Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne Moleküle und ultrakleine Nanopartikel ohne Verwendung von Markierungen mit einer Technik zu detektieren, die auf optischer Resonatortechnologie und Frequenzkopplung basiert. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in biochemischen Bereichen wie der Proteinfaltung und der Bindungskinetik zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Zielmolekül nicht markiert werden muss, um es nachzuweisen.

Bei dieser Technik wird ein Micro-OID-Chip an eine optische Faser gekoppelt. Besorgen Sie sich zunächst einen Micro-OID-Chip. Dabei handelt es sich um einen etwa 6,5 mal 5,5 Millimeter großen Siliziumchip, auf dem eine Mikro-OID hergestellt ist.

Wie in diesem Bild hat der Mikro-OID einen Hauptdurchmesser von 80 bis 100 Mikrometern und einen Nebendurchmesser von zwei Mikrometern. Legen Sie den Chip zunächst beiseite und bereiten Sie die Faser vor, um den Chip zu koppeln. Arbeiten Sie mit einer Singlemode-Faser auf einer Spule und wickeln Sie etwa einen Meter der Faser ab.

Holen Sie sich eine Abisolierzange und wickeln Sie sie ungefähr in der Mitte der Faser ab. Verwenden Sie sie, um ein 2,5 Zentimeter großes Segment der Polymerbeschichtung von der Faser zu entfernen. Dieser abisolierte Bereich ist der Kopplungsbereich der Faser.

Nachdem Sie die Faser abgezogen haben, verwenden Sie ein fusselfreies Tuch und Isopropanolalkohol, um den abgestreiften Bereich zu reinigen. Verwenden Sie anschließend einen Faserhalter mit Magnetklemmen, um den gereinigten Teil an Ort und Stelle zu halten. Lassen Sie für den nächsten Schritt Schrittmotoren so anordnen, dass sie die Faser in entgegengesetzte Richtungen ziehen.

Positionieren Sie den Faserhalter so, dass die Schrittmotoren auf beiden Seiten des abisolierten Bereichs an der Faser befestigt werden können. Befestigen Sie außerdem einen Laser an einem Ende der Faser, der als Lichtquelle dient. Starten Sie die Schrittmotoren, die sich in entgegengesetzte Richtungen bewegen, um die Faser zu dehnen, und verwenden Sie einen Wasserstoffbrenner, um den abgestreiften Teil der Faser zu schmelzen.

Überwachen Sie ständig das seitlich von der Faser gestreute Licht. Blinken zeigt an, dass die Lichtdurchlässigkeit durch die Faser schwankt und eine weitere Ausdünnung erforderlich ist. Wenn das Blinken aufhört, hören Sie auf, die Faser zu erhitzen und zu ziehen, die auf etwa 500 Nanometer dünn war.

Nachdem die Faser verdünnt wurde, nehmen Sie die Lichtquelle ab und entfernen Sie die Faser und ihren magnetischen Klemmhalter von den hartnäckigen Motoren. Bewegen Sie anschließend die Faser auf eine pneumatisch isolierte Bank, die mit dem Positioniertisch ausgestattet ist. Legen Sie die Faser in ihrem magnetischen Klemmhalter auf einen Stützblock vor dem Probenchip.

Der Positioniertisch ist ein dreiachsiger Nano-Positioniertisch auf einem dreiachsigen Mikrometer. Zusätzlich zum Nano-Positioniertisch gibt es Bildsäulen in der Draufsicht und in der Seitenansicht, die bei der Ausrichtung helfen. Fahren Sie mit der Faser fort, indem Sie sicherstellen, dass sich der abisolierte Teil in der Nähe des Positionierungstisches befindet.

Bereiten Sie sich darauf vor, das freie Ende der Fasern in das Messsystem einzuführen. Nachdem Sie das freie Ende gespalten haben, stecken Sie es in einen blanken Faseradapter. Verwenden Sie den Adapter, um die Faser an den Eingang eines automatisch symmetrischen Fotoempfängers anzuschließen, der an ein Oszilloskop angeschlossen ist.

Konzentrieren Sie sich nun auf das andere Ende der Faser. Befestigen Sie zunächst dieses Ende an einem optischen Koppler. Koppeln Sie dann die Faser an den Ausgang eines Inline-Polarisators, der von einem 50 50 Strahlteiler und einem abstimmbaren ATT-Diodenlaser gespeist wird.

Hier ist ein Schema der Verbindungen, die bis zu diesem Punkt hergestellt wurden. Beachten Sie, dass der zweite Ausgang des Strahlteilers durch einen Inline-Polarisator geleitet wird und als Referenz für den automatisch symmetrischen Fotoempfänger verwendet wird. Der nächste Schritt besteht darin, die Montage des Micro-OID-Chips mit einem Probenhalter aus Edelstahl vorzubereiten.

Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um den Chip am Probenhalter zu befestigen. Platzieren Sie dann den Mikrochip auf dem Probenhalter. Montieren Sie nun den Probenhalter mit dem Chip auf dem Nano-Positioniertisch.

Hier werden Halter und Chip mit den drei X-Mikrometern auf dem Positioniertisch platziert. Positionieren Sie den Probenchip grob in Bezug auf die Faser. Hier sind der Chip und die Faser, nachdem die Kurspositionierung abgeschlossen wurde.

Stellen Sie als Nächstes den Positionierer weiter ein und verwenden Sie die Bildsäulen, um den Chip parallel zur optischen Faser auszurichten. Bei einem Mikro-OID mit einer Laserwellenlänge der Faser handelt es sich bei diesem Bild um eine Faser und ein Mikrot. Nach dem Feinpositionierungsschritt ist der kreisförmige Aufkleber in der Nähe der Mitte des Sichtfeldes eine Positionierungshilfe. Fahren Sie nun mit der Suche nach der Resonanzwellenlänge des Mikros fort.

Erzeugen Sie ein Dreieckswellenform-Spannungssignal, um die Wellenlänge des Lasers bei etwa 635 Nanometern plus oder minus 2,5 Nanometern zu regulieren. Scannen Sie nun die Wellenlängen, um nach Resonanz zu suchen. Beobachten Sie die Übertragung durch die Faser am Oszilloskop.

Beachten Sie, dass bei der Resonanzwellenlänge die Transmission abnimmt. Arbeiten Sie an dieser Stelle daran, die Polarisation des Laserlichts einzustellen. Passen Sie die Inline-Polarisationsregler an, um die Polarisation des Laserlichts in der optischen Faser zu optimieren.

Betrachten Sie den Ausgang des Fotoempfängers mit dem Oszilloskop und stellen Sie die Polarisation ein, bis der gemessene Sendeabfall am geringsten erscheint. Nach der Optimierung der Polarisation wird eine Probenkammer konstruiert. Auf dem Probentisch.

Die Kammer besteht aus einem Glasdeckglas mit Epoxidharz auf ein Stück Mikroskop. Gleiten. Die Folie fungiert als Abstandshalter, so dass der Deckglas über den Chip und die Faser hinausragen kann. Ordnen Sie eine Ein-Milliliter-Spritzenpumpe und einen Schlauch an, um die Versuchsproben mit einem Milliliter pro Minute in die Kammer einzuführen.

Entnehmen Sie als Nächstes eine Probe mit äquilibrierter Raumtemperatur von einem Milliliter, die in die Pumpe geladen wird. In diesem Fall handelt es sich um eine Lösung mit fünf Nanometer großen Siliziumdioxidkügelchen. Beobachten Sie nach dem Laden die Probenkammer und injizieren Sie die Probe Stopp Wenn die Kammer gefüllt ist, ist die Probeninjektion in dieser Kammer gestoppt, die mit einer Lösung gefüllt ist, die fünf Nanometer Siliziumdioxidkügelchen enthält.

Nachdem Sie 30 Sekunden gewartet haben, um den Effekt der Vibration zu minimieren, suchen Sie nach der Resonanzwellenlänge des Mikros. Beobachten Sie auch hier den Einbruch und die Übertragung durch die Faser bei Resonanz mit dem Oszilloskop. Dies ist ein Schema des Versuchsaufbaus an dieser Stelle, einschließlich der proportionalen integralen Ableitung oder PID-Regler.

Der Integrator und Dither. Führen Sie den Controller im Auto-Lock-Modus mit Top-of-Peak-Locking aus. Stellen Sie die Ditherfrequenz auf zwei Kilohertz und die Wellenlängenschwingungsamplitude auf 19 Femtometer ein.

Nachdem Sie die PID-Einstellungen empirisch ermittelt haben, sperren Sie die Wellenlänge des Lasers automatisch an die Resonanzwellenlänge des Mikrooids. Sammeln Sie Daten, indem Sie den Ausgang des Feedback-Controllers aufzeichnen. Hier sind repräsentative Spuren der Resonanzverschiebung in Femtometern gegenüber der Zeit in Sekunden, die mit einem Protokoll unter Verwendung von drei verschiedenen Bindungspartikeln in der Reihenfolge ihrer Größe erzeugt wurden.

Bei den Partikeln handelt es sich um Exosomen oder Nanovesikel. Fünf Nanometer Siliziumdioxidkügelchen und menschliches Interleukin zwei Moleküle. Beachten Sie die unterschiedlichen Skalen sowohl der vertikalen als auch der horizontalen AEs in jedem Datensatz.

Die Beobachtung unterschiedlicher Skalen in den Daten für verschiedene Partikelgrößen ist ein Hinweis darauf, dass die Technik korrekt durchgeführt wurde. Wenn ein Partikel an das OID bindet, nimmt die Resonanzwellenlänge des OID zu, was zu einem Anstieg der Spur führt. Wenn sich ein Teilchen löst, nimmt die Resonanzwellenlänge ab, was zu einem Schritt nach unten führt.

Die Höhe jedes Wellenlängenschritts wird durch die Größe des Partikels und seine Position auf dem Mikrooid bestimmt. Die Zeitskalen werden durch die Teilchen-OID-Dynamik bestimmt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alles so sauber und staubfrei wie möglich zu halten.