ziehen der Faser, wenn die Übertragung durch die Faser stoppt schwankt, das entweder visuell überwacht werden kann (durch die Beobachtung der Licht, das seitlich aus der Faser Aufblinken gestreut wird und aus) oder durch Verbinden der Faser mit einer Fotodiode, die mit einem Oszilloskop verbunden ist . </li><li> Spalten einem Ende der optischen Faser und fügen diesen in einer nackten Faser-Adapter. Dieses Ende der Faser in den Eingang des Fotoempfängers. </li><li> Faser Paar das andere Ende der Faserspule zu dem Laser unter Verwendung eines faseroptischen Kopplers. </li><li> Legen Sie die Mikrotoroid Chip auf einem Probenhalter (Edelstahl, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) unter Verwendung von entweder Epoxy oder doppelseitiges Klebeband. </li><li> Montieren Sie den Probenhalter auf einem Positionierungstisch, der aus einem 3-Achsen-Nanopositionierung umfasst (nanocube) Bühne (siehe Geräteliste) auf einem 3-Achsen-Mikrometer. Führen Sie alle Experimente an einem pneumatisch getrennt optischen Tisch, um Vibrationen zu minimieren. </li><li> Grobposition der Probenchip unter Verwendung des 3-Achsen-Mikrometer. </li><li> Richten Sie die Mikrotoroid haltigen Chips parallel zu der optischen Faser unter Verwendung der Nano-Positionierer. Hinweis: Richten Sie die Mikrotoroid in einem Abstand von einer Wellenlänge des Eingangslichts (~ 633 nm). Zur Visualisierung dieses Prozesses verwenden zwei Bildsäulen (Rohr mit Objektiv und Kamera siehe Ausstattungsliste) auf der Oberseite und auf der Seite des Chips angeordnet. </li><li> Optimieren Sie die Polarisation des durch die optische Faser unter Verwendung eines in-line-Polarisationssteuerung gerichtete Laserlicht (siehe Geräteliste) mit einem Drehknopf, um die Polarisation einzustellen. Anmerkung: Die optimale Polarisation erreicht wird, wenn die gemessene Tauch bei der Übertragung von der optischen Faser wird der engste. Beachten Sie diese Dip auf einem Oszilloskop (siehe Schritt 2.2 für weitere Einzelheiten). </li><li> Konstrukteine Probenkammer durch epoxying einem Deckglas über dem Probentisch mit einem Objektträger aus Glas als Abstandshalter. Hinweis: Ein Plexiglas-Gehäuse, die den gesamten Setup kann nützlich zur Minimierung von Luftströmungen zu sein. Eine kleine Öffnung gelassen werden sollten, um die Lösung zu ermöglichen, sich mit der Rohrleitung gepumpt werden. </li><li> Thermisch äquilibrieren Partikelsuspensionen oder Einzelmolekül wässrigen Lösungen zur ≥ 1 Stunde in einem Wasserbad RT (~ 500 ml). Anmerkung: Die Proben werden auf die gewünschte Konzentration in Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung der vom Hersteller, beispielsweise PBS oder HEPES spezifizierten assoziierten Puffer verdünnt. Wenn keine Bindungsereignisse detektiert werden, erhöht die Salzkonzentration des Puffers. </li><li> Vortex Partikelhaltigen Lösungen (1 ml) kurzzeitig für ca. 2 Sek. </li><li> Injizieren Partikel enthaltenden Lösungen in die Probenkammer bei 1 ml / min unter Verwendung einer 1 ml-Spritzenpumpe. </li><li> Nachdem die Probenkammer gefüllt hat, schalten Sie die Spritzenpumpe. </li><li> Warten Sie 30 Sekunden vor Aufnahmedaten zu minimierendie Auswirkungen von mechanischen Schwingungen von Flüssigkeitsströmung, die die Messung beeinflussen können, resultieren. </li></ol> 2. Frequenz Locking <ol><li> Erneute Koppeln des Toroids zu der optischen Faser durch Bewegung des Probenhalters mit dem Positionierer, denn die Kupplung aufgrund der Einspritzung des Fluids gestört werden. </li><li> Lokalisieren die Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid durch Abtasten des rechnergesteuerten Eingangslaser durch eine Vielzahl von Wellenlängen. Dieser Schritt durch Senden einer Dreieckspannung Signal an ein piezoelektrisches Element innerhalb des Lasercontroller, der die Wellenlänge des Lasers regelt. Experimente durchführen unter Verwendung von sichtbarem Licht (635 nm ± 2,5 nm), da es eine geringe Absorption von Licht in Wasser bei dieser Wellenlänge. </li><li> Messung der Lichtdurchlässigkeit durch die optische Faser durch Einstecken des Ausgangs der optischen Faser in einem Auto-ausgeglichenen Photoempfänger. Stecker des Ausgangssignals des Photoempfängers in ein Oszilloskop mit einem BNC-Kabel. Beachten Sie on das Oszilloskop, das an der Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid, Übertragung durch die optische Faser fällt. </li><li> Befestigen Sie den Ausgang des Photoempfängers auf den Haupteingang des Frequenzverriegelungsrückkopplungsregler (siehe Geräteliste) über ein Kabel. </li><li> Führen Sie das Frequenzverriegelungsrückkopplungssteuerung im Autolock-Modus mit top-of-Spitzensperr mit einer Zitterfrequenz von 2 kHz und einer Amplitude von Wellenlängenschwingung von 19 fm. Empirisch setzen die Proportional-Integral-Differential-Einstellungen in der Software-Fenster unter Verwendung von Ziegler-Nichols-Regeln 14. Anmerkung: Diese Werte sind nur einmal zu Beginn aller Experimente eingestellt werden. </li><li> Auto-Lock, die Wellenlänge des Lasers auf die Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid. Führen Sie diesen Schritt nach dem Füllen der Probenkammer. Hinweis: Wenn die Wellenlängenverschiebung zu groß ist, dann wird die Rückkopplungssteuerung wird Schloss verlieren und automatisch auf Scan-Modus, um die Resonanzwellenlänge Standort lokalisieren zu wechseln. Diese ocKöter für Wellenlängenverschiebungen größer als etwa eine Linienbreite (mindestens 600 fm für alle Systeme hier untersucht). </li><li> Aufzeichnen des Ausgangs des Rückkopplungsreglers auf 20 kHz unter Verwendung eines 24-Bit-Datenerfassungskarte. Exportieren Sie die Daten als Textdatei über Datenerfassungssoftware. </li></ol> 3. Datenverarbeitung und Analyse- <ol><li> Fourier-Transformation der Daten in MATLAB. </li><li> Low übergeben Sie die Daten mit Hilfe eines &quot;Backsteinmauer&quot; Filter mit einer Grenz bei 1 kHz, um die auferlegten Zitterfrequenz von 2 kHz zu entfernen (siehe Zusatzcodedatei Screenshot 1). </li><li> Rechnerisch Notch-Filter, die Daten mit Hilfe einer Fenstergröße von 16 Hz. Hinweis: Dies geschieht, um bekannten Quellen von Rauschen zu entfernen, in diesem Fall, elektronische Leitungsrauschen 60 Hz und deren Oberwellen, sowie 100 Hz (aus dem Lasertreiber) und ihre Oberschwingungen (siehe Zusatzcodedatei Screenshot 1). </li><li> Inverse Fourier-Transformation die Daten zurück in den Zeitbereich. </li><li> Medianfilter die Daten unter Verwendung eines FenstersGröße von 1.001 Proben (siehe Zusatzcodedatei Screenshot 2). </li><li> Finde Schritt Veränderungen in der Resonanzwellenlänge mit der Schritt-Suchalgorithmus von Kerssemakers et al. 15. </li><li> Erzeugen Histogramme der Amplitude von jedem Bindungsschritt. </li><li> Berechnen Partikelgröße unter Verwendung von Gl. (1) (siehe Diskussion). </li></ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
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<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
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<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
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<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Als ein Teilchen gebunden ist, die Resonanzwellenlänge (λ) der Toroid zunimmt. Wenn ein Teilchen tatsächlich freigegeben wird, die Resonanzwellenlänge nimmt entsprechend ab (ein Untersetzungsereignis). Der Partikeldurchmesser (d) kann durch Histogramme der Amplitude jeder Wellenlänge Schritt bestimmt werden. Die Höhe jeder Wellenlänge Schritt variiert je nach Größenvariationen des gebundenen Teilchen und durch die Lage auf der Mikrotoroid wo das Teilchen bindet. Die maximale Änderung der Resonanzwellen...

Einzelmoleküldetektion Experimente sind nützlich für die Verringerung der Menge an Analyt in Biosensoren verwendet wird, für die Früherkennung von Krankheiten und zur Untersuchung der grundlegenden Eigenschaften von Molekülen 3. Solche Experimente werden normalerweise mit den Etiketten sind jedoch Etiketten nicht immer möglich, für ein bestimmtes Protein zu erhalten, erhöhen die Kosten, können stören die Ereignisse untersucht und kann unbequem sein, insbesondere für die Echtzeit-Vor-Ort-Versuche oder Point-of- Care-Diagnostik. Der aktuelle Goldstandard für die markierungsfreien Biosensor ist die Oberflächenplasmonresonanz 4, aber die kommerziellen Oberflächenplasmonresonanz-Systeme haben in der Regel eine typische untere Nachweisgrenze in der Größenordnung von nM. In jüngster Zeit haben optische Resonatoren als vielversprechende Technologie für markierungsfreie Einzelmolekül Biodetektion 5 entstanden. Optischen Resonatoren Arbeit auf der Grundlage der langfristigen (ns) Führung von Licht 6,7. Licht ist evaneszenttypischerweise über eine optische Faser in diese Geräte gekoppelt sind. Wenn die Wellenlänge des Lichts geht durch die Faser entspricht der Resonanzwellenlänge des Resonators, Licht wirksam koppelt an den Resonator. Dieses gekoppelte Licht vollständig intern reflektiert innerhalb des Resonators Hohlraum Erzeugung eines evaneszenten Feldes in der Nähe des Umfangs des Resonators. Als Partikel in das evaneszente Feld und binden an den Resonator, der Resonanzwellenlänge des Resonators ändert sich proportional zu dem Volumen des Teilchens 8. In Bezug auf die Erfassungsfähigkeit, haben Mikrokugelresonatoren früher verwendet worden, um einzelne Influenza-A-Virus-Partikel zu erkennen (100 nm) 9,10. Kurzem plasmonically verstärkte Mikrokugel optischen Resonatoren sind verwendet worden, um einzelne Rinderserumalbuminmoleküle detektieren 11 und 8-mer Oligonukleotiden 12, aber dieser Ansatz begrenzt die Partikelfangbereich auf 0,3 &amp; mgr; m 2 pro deLaster. Größere Capture-Bereich Biosensoren sind ideal für die Maximierung der Wahrscheinlichkeit des Partikeldetektion. Aktuelle lösungsbasierten markierungsfreien Biosensor-Technologien mit großen (&gt; 100 &amp; mgr; m 2) Capture-Bereiche wurden auf die Erfassung Polystyrol-Partikel ≥ 25 nm beschränkt. Wir haben einen markierungsfreien Biosensor-System auf Basis von optischen Resonator-Technologie als Frequenzverriegelung Optical Whispering Evanescent Resonator (BLUME) 13 (Abbildung 1) bekannt, die in der Lage, zeitaufgelöste Detektion von Einzelmolekülen in Lösung entwickelt. FLOWER verwendet die lange Lebensdauer der Photonen Mikrotoroid optischen Resonatoren in Kombination mit Frequenzsperr Regelung, ausgeglichen Erkennung und Rechen Filterung, um kleine Partikel bis hin zu einzelnen Proteinmoleküle zu erkennen. Die Verwendung von Frequenzverriegelung kann das System immer verfolgen die Verschiebung Resonanz des Mikrotoroid als Teilchen zu binden, ohne die Notwendigkeit zu kehren oder Scannen der Laserwellenlänge übergroße Bereiche. Die Grundsätze der FLOWER verwendet werden, um die Erkennungsfähigkeiten von anderen Techniken, einschließlich plasmonischer Steigerung zu erhöhen. Im Folgenden werden die Verfahren für die Durchführung FLOWER beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Abstimmbarer Diodenlaser</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>Lasercontroller</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>Frequenzsperrender Feedback-Controller</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>Autobalancierter Fotoempfänger</td><td>Newport</td><td>Modell 2007</td><td></td></tr><tr><td>Inline-Polarisationsregler</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>24-Bit-Datenerfassungskarte</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Interleukin-2</td><td>Pierce Biotechnologie</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>20 nm Polystyrolkügelchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>Optischer Tisch</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv für Bildsäule</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Bildsäule (Adapterrohr)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Hochauflösende CCD-Kamera für Bildsäule</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

markierungsfreie einzelmoleküldetektion mit mikrotoroid optischen resonatoren

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Nachweis kleiner Konzentrationen von Molekülen bis zur Einzelmolekül Grenze hat Auswirkungen auf Bereiche wie die Früherkennung von Krankheiten und grundlegenden Studien über das Verhalten von Molekülen. Einzelmoleküldetektionsverfahren verwenden üblicherweise Markierungen, wie Fluoreszenzmarkierungen oder Quantenpunkte sind jedoch nicht immer verfügbar Etiketten, erhöhen die Kosten und die Komplexität und kann stören die Ereignisse untersucht. Optischen Resonatoren als ein vielversprechendes Mittel zur Einzelmoleküle ohne Einsatz von Etiketten erfassen taucht. Derzeit kleinste durch eine nicht plasmonically verstärkte blanke optische Resonatorsystem in Lösung nachgewiesen Teilchen ein 25 nm Polystyrolkugel 1. Wir haben eine Technik, die als Frequenzverriegelung Optical Whispering Evanescent Resonator (Blume), die in wässriger Lösung 2 dieses Limit übertreffen können und erreichen markierungsfreie Einzelmoleküldetektion bekannt entwickelt. Als Signalstärke Waage mit Partikelvolumen, unsere Arbeit für eine&gt; 100x improvement im Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) über den aktuellen Stand der Technik. Hier die Verfahren hinter FLOWER werden in dem Bemühen, ihre Nutzung auf dem Gebiet erhöhen vorgestellt.

Partikelbindungsereignisse eindeutig als stufenartigen Änderungen in der Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid über die Zeit (2A) ersichtlich. Die Höhen dieser Schritte sind als Histogramm in Figur 2B gezeigt. Die Abbildungen 2-4 zeigen repräsentative Spuren aus der Bindung von Exosomen (nanovesicles), 5 nm Silikonkügelchen, einzelne menschliche Interleukin-2-Moleküle sind. Die Tatsache, dass die stufenartigen Ereignissen Skala mit Teilchengröße zeigt, daß das Verfahren k...

Wir haben ein markierungsfreies Biosensorsystem entwickelt, das auf optischer Resonatortechnologie basiert und als Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) bekannt ist und in der Lage ist, einzelne Moleküle in Lösung zu detektieren. Hier werden die Vorgehensweisen hinter dieser Arbeit beschrieben und vorgestellt.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Moleküle und ultrakleine Nanopartikel ohne Verwendung von Markierungen mithilfe einer auf optischer Resonatortechnologie und Frequenzstabilisierung basierenden Technik nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in biochemischen Bereichen wie der Proteinfaltung und der Bindungskinetik zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das Zielmolekül nicht markiert werden muss, um es detektieren zu können.Die Einrichtung dieser Technik umfasst die Kopplung eines mikro OID-Chips an eine optische Faser. Zunächst muss ein mikro OID-Chip beschafft werden. Dabei handelt es sich um einen etwa 6,5 Millimeter mal 5,5 Millimeter großen Siliziumchip, auf dem ein mikro OID hergestellt ist.Wie in diesem Bild zu sehen ist, hat der mikroskopische OID einen Außendurchmesser von 80 bis 100 Mikrometern und einen Innendurchmesser von zwei Mikrometern. Legen Sie den Chip vorerst beiseite und bereiten Sie die Faser vor, um den Chip zu koppeln. Arbeiten Sie mit einer Einmodenfaser auf einer Spule und wickeln Sie etwa einen Meter der Faser ab.Beschaffen Sie sich einen Abisolierzange und positionieren Sie sie ungefähr in der Mitte der entrollten Faser. Nutzen Sie die Zange, um einen 2,5 cm langen Abschnitt der Polymerbeschichtung von der Faser zu entfernen. Dieser abisolierte Bereich ist der Kopplungsbereich der Faser.Nach dem Abisolieren verwenden Sie einen fusselfreien Wisch und Isopropanol, um den abisolierten Bereich zu reinigen. Verwenden Sie anschließend einen Faseraltern mit magnetischen Klemmen, um den gereinigten Bereich festzuhalten. Für den nächsten Schritt richten Sie Schrittmotoren so ein, dass sie die Faser in entgegengesetzte Richtungen ziehen.Positionieren Sie den Fasermontagehalter so, dass die Schrittmotoren an beiden Seiten des abisolierten Bereichs an der Faser befestigt werden können. Befestigen Sie zudem einen Laser an einem Ende der Faser, der als Lichtquelle dient. Lassen Sie die Schrittmotoren in entgegengesetzte Richtungen laufen, um die Faser zu dehnen, und verwenden Sie eine Wasserstoffflamme, um den abisolierten Teil der Faser zu schmelzen.Überwachen Sie kontinuierlich das seitlich von der Faser gestreute Licht. Ein Blinken weist darauf hin, dass die Lichtübertragung durch die Faser schwankt und eine stärkere Verjüngung erforderlich ist. Wenn das Blinken aufhört, beenden Sie das Erhitzen und Ziehen der Faser, die dann auf etwa 500 Nanometer verjüngt sein wird.Nachdem die Faser ged&uuml;nnt wurde, trennen Sie die Lichtquelle ab und entfernen Sie die Faser zusammen mit ihrem magnetischen Klemmhalter von den robusten Motoren. Danach bringen Sie die Faser auf eine pneumatisch isolierte Bank, die mit einem Positionierungsst&auml;nder ausgestattet ist. Stellen Sie die Faser in ihrem magnetischen Klemmhalter auf einen St&uuml;tzblock vor dem Probenchip ab.Die Positionierbühne ist eine dreidimensionale Nano-Positionierbühne, die auf einer dreidimensionalen Mikrometerschraube montiert ist. Zusätzlich zur Nano-Positionierbühne verfügt das System über Abbildungssäulen für die Draufsicht und Seitenansicht, die bei der Ausrichtung helfen. Arbeiten Sie weiter mit der Faser, indem Sie sicherstellen, dass ihr abisoliertes Stück in der Nähe der Positionierbühne liegt.Bereiten Sie ein, das freie Ende der Faser in das Messsystem einzuführen. Nachdem das freie Ende abgeflacht wurde, führen Sie es in einen Bare-Fiber-Adapter ein. Verwenden Sie den Adapter, um die Faser mit dem Eingang eines automatisch abgeglichenen Photodetektors zu verbinden, der an ein Oszilloskop angeschlossen ist.Jetzt konzentrieren Sie sich auf das andere Ende der Faser. Befestigen Sie zunächst dieses Ende an einem optischen Kuppler. Koppeln Sie dann die Faser mit dem Ausgang eines in Reihe geschalteten Polarisators, der über einen 50-50-Strahlteiler und eine abstimmbarer Diodenlaser gespeist wird.Hier ist ein Schema der bis zu diesem Punkt hergestellten Verbindungen. Beachten Sie, dass der zweite Ausgang des Strahlteilers durch einen Inline-Polarisator verläuft und als Referenz für den automatisch abgeglichenen Photodetektor verwendet wird. Der nächste Schritt besteht darin, die Montage des mikroskopischen OID-Chips unter Verwendung eines Probenhalters aus rostfreiem Stahl vorzubereiten.Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um den Chip am Probenträger zu befestigen. Dann platzieren Sie den Mikrochip auf dem Probenträger. Bringen Sie nun den Probenträger mit dem Chip auf der Oberseite der Nano-Positionierbühne an.Hier befinden sich der Halter und der Chip auf der Positionierbühne mit dem Dreifach-Mikrometer. Positionieren Sie den Probenchip grob in Bezug auf die Faser. Hier sind der Chip und die Faser nach Abschluss der Grobpositionierung zu sehen.Als Nächstes passen Sie die Positionierung weiter an und nutzen Sie die Abbildungsspalten, um den Chip parallel zur optischen Faser auszurichten. Bei einem Mikro-Objektabstand (OID) mit einer Laserwellenlänge der Faser zeigt diese Aufnahme die Faser und das Mikroresonator-Element. Nach dem Feinpositionierungsschritt dient der kreisförmige Aufkleber nahe der Bildmitte als Hilfsmittel zur Positionierung. Gehen Sie nun dazu über, nach der Resonanzwellenlänge des Mikroresonators zu suchen.Erzeugen Sie ein dreieckförmiges Spannungssignal, um die Laserwellenlänge bei etwa 635 Nanometern ± 2,5 Nanometer zu regulieren. Scannen Sie nun die Wellenlängen, um nach einer Resonanz zu suchen. Beobachten Sie die Transmission durch die Faser auf dem Oszilloskop.Beachten Sie, dass die Transmission bei der Resonanzwellenlänge abnimmt. Passen Sie an dieser Stelle die Polarisation des Laserlichts an. Stellen Sie die integrierten Polarisationsregler ein, um die Polarisation des Laserlichts in der optischen Faser zu optimieren.Zeigen Sie die Ausgabe des Fotodetektors mit dem Oszilloskop an und justieren Sie die Polarisation, bis die gemessene Transmissionseinbruchsnut am schmalsten erscheint. Nach der Optimierung der Polarisation bauen Sie eine Probenkammer auf dem Probentisch auf.Die Kammer besteht aus einem Glasdeckel, der mit Epoxidharz auf einem Objektträger befestigt ist. Der Objektträger fungiert als Abstandshalter, sodass der Deckel über den Chip und die Faser hinausragen kann. Richten Sie eine Ein-Milliliter-Spritzenpumpe mit Schlauchsystem ein, um Proben mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute in die Kammer einzuführen.Als Nächstes eine ein Milliliter große Probe bei Raumtemperatur entnehmen, die an die Pumpe angepasst ist. In diesem Fall handelt es sich um eine Lösung mit fünf Nanometer großen Silikabeads. Nach dem Befüllen beobachten Sie die Probenkammer und injizieren die Probe, wobei Sie stoppen, sobald die Kammer gefüllt ist. Die Probeneinspeisung hat in dieser Kammer gestoppt, die mit einer Lösung gefüllt ist, die fünf Nanometer große Silikabeads enthält.Nach einer Wartezeit von 30 Sekunden, um den Einfluss von Vibrationen zu minimieren, suchen Sie nach der Resonanzwellenlänge des Mikroresonators. Beobachten Sie erneut das Absorptionsminimum und die Transmission durch die Faser bei Resonanz mithilfe des Oszilloskops. Dies ist eine schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus zu diesem Zeitpunkt, einschließlich des Proportional-Integral-Differenzial- oder PID-Reglers.Der Integrator und der Dither. Betreiben Sie die Steuerung im Automatik-Verriegelungsmodus mit Spitzenwertverriegelung. Stellen Sie die Dither-Frequenz auf zwei Kilohertz ein und setzen Sie die Amplitude der Wellenlängenmodulation auf 19 Femtometer.Nachdem die PID-Einstellungen empirisch ermittelt wurden, sperrt das System automatisch die Wellenlänge des Lasers auf die Resonanzwellenlänge des Mikro-Oids. Sammeln Sie Daten, indem Sie die Ausgabe des Rückkopplungsreglers aufzeichnen. Hier sind repräsentative Spuren der Resonanzverschiebung in Femtometern über die Zeit in Sekunden, die mit einem Protokoll unter Verwendung von drei verschiedenen Bindungspartikeln in aufsteigender Größe erzeugt wurden.Die Partikel sind Exosome oder nanoskalige Vesikel. Fünf Nanometer große Silikabeads und menschliche Interleukin-2-Moleküle. Beachten Sie die unterschiedlichen Skalen sowohl der vertikalen als auch der horizontalen AE in jedem Datensatz.Das Beobachten unterschiedlicher Skalen in den Daten bei verschiedenen Partikelgrößen ist ein Hinweis darauf, dass die Technik korrekt durchgeführt wurde. Wenn ein Partikel an den OID bindet, erhöht sich die Resonanzwellenlänge des OID, was zu einem Anstieg in der Kurve führt. Wenn ein Partikel sich ablöst, verringert sich die Resonanzwellenlänge, was zu einem Abfall führt.Die Höhe jedes Wellenlängenschritts wird durch die Größe des Partikels und seine Position auf dem Mikro-oid bestimmt. Die Zeitskalen werden durch die Partikel-oid-Dynamik festgelegt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa drei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alles so sauber und staubfrei wie möglich zu halten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Biosensoren Verbindung mit komplexen, biologischen Umgebungen und führen gezielte Erkennung durch die Kombination von hochempfindlichen Sensoren mit sehr spezifischen Sonden, die an dem Sensor über Oberflächenmodifizierung. Hier zeigen wir die Funktionalisierung der Oberfläche von Silica optische Sensoren mit Biotin mit Silankupplungsmittel, um den Sensor und die biologische Umwelt zu überbrücken.

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