Name: Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Erfahren Sie, wie man mit bakteriellen künstlichen Chromosomen infektiöse Viruspartikel aus geklonter cDNA von Positiv-Strang-RNA-Viren wie dem Japan-Enzephalitis-Virus rettet. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung rekombinanter Viren für die Virologieforschung und Impfstoffentwicklung.

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Die Autoren möchten dem Utah Science Technology and Research Fund für die Unterstützung von YML und den Zuschüssen der Korea National Research Foundation (2009-0069679 und 2010-0010154) für die Unterstützung von SIY danken. Diese Forschung wurde von der Utah Agricultural Experiment Station der Utah State University unterstützt und als Zeitschriftenartikel mit der Nummer UAES #8753 genehmigt. Außerdem danken die Autoren Dr. Deborah McClellan für die redaktionelle Unterstützung.

Die Verfasser haben erklärt, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das aktuelle Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um Volllängen-infektiöse cDNA-Klone für zwei verschiedene Stämme (CNU / LP2 27 und SA 14 -14-2 28) des JEV, einem Flavivirus, deren funktionelle cDNA hat sich als von Natur aus schwierig zu konstruieren und zu erzeugen, ausbreiten, weil Wirtszelltoxizität und die genetische Instabilität der klonierten cDNA 8,74-76 Dieses Protokoll besteht aus drei Hauptkomponenten:. erste und maximiert die Synthese / Amplifikation einer cDNA getreue Kopie der viralen RNA unter Verwendung von High-Fidelity-Reverse Transkriptase / DNA-Polymerase; Zweitens Klonieren des viralen prM-E kodierenden Region mit toxischen Sequenzen (unveröffentlichte Daten) 74,77,78 in sehr geringer Kopienzahlvektor BAC von der anfänglichen cDNA Subklonieren der endgültigen cDNA mit voller Länge Montageschritte; und drittens, die Verwendung eines Klonierungsvektors BAC, die eine Fremd-DNA mit einer durchschnittlichen Größe von 120-350 kb, 19-21, die offensichtlich toleriert größere DNA inse aufnehmen kannrts als andere Klonierungsvektoren. Diese Klonierungsansatz im allgemeinen auf viele andere Positiv-Strang-RNA-Viren, insbesondere solchen mit einem großen RNA-Genom von ca. 10 bis 32 kb. Erzeugung eines infektiösen cDNA-Klon ist ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung einer reversen Genetik System für RNA-Viren, insbesondere bei Positiv-Strang-RNA-Viren, da das Genom wirkt als virale mRNA, die von Wirtszellen Ribosomen in Proteine ​​übersetzt wird. Somit kann die virale Replikation durch die Einführung einer cDNA-abgeleitete Genomlänge RNA-Moleküls in einer empfänglichen Wirtszelle eingeleitet werden. Die Verfügbarkeit eines infektiösen JEV cDNA-Klon, wenn sie mit rekombinanter DNA-Technologie kombiniert wird, hat das Verständnis der verschiedenen Aspekte der Lebenszyklus des Virus auf molekularer Ebene wie Genexpression 73,79 und die Genomreplikation 63,64 erhöht. Außerdem ist ein Volllängen-JEV cDNA-Klon hat sich als ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung von antiviralen Impfstoffen 28 und Genübertragungsvektoren können. &lt;sup&gt; 80,81 Wie bei allen Positivstrang-RNA-Viren gibt es mehrere wichtige Schritte bei der Konstruktion eines zuverlässigen Funktions cDNA für JEV, aus dem hochinfektiösen RNAs können in vitro synthetisiert werden. Idealerweise sollte die Sequenz der synthetischen RNAs aus einem Klon der Volllängen-cDNA transkribiert identisch sein zu derjenigen der genomischen Virus-RNA, insbesondere die 5&#39;- und 3&#39;-terminalen Sequenzen, die für die Initiation der viralen RNA-Replikation erforderlich sind, . 60-62 In der aktuellen Protokolls der authentische 5&#39;-und 3&#39;-Enden wurden durch Anordnen der SP6-Promotorsequenz stromaufwärts des ersten Adeninnucleotid des viralen Genoms und Positionieren einer einzigartigen künstlichen Xba I-Restriktionsstelle stromabwärts des letzten sichergestellt Thymin Nukleotid des viralen Genoms sind. Capped synthetischen RNAs mit der authentischen 5 &#39;und 3&#39;-Enden wurden durch Run-off-Transkription einer Xba I-linearisiert und MBN behandelten cDNA te hergestelltmplate mit SP6 RNA-Polymerase mit der m 7 G (5 &#39;) ppp grundiert (5&#39;) eine Kappe analog. Dieses Protokoll kann auf verschiedene Weise modifiziert werden. Für in vitro-Transkription, eine andere Bakteriophagen-RNA-Polymerase (zB T3 oder T7) kann in Verbindung mit seinen gut definierten Promotor-Sequenz 27 als Run-off-Website verwendet werden. Kann eine andere Restriktionsstelle verwendet werden, wenn es nicht vorhanden sein, das virale Genom und wenn synthetische RNA aus dem linearisierten cDNA-Enden mit dem authentischen 3&#39;-Ende. Die Wichtigkeit des 3&#39;- Ende Nukleotidsequenz wurde durch einen ca. 10-fachen Verringerung der Infektiosität RNA nachgewiesen, wenn eine synthetische RNA enthält drei oder vier virus unabhängigen Nukleotide an seinem 3&#39;-Ende. 27 in einem in vitro-Transkriptions-Reaktion, sowohl die m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A und m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G cap Analog kann gleichermaßen verwendet werden, obwohl die letzteren Orte eine unabhängige zusätzliche G-Nukleotid stromaufwärts des viralen 5 &#39;-Ende, aber dasZusatz nicht die Infektiosität oder Replikation von synthetischer RNA verändern. 27 ist darüber hinaus nicht für die RNA-Infektiosität Prüfungen erforderlich Entfernen der cDNA-Matrize aus dem RNA-Transkripte durch DNase I-Verdau, da der cDNA-Matrize selbst ist nicht infektiös. 27 Die BAC-Technologie wurde nun auf den Bau infektiösen cDNA-Klone für eine Handvoll Positiv-Strang-RNA-Viren, nämlich zwei JEVs, CNU / LP2 27 und SA 14 -14-2 28 (Genomgröße, ~ 11 kb) zugrunde gelegt wurden; zwei Dengue-Viren, BR / 90 26 und NGC 29 (~ 11 kb); das Virus der bovinen Virusdiarrhoe, SD1 (~ 12 kb); 25 zwei KSP-Viren, C und Paderborn (~ 12 kb); 24 die Grenze Euche-Virus, Gifhorn (~ 12 kb); 24 das PRRS-Virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 die Transmissible Gastroenteritis Virus PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 die Feline Infektiöse Peritonitis-Virus,DF-2 (~ 29 kb); 32 das schwere akute Atemwegssyndrom Coronavirus, Urbani (~ 30 kb); 9 der MERS-CoV, EMC / 2012 (~ 30 kb); 17 und der menschlichen Coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31. Der Hauptvorteil der Verwendung BACs für die cDNA-Konstruktion ist der hohe genetische Stabilität der großen, 1- oder 2-copy BAC-Plasmide. jedoch ist die intrinsische Natur ihrer extrem niedrigen Kopienzahl auch ein großer Nachteil, wegen der sehr geringen Ausbeuten von BAC-DNA und der daraus folgenden Verringerung der Reinheit der BAC-DNA in Bezug auf die chromosomale DNA beherbergen. Im aktuellen Protokoll wird die Ausbeute von BAC-DNA durch wachsende E. maximiert coli DH10B transformiert mit dem infektiösen BAC pBAC / SA 14 -14-2 in einem nährstoffreichen Medium, 2xYT. Trotz dieser Bemühungen ist das mittlere Ausbeute nur ~ 15 ug BAC-DNA aus 500 ml 2 × YT-Brühe. Auch ist die Reinheit des BAC-DNA am besten mit CsCl-EtBr-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung erreichtAnstelle des üblicherweise verwendeten spaltenbasierten Plasmidisolierung. Allerdings ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass die BAC-transformierten E. coli sollte nicht überwuchern, denn es könnte die genetische Stabilität des geklonten cDNA zu gefährden, und ein höheres Wachstum nicht zwangsläufig zu größeren Ausbeuten oder höhere Reinheit BAC DNA führen. Das hier beschriebene Protokoll ist eine optimierte, effiziente und gestraffte Verfahren für den Bau und die Ausbreitung eines genetisch stabil voller Länge infektiösen cDNA-Klon als BAC für JEV, ein Verfahren einmal dachte, praktisch unmöglich. Diese gleichen Klonierungsstrategie kann auch auf viele andere Positiv-Strang-RNA-Viren angewendet werden. Im allgemeinen infektiöse cDNA-Klone ermöglichen es uns, eine Vielzahl von Mutationen (zB Deletionen, Insertionen und Punktmutationen) zu einer viralen RNA-Genom einzuführen, um ihre biologischen Funktionen in die virale Replikation und Pathogenese studieren. Diese cDNA-basierte reversen Genetik-System macht es möglich, zu entwickeln und zu test-Impfstoff und therapeutischen Kandidaten gezielt ein Virulenzfaktor (n) eines bestimmten Positiv-Strang-RNA-Virus von Interesse. Darüber hinaus kann diese infektiösen cDNA-Technologie auch als ein viraler Vektor, der fähig ist, ein fremdes Gen (en) von Interesse exprimieren, für viele Anwendungen in der biomedizinischen Forschung eingesetzt werden.

Für RNA virologists, die in der rekombinanten DNA-Technologie in den späten 1970er Jahren wurde es möglich, die virale RNA-Genome in cDNA-Klonen, die dann als Plasmide in Bakterien, die für die genetische Manipulation von RNA-Viren vermehrt werden konnten konvertieren. 1 Die erste RNA-Virus zu sein, molekular kloniert wurde Bakteriophage Qß, ein Positiv-Strang-RNA-Virus, das Escherichia coli infiziert. Ein Plasmid, das eine vollständige cDNA Kopie des Qß-Genom-RNA führte zu Infektions Qß-Phagen, wenn sie in E. eingeführt coli. 2 Kurz danach wurde diese Technik auf Poliovirus angewendet wird, ein Positiv-Strang-RNA-Virus, von Menschen und Tieren. Ein Plasmid, das für ein Volllängen-cDNA des Poliovirus-Genom-RNA infektiös, wenn es in Säugerzellen transfiziert und in der Lage, infektiöse Virionen 3 In diesem &quot;DNA-aufgelegt&quot; Ansatzes sollte die klonierten cDNAs intrazellulär transkribiert, um virale RNA-Replikation zu initiieren.Es ist jedoch unklar, wie die Transkription initiiert wird, und wie die Transkripte werden auf die richtige Virussequenz verarbeitet. Dieses Anliegen wurde für die Entwicklung eines alternativen &quot;RNA-ins Leben gerufen&quot; orientierten Ansatz, wobei eine vollständige cDNA-Kopie der viralen RNA-Genom unter einem Promotor, der von einem E. erkannt geklont coli oder Phagen-RNA-Polymerase zur Herstellung von synthetischen RNAs in vitro mit definierten 5&#39;- und 3&#39;-Enden, die, wenn sie in Wirtszellen eingeführt das vollständige virale Replikationszyklus durchlaufen. 4,5 Der erste Erfolg mit diesem Ansatz wurde für Brommosaikvirus gemeldet , 6,7 eine positive Strang RNA-Virus von Pflanzen. Seitdem hat sich der RNA-ins Leben gerufen Ansatz für eine breite Palette von Positivstrang-RNA-Viren, einschließlich Caliciviren, Alphaviren, Flaviviren, Arteriviren und Coronaviren entwickelt. 1,4,5,8 Sowohl in der DNA- und RNA-aufgelegt reversen Genetik Systemen die Konstruktion eines volll cDNA-Klon ist der Schlüssel zum Erzeugen von infektiösen DNA oder RNA von Positivstrang-RNA-Viren, aber es wird eine beträchtliche technische Herausforderung dar, wenn die Größe des viralen Genoms zunimmt. 9-17 Insbesondere ein großer RNA Genom von ~ 10 -32 kb präsentiert drei Haupthindernisse für das Klonen von voller Länge funktionellen cDNA. 18 Die erste Schwierigkeit ist die Synthese eines treuen cDNA zu kopieren, da die Wiedergabetreue der RT-PCR ist umgekehrt proportional zur Länge der viralen RNA. Die zweite Hürde ist die Anwesenheit von potentiell toxischen Sequenzen, da lange RNA-Moleküle sind eher unerwartete Sequenzen, die zur Herstellung des cDNA-Fragments in die Plasmide instabil in E. enthalten coli. Der dritte und kritische Punkt ist die Verfügbarkeit eines geeigneten Vektors, da es schwierig ist, einen Klonierungsvektor, der eine virale cDNA-Insert von&gt; 10 kb aufnehmen kann, zu finden. In den vergangenen drei Jahrzehnten haben diese Barrieren durch einige Fortschritte in der Enzymologie, Methodik, eine überwundend Vektorologie. 1,4,5,8 Davon ist die vielversprechendsten und innovativsten Entwicklungs das Klonen von großen positiven Strang RNA-Viren, wie infektiöse bakterielle künstliche Chromosomen (BACs). Der BAC-Vektor ein low-copy Klonierungsplasmid (1-2 Kopien / Zelle) auf der Grundlage der E. coli F-Plasmid, mit einem Durchschnitt DNA Insertgröße von ~ 120-350 kb 19-21 Ein DNA-Fragment wird in den BAC-Vektor in einer ähnlichen Weise wie die Klonierung in allgemeinen Klonierungsvektoren eingeführt. die resultierenden BAC-Klone sind über viele Generationen in E. stabil coli. 22,23 Bisher wurde die BAC-Technologie wurde verwendet, um infektiöse cDNA-Klone für&gt; 10 Mitglieder von drei Positivstrang RNA Virusfamilien, also Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 und Coronaviridae erstellen. 9,16,17 , 31,32 Verwendung Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) als Beispiel, berichtet die vorliegende Arbeit die detaillierten Verfahren, die sein können,verwendet, um eine genetisch stabil voller Länge infektiös BAC für eine Vielzahl von Positiv-Strang-RNA-Viren zu konstruieren. JEV ist eine zoonotische Flavivirus 33, die in der Natur zwischen Vögeln, Schweinen und anderen Wirbeltierwirten durch Mückenvektoren übertragen wird. 34,35 Beim Menschen kann JEV-Infektion die schwere oft tödliche neurologische Erkrankung Japanische Enzephalitis verursachen (JE), 36, die in auftritt Asien und Teilen des Westpazifik, 37,38 mit einem geschätzten jährlichen Inzidenz von ~ 50,000-175,000 klinische Fälle. 39,40 Das Genom der JEV ist ein ~ 11-kb, einzelsträngig, positive Sense-RNA-Molekül und besteht aus einen einzelnen offenen Leserahmen (ORF), die durch zwei nicht-kodierenden Regionen (NCR) am 5 &#39;und 3&#39; flankiert endet. 41,42 Der ORF codiert ein Polyprotein, das von Host und virale Proteasen gespalten wird, um 10 einzelne Proteine ​​zu erzeugen, bezeichnet als C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B und NS5 in N- zu C-terminalen Richtung. 34,43,44 Auch eine EXtended Form von NS1 (NS1 &#39;) von ribosomalem -1-Leserastersprung an den Codons 8-9 von NS2A ausgedrückt. 45,46 Von diesen 11 Proteine, sind die drei Strukturproteine ​​(C, prM und E) für die Bildung von Infektions Virionen, 47,48 und die verbleibenden acht strukturelle Proteine ​​(NS1 bis NS5 und NS1) sind von entscheidender Bedeutung für die virale RNA-Replikation, 49-51 Partikelzusammenlagerung, 52-56 und angeborenen Immunität Flucht. 57-59 Sowohl die 5 &#39;und 3 &#39;NCRs enthalten konservierte Primärsequenzen und Form RNA sekundäre / ​​tertiäre Strukturen, 60-62, die wichtig für die Modulation Virus-RNA-Replikation sind. 63,64 Dieses Protokoll beschreibt die Werkzeuge, Verfahren und Strategien zur Erzeugung eines Volllängen-infektiösen BAC von JEV SA 14 -14-2. 28 diese Funktions BAC-Klon enthält eine vollständige cDNA-Kopie des JEV genomische RNA, 65, die durch einen Promotor umfasst ist für die SP6-RNA-Polymerase stromaufwärtsdes viralen 5&#39;-Ende und eine einzigartige Xba I-Restriktionsstelle stromabwärts von der viralen 3&#39;-Ende für eine in vitro run-off-Transkription. Dieser BAC-Technologie anwendbar ist, um eine voll funktionsfähige Konstruktion cDNA molekularen Klon für eine Reihe von Positivstrang-RNA-Viren.

<table><tbody><tr><td><stark>1. Molecular Cloning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Bouillon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[3H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioaktiv</td></tr><tr><td>50 ml Tube</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Flasche</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (niedriger Schmelzpunkt)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>Neu England BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cäsiumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>krebserregend</td></tr><tr><td>DE-81 Filterpapier</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH10B&nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>Giftige und hochgradig mutagene</td></tr><tr><td>Filtersäule (Plasmid Maxiprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Reizende</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Isoamylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>Entzündliches</td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Entflammbare</td></tr><tr><td>LB-Bouillon</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transkriptase</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Mungobohnen-Nuklease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>Nadel (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>biologisch gefährlich (scharfe Abfälle)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S Oligonukleotid</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>Kundenspezifische Oligonukleotidsynthese</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Phenol (puffergesättigt)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Giftiges und stark ätzendes</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Giftiges und stark ätzendes</td></tr><tr><td>Phenol:Guanidin-Isothiocyanat</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Giftiges, ätzendes und reizendes</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP-Set</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Verschließbares Polypropylen-Rohr (16 x 76 mm) & nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA-Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Spin Säule (Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (Hefe)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>2. Zellkultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Röhrchen (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Kulturschale (150 mm)&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Küvette (2 mm Abstand)</td><td>Harvard Apparatur</td><td>450125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Giftiges und krebserregendes</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Sechs-Well-Platte</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies ( Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vitamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>3. Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Gel-Elektrophorese-System</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Desktop-Zentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Harvard Gerät</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Langwellen-UV-Lampen (Handheld)</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

bakterielle künstliche chromosomen: a functional genomics-werkzeug für das studium der positiv-strang-rna-viren

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse Genetik, ein Ansatz zur vollständigen Rettung infektiöser Viren aus einer klonierten cDNA, hat das Gebiet der positivsträngigen RNA-Viren revolutioniert, deren Genome die gleiche Polarität wie zelluläre mRNA haben. Das cDNA-basierte reverse Genetiksystem ist eine bahnbrechende Methode, die eine direkte Manipulation der viralen genomischen RNA ermöglicht und dadurch rekombinante Viren für molekulare und genetische Studien sowohl viraler RNA-Elemente als auch von Genprodukten bei der viralen Replikation und Pathogenese erzeugt. Es bietet auch eine wertvolle Plattform, die die Entwicklung von genetisch definierten Impfstoffen und viralen Vektoren für die Verabreichung fremder Gene ermöglicht. Bei vielen positivsträngigen RNA-Viren wie dem Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) sind die klonierten cDNAs jedoch instabil, was ein großes Hindernis für den Aufbau und die Vermehrung der funktionellen cDNA darstellt. In diesem Artikel werden die strategischen Überlegungen zur Schaffung und Amplifikation einer genetisch stabilen infektiösen JEV-cDNA in voller Länge als bakterielles künstliches Chromosom (BAC) unter Verwendung der folgenden allgemeinen experimentellen Verfahren beschrieben: Isolierung viraler RNA, cDNA-Synthese, cDNA-Subklonierung und -Modifikation, Assemblierung einer cDNA in voller Länge, cDNA-Linearisierung, in vitro RNA-Synthese und Virusrückgewinnung. Dieses Protokoll stellt eine allgemeine Methode bereit, die anwendbar ist für die Klonierung von cDNA in voller Länge für eine Reihe von positivsträngigen RNA-Viren, insbesondere solche mit einem Genom von >10 kb Länge, in einen BAC-Vektor, von dem infektiöse RNAs in vitro mit einer Bakteriophagen-RNA-Polymerase transkribiert werden können.

Für alle Positivstrang-RNA-Viren, die Zuverlässigkeit und die Effizienz einer reversen Genetik System abhängig von der genetischen Stabilität eines klonierten cDNA voller Länge, deren Sequenz ist äquivalent zu der Konsensussequenz der genomischen Virus-RNA. 27. Figur 1 zeigt einen fünf- Schritt-Strategie für die Konstruktion eines Volllängen-infektiösen cDNA als BAC für JEV SA 14 -14-2 28: Schritt 1 Reinigung von viraler RNA aus der Zellkulturüberstand von JEV-infizierten BHK-21-Zellen (1A); Schritt 2 Synthese von vier überlappenden cDNA-Amplikons (F1 bis F4) überspannt die gesamte virale Genom (1B); Schritt 3 Subklonieren jedes der vier benachbarten cDNA-Fragmenten in einen BAC-Vektor, wodurch pBAC / F1 um pBAC / F4 (1C); Schritt 4 Abwandlung der klonierten cDNAs für in vitro-Run-off-Transkription mit SP6-RNA-Polymerase, das heißt, wobei sich der SP6Promotorsequenz unmittelbar stromaufwärts des viralen 5&#39;-Ende (pBAC / F1 SP6), wodurch eine bereits bestehende interne Xba I-Stelle am Nukleotid 9131 durch die Einführung einer stillen Punktmutation, A → T 9134 (pBAC / F3 KO) und das Einfügen eine neue künstliche Xba I run-off-Stelle unmittelbar stromabwärts der viralen 3&#39;-Ende (pBAC / F4 RO) (1D); und Schritt 5, Montage von einer Volllängen-SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (1E). In Tabelle 1 sind die in diesem Klonierungsverfahren verwendeten Oligonukleotide. 28 Für die Konstruktion eines funktionalen JEV cDNA ist ein erster wichtiger Schritt bei der Synthese der vier überlappenden cDNA-Fragmente unter Verwendung der gereinigten viralen RNA als Matrize für die RT-PCR. 2 stellt ein repräsentatives Ergebnis für die vier RT-PCR-Produkte waren auf einem 0,8%Agarose-Gel. Dieses Gel zeigt deutlich, dass ein voller Länge JEV cDNA ist in vier überlappenden cDNA-Fragmente amplifiziert. Gelegentlich kann RT-PCR-Reaktionen ein oder mehrere weitere virusspezifische oder nicht-spezifische Produkte, die meist kleiner als die erwarteten Produkts zu ergeben, wegen der nicht-spezifischen Anlagerung der Primer bei der cDNA-Synthese / Amplifikation. Andererseits wenig oder keine erwartete RT-PCR-Produkt würde aufgrund zufälliger RNase Kontamination während der viralen RNA-Isolierung oder unsachgemäße RT-PCR-Technologie amplifiziert sein. Der nächste Schlüsselschritt ist die Clonierung und Modifikation einer Teil- oder Volllängen-JEV cDNA in BAC, die eine relativ einfache Prozedur, die von rekombinanten Standard-DNA-Techniken verwendet, ist. 69 3 stellt ein repräsentatives Ergebnis für die Reinigung des BAC-Klon, eine cDNA voller Länge des JEV SA 14 -14-2 durch Streifenbildung in einem CsCl-Gradienten EtBr.In diesem Experiment wurde nach Zentrifugation für 16 Stunden bei 401.700 × g, zwei getrennte Banden, dh der E. coli chromosomale DNA oben und die supercoiled BAC-Plasmid-DNA unter, sind in der Mitte des Rohres unter langwelligem UV-Licht sichtbar. Ein minimales Volumen (~ 400 &amp; mgr; l) des unteren BAC-DNA-Bande wurde vorsichtig durch das Stoßen ein Loch mit einer Spritze auf der Seite der Röhrchen gesammelt. Anschließend wurde das Ethidiumbromid aus dem BAC-DNA durch Butanolextraktion extrahiert und der EtBr freien BAC DNA wurde durch Ethanolfällung konzentriert. Der letzte Schritt ist die Bestimmung der spezifischen Infektivität der synthetischen RNAs in vitro aus dem Volllängen-SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) nach der RNA-Transfektion in permissive Zellen (Figur 4) transkribiert. Dieser Schritt erfolgt in drei aufeinanderfolgenden Schritten: Schritt 1, Linearisierung des Volllängen-SA 14 -14-2-cDNA am 3&#39;-Ende des viralen Genoms (4A); Schritt 2 Herstellung von synthetischen RNAs, die von dem linearisierten cDNA durch Run-off-Transkription (4B); und Schritt 3, Rettung der rekombinanten Viren in BHK-21-Zellen mit den synthetischen RNAs (4C) transfiziert. Experimentell wurden zwei unabhängige Klone von pBAC / SA 14 -14-2 mit XbaI Verdau linearisiert und mit MBN behandelt, um das Vier-Basen 5&#39;-Überhang von der XbaI-Verdauung erzeugten entfernen. Die linearisierten BACs wurden durch Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt, gefolgt von Ethanolfällung. Die Linearisierung der beiden gereinigten BACs wurde auf einem 0,8% igen Agarosegel (5A) demonstriert. Die Phenol-Chloroform-Extraktion muss sorgfältig durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß die linearisierte BACs RNase-frei. Jeder der beiden linearisierte BACs diente als Vorlage für die cDNA Ablauf Transkription unter Verwendung von SP6 RNA-Polymerase in Gegenwart der m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Eine Kappe analog. Die Integrität der synthetischen RNAs wurde durch Ausführen von Aliquots der zwei Transkriptionsreaktionsgemische auf einem 0,6% igen Agarosegel zusammen mit einer Referenz 1 kb DNA-Leiter (5B) dargestellt ist. In diesem einfachen Test, der Haupt prominenten RNA band stets nur migriert unterhalb der 3 kb Referenz DNA-Bande und erschien scharf sein. Allerdings verschlechtert RNA würde eine verschmierte Aussehen auf dem gleichen Gel müssen. Eine Infektionszentrum Assay ist der Goldstandard für die Bestimmung der spezifischen Infektiosität der synthetischen RNAs. Dieser Assay wurde durch Elektroporation von BHK-21-Zellen, die mit RNA-Proben, die Beimpfung gleiche Aliquots der 10-fach seriell verdünnt elektroporierten Zellen in 6-Well-Platten, die naive BHK-21-Zellen (3 × 10 5 Zellen / Well), und Überlagern Agarose getan auf die Zellmonoschichten. Nach einer Inkubationszeit von 4 Tagen wurden die überlebenden Zellen mit Formaldehyd fixiert und mit einer Kristallviolett gebeiztolution um die Anzahl der Infektionszentren (Plaques), die die Anzahl der in den Zellen (6A) geliefert infektiöse RNA-Moleküle entspricht quantifizieren. Da die cDNA-Matrize für die in vitro Transkription eingesetzt wurde, erwiesen sich als nicht-infektiös wurde 27 ein Aliquot der Transkriptionsreaktionsmischung direkt für die Elektroporation verwendet. Elektroporation ist die bevorzugte Methode zur RNA-Transfektion; alternativ kann RNAs durch andere Verfahren unter Verwendung von DEAE-Dextran und kationischen Liposomen transfiziert werden. RNA Elektroporation ist sehr effektiv, aber &quot;Lichtbogenbildung&quot; des elektrischen Impulses tritt selten, wenn Salze in der Reaktions Elektroporation oder die Elektroporationsküvette wiederverwendet vorliegen. Die Expression von viralen Proteinen in RNA-transfizierten Zellen wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Anti-NS1 Kaninchen-Antiserum (6B) untersucht. Die Produktion von Viruspartikeln in den Überständen von RNA-transfizierten Zellen akkumuliert wardurch Plaque-Assays (6C) sierten. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen deutlich, dass die cDNA-abgeleitete synthetische RNAs sind infektiös in permissiven BHK-21-Zellen, wodurch eine hohe Titer von rekombinanten Viren. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonukleotid </td><td> Sequenz A (5 &#39;nach 3&#39;) </td><td> Position b </td><td> Polarität </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td> Sinn </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> Ameiseich spüre </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Sinn </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Sinn </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10.952-10.977 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Sinn </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956-10.977 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ta </td><td></td><td> Sinn </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Sinn </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> X1f </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Sinn </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Sinn </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisense- </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10670-10694 </td><td> Sinn </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10.954-10.977 </td><td> Antisense- </td></tr><tr><td colspan="4"> ein JEV-Sequenzen werden in Großbuchstaben angezeigt, und BAC-Sequenzen werden in Kleinbuchstaben angegeben. b Nukleotid-Position bezieht sich auf die komplette Genomsequenz von JEV SA 14 -14-2 (Genbank-Zugangsnummer JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Oligonukleotide, die für die cDNA-Synthese, PCR-Amplifikation und BAC-Mutagenese verwendet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Abbildung 1.0; Strategie für die Konstruktion einer cDNA voller Länge von JEV SA 14 -14-2 als BAC (A) Isolierung von viraler RNA aus JEV Teilchen.. Gezeigt ist eine schematische Darstellung der genomischen RNA des JEV SA 14 -14-2. (B) Synthese von vier überlappenden cDNA-Fragmente (F1 bis F4), die den gesamten Virusgenom. (C) Subklonierung von vier überlappenden cDNA-Fragmente in einen BAC-Vektor, die Schaffung pBAC / F1 bis pBAC / F4. (D) Änderung der geklonten cDNAs für Run-off-Transkription in vitro. pBAC / F1 SP6 ist ein Derivat von pBAC / F1, der die SP6-Promotorsequenz stromaufwärts des viralen 5&#39;-Ende enthält. pBAC / F3 KO ist ein Derivat der pBAC / F3, die eine stille Punktmutation (A 9134 → T, Sternchen) enthält. pBAC / F4 RO ist ein Derivat der pBAC / F4, die eine künstliche Xba I run-off-Stelle stromabwärts der viralen 3&#39;-Ende enthält. (E </<html> strong&gt;) Montage eines in voller Länge SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Abbildung 2. Synthese von vier überlappenden cDNA-Fragmente (F1 bis F4) überspannt den in voller Länge genomischen RNA des JEV SA 14 -14-2. Die vier RT-PCR-Produkte werden durch Elektrophorese in einem 0,8% Agarosegel bewertet. M, 1 kb DNA-Leiter. Die erwarteten Größen der vier cDNA-Fragmente werden am unteren Rand des Gels Bild angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Die Reinigung des BAC, das eine cDNA voller Länge des JEV SA 14 -14-2. Die BAC-Plasmid von E. isoliert coli DH10B durch die SDS-Alkali-Lyse-Verfahren und durch Streifenbildung in einem CsCl-EtBr-Gradienten gereinigt. Präsentiert wird, ist ein Beispiel für die CsCl-Gradienten EtBr mit einem 16 × 76 mm verschließbaren Polypropylenröhrchen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Abbildung 4. Überblick über die Rückgewinnung von infektiösen Viren aus einem in voller Länge JEV SA 14 -14-2 cDNA in einer BAC zusammengestellt. (A) Die Linearisierung der cDNA-Matrize. Die in voller Länge JEV BAC mit geschnittenXbaI und mit MBN behandelt. (B) Synthese der RNA-Transkripte. Das linearisierte cDNA durch SP6-RNA-Polymerase in Gegenwart der m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) eine Kappe analogen transkribiert. (C) Die Gewinnung des synthetischen JEVs. Die in vitro transkribierte RNAs werden in BHK-21-Zellen durch Elektroporation, die einen hohen Titer von synthetischen Virus erzeugt transfiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figur 5. Synthese der RNAs durch in vitro Transkription unter Verwendung einer Volllängen-JEV BAC als cDNA-Templat. (A) Herstellung des linearisierten Volllängen JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Zwei unabhängige Klone von pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 und Cl.2) durch Verdau mit XbaI und anschließende Behandlung mit MBN linearisiert. Die linearisierten BACs werden durch Elektrophorese in einem 0,8% igen Agarosegel untersucht. (B) Herstellung der synthetischen RNAs durch Run-off-Transkription. Jeder der beiden linearisierte BACs wird als Matrize für die SP6-RNA-Polymerase-Run-off-Transkription eingesetzt. Aliquots der beiden Transkriptionsreaktionen werden auf einem 0,6% Agarosegel laufen gelassen. M, 1 kb DNA-Leiter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figur 6. spezifische Infektiosität der synthetischen RNAs, die von einer Volllängen-JEV BAC und die Gewinnung synthetischer virus transkribiert. BHK-21-Zellen mock-elektroporiert (Mock), oder durch Elektroporation mit den RNA-Transkripten hergeleitet sind from jede der beiden unabhängigen Klonen von voller Länge JEV BAC (Cl.1 und Cl.2). (A) RNA-Infektiosität. Die Zellen werden mit Agarose überschichtet und mit Kristallviolett gefärbt bei 4 Tage nach der Transfektion. RNA-Infektiosität durch infectious center Tests bestimmt, um die Menge der infektiösen RNA in die Zellen (links) elektroporiert abzuschätzen. Auch sind repräsentative Bilder von Infektionszentren dargestellt (rechtes Bild). (B) Proteinexpression. Die Zellen sind in 4-Well-Kammerobjektträgern kultiviert. Virale Proteinexpression in RNA-elektroporierten Zellen bei 20 Stunden nach der Transfektion (hpt) durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines primären anti-NS1 Kaninchen-Antiserum und einer Sekundär Cy3-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (rot) analysiert. Die Kerne werden mit 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (blau) gegengefärbt. Die Immunfluoreszenz-Bilder werden auf ihre entsprechenden Differentialinterferenzkontrastbilder überlagert. (C) Virus-Ausbeute. Die Zellen werden in 1 kultiviert50 mm Kulturschalen. Die Produktion von infektiösen Virionen in den Kulturüberständen von RNA-elektroporierten Zellen bei 22 und 40 hpt sammelt wird durch Plaque-Assays untersucht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier wird ein Protokoll zur Erstellung eines infektiösen bakteriellen künstlichen Chromosoms vorgestellt, das eine cDNA in voller Länge der positivsträngigen genomischen RNA des Japanischen Enzephalitis-Virus enthält. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine funktionsfähige cDNA anderer positivsträngiger RNA-Viren zu konstruieren, was es zu einem leistungsstarken genomischen Werkzeug für die Untersuchung der Virusbiologie macht.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, infektiöse Viruspartikel zu erzeugen, die vollständig aus einem geklonten cDNA-Molekül positivsträngiger RNA-Viren stammen, deren Genome dieselbe Polarität wie zelluläre mRNA aufweisen, beispielsweise des japanischen Enzephalitis-Virus. Diese auf cDNA basierende Reverse Genetik ist eine wegweisende Methode, die eine direkte Manipulation der viralen genomischen RNA ermöglicht und somit die Erzeugung rekombinanter Viren für molekulare und genetische Untersuchungen der viralen Replikation und Pathogenese erlaubt. Diese Technik bietet zudem eine wertvolle Plattform, die die Entwicklung genetisch definierter Vaccinia-Virusvektoren für die Expression fremder Gene ermöglicht.Diese Methoden eignen sich zum Klonieren von kompletten cDNA-Konstrukten für RNA-Viren negativer oder positiver Polarität, insbesondere solcher mit Genomen größer als 10 kb. Die Durchführung des Verfahrens wird von mehreren Mitgliedern meines Labors demonstriert: der wissenschaftliche Mitarbeiter Sang-Im Yun, die Postdoktoranden Byung-Hak Song und Jin-Kyoung Kim sowie der Studierende Jordan Frank.Der Videoteil dieser Veröffentlichung behandelt die Herstellung des bakteriellen künstlichen Chromosoms, das die Sequenzen von Interesse enthält, die Synthese der aus dem Rück-Plasmid transkribierten RNA sowie die Messung der Infektiosität der RNA und der Virusausbeute. Alle Verfahren, die vor der Erzeugung des BAC-Plasmids durchgeführt werden, sind im Textprotokoll ausführlich beschrieben. Zunächst wird für dieses Verfahren ein einzelner Kolonie von E. coli DH10B, das das BAC-Plasmid trägt, in drei Milliliter 2X-YT-Brühe mit Chloramphenicol angezogen. Die Kultur wird 10 Stunden bei 35 Grad Celsius unter Schütteln mit 225 bis 250 U/min inkubiert.Nach 10 Stunden die Kultur vergrößern. Anschließend 500 Mikroliter des Wachstums in 500 Milliliter Medium impfen und das Inokulum sechs Stunden lang unter starkem Schütteln kultivieren. Nach sechs Stunden die Bakterienkultur in zwei 250-Milliliter-Flaschen bei 3.100 ×g 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Danach jedes Pellet in jeweils 30 Milliliter GTE-Lösung resuspendieren.Fügen Sie 500 Mikroliter Lysozym zu und inkubieren Sie die Suspensionen 10 Minuten auf Eis. Bereiten Sie derweil frische Lysepufferlösung für den nächsten Schritt vor. Nach 10 Minuten geben Sie 60 Milliliter der Lysepufferlösung hinzu und mischen durch Schwenken, bis die Lösung klar erscheint.Lassen Sie die Reaktionen 10 Minuten bei Raumtemperatur laufen. Fügen Sie anschließend 45 Milliliter Neutralisierungslösung zu jeder Flasche hinzu und kippen Sie die Flaschen um, bis sie gründlich vermischt sind. Stellen Sie sie dann 10 Minuten lang auf Eis.Sammeln Sie die neutralisierten Lysate durch Zentrifugation bei hoher ×g-Kraft unter Kühlung. Sammeln Sie anschließend die Überstände in zwei neue 250-Milliliter-Flaschen. Geben Sie 0,6 Volumina 100 % Isopropanol zu jedem hinzu und stellen Sie sie 20 Minuten lang auf Eis.Als Nächstes die Niederschläge abzentrifugieren, die Überstände verwerfen und die Pellets in fünf Milliliter TE-Puffer auflösen. Die beiden Volumina in einem einzigen 50-Milliliter-Röhrchen vereinigen und die RNA durch Zugabe eines gleichen Volumens fünfmolaren Lithiumchlorids ausfällen lassen, wobei das Gemisch zehn Minuten auf Eis inkubiert wird. Den RNA-Niederschlag durch eine 20-minütige kalte Zentrifugation gewinnen.Anschließend den Überstand in ein neues 250-Milliliter-Gefäß überführen, zwei Volumina 100 % Isopropanol hinzufügen und das Gefäß auf Eis stellen, damit sich das DNA-Präzipitat bildet. Nach 20 Minuten das Präzipitat abzentrifugieren, den Überstand abpipettieren, den DNA-Pellet in 9,5 Milliliter TE-Puffer resuspendieren und die DNA-Lösung in ein 50-Milliliter-Gefäß überführen.Fahren Sie mit der Vorbereitung fort, indem Sie den Cäsiumchlorid-Gradienten mit Bromidäthidium herstellen. Geben Sie die Mischung mit einer Spritze und einer 18-Gauge-Nadel in ein verschließbares Polypropylenrohr und verschließen Sie das Rohr. Zentrifugieren Sie das verschlossene Rohr über Nacht in einem Ultrazentrifugengerät, um einen Cäsiumchlorid-Gradienten zu bilden.Am nächsten Tag sammeln Sie ein DNA-Band des BAC-Plasmids aus dem Cäsiumchlorid-Gradienten. Verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um eine Luftöffnung an der Oberseite des Gradienten zu erzeugen, und eine 20-Gauge-Nadel mit Spritze, um die BAC-DNA von der Seite des Gradienten zu sammeln. Überführen Sie die Probe anschließend in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie eine Waschung durch, geben Sie 2,5 Volumina wassergesättigten Butanol hinzu und mischen Sie durch normales Vortexen.Zentrifugieren Sie die Mischung anschließend bei Raumtemperatur und überführen Sie die untere wässrige Phase in ein neues 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt sechsmal, um das gesamte Ethidiumbromid zu entfernen. Fällen Sie nun die BAC-DNA aus. Geben Sie ein Zehntelvolumen einer 3-molaren Natriumacetat-Lösung und 2,5 Volumina 100 %igen Ethanols in das Röhrchen. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie anschließend das Präzipitat bei Raumtemperatur und waschen Sie den DNA-Pellet mit einem Milliliter 70 %igem Ethanol. Wiederholen Sie die Zentrifugation und sammeln Sie den Pellet erneut ein. Trocknen Sie den DNA-Pellet abschließend 10 Minuten lang lufttrocken und lösen Sie ihn in 200 Mikrolitern TE-Puffer auf.Beginnen Sie mit einer großskaligen Restriktionsenzymverdauung des BAC-Plasmids mit Xba-eins in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern. Führen Sie diesen Verdau bei 37 Grad Celsius über 12 bis 15 Stunden durch. Inkubieren Sie anschließend die Verdauungsansatz weitere zwei Stunden mit zusätzlichen 25 Einheiten Mung-Bohnen-Nuklease bei 30 Grad Celsius.Nach der Inkubation das Volumen mit destilliertem Wasser auf 300 Mikroliter auffüllen. Führen Sie nun eine Phenolextraktion durch, indem Sie eine gleiche Menge Phenol-Chloroform, Isoamylalkohol zur verdünnten Probe hinzufügen, eine Minute kräftig verwirbeln, das Gefäß abzentrifugieren und die obere wässrige Phase in ein neues Gefäß überführen.Wiederholen Sie anschließend die Extraktion mit Chloroform. Gewinnen Sie danach die linearisierte BAC-DNA durch Ethanolpräzipitation. Sammeln Sie das DNA-Pellet durch Zentrifugation, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter 70 %igem Ethanol. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und trocknen Sie das Pellet lufttrocken. Nach zehnminütiger Trocknung lösen Sie das DNA-Pellet in 30 Mikrolitern destilliertem Wasser auf. Untersuchen Sie anschließend ein Mikroliter der gewonnenen BAC-DNA in einem 0,8 %igen Agarosegel.Als Nächstes bereiten Sie eine 25-Mikroliter-Absetztranskription der linearisierten BAC-DNA vor, einschließlich tritiiertem UTP zur RNA-Quantifizierung. Führen Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius durch. Untersuchen Sie anschließend ein bis zwei Mikroliter der Absetztranskriptionsreaktion in einem 0,6 %igen Agarosegel.Beginnen Sie mit BHK-21-Zellen, die 24 Stunden lang in 150-Millimeter-Platten bei einer Dichte von 3 Millionen Zellen pro Platte kultiviert wurden. Spülen Sie den Zellmonolayer mit kalter Lösung A und lösen Sie die Zellen anschließend durch Trypsinisierung ab. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 270 ×g für zwei Minuten. Suspenderen Sie die Zellen anschließend in 50 Milliliter kalter Lösung A und zentrifugieren Sie erneut. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie die Zellen in Lösung A mit einer Dichte von 20 Millionen pro Milliliter. Anschließend mischen Sie ein 400-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension mit zwei Mikrogramm synthetischer RNA in einer 2-Millimeter-Küvette.Elektroporieren Sie die Mischung unverz&uuml;glich unter optimalen Bedingungen und lassen Sie die Zellen 10 Minuten ruhen. &Uuml;berf&uuml;hren Sie anschlie&szlig;end die Zellen in ein Mikrozentrifugenr&ouml;hrchen, das 600 Mikroliter komplettes Kulturmedium enth&auml;lt. Bereiten Sie nun zehnfache serielle Verd&uuml;nnungen der elektroporierten Zellen in Ein-Milliliter-Volumina vor. Impfen Sie jeweils 100-Mikroliter-Aliquote jeder Verd&uuml;nnung auf Monolagen normaler BHK21-Zellen aus. Nach einer Inkubation von vier bis sechs Stunden &uuml;berdecken Sie die Zellen mit 0,5&nbsp;% Agarose in MEM erg&auml;nzt mit FBS und kultivieren sie weitere vier Tage.BHK21-Zellen wurden entweder als Mock-Behandlung elektroporiert oder mit RNA-Transkripten, die von zwei unabhängigen Klonen des vollständigen JEV-BAC stammten, elektroporiert. Vier Tage später wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt, um die infektiöse RNA in den Zellen sichtbar zu machen. Mithilfe dieser Färbung wurden die infektiösen Zentren quantifiziert. Anschließend wurde die virale Proteinausprägung in den mit RNA elektroporierten Zellen 20 Stunden nach der Transfektion mittels Anti-NS1-Kaninchen-Antiserum und einem mit Cy3 konjugierten sekundären Antikörper, der rot erscheint, untersucht. Die Kerne wurden mit DAPI als Gegenfärbung blau dargestellt. Später, 22 und 40 Stunden nach der Transfektion, wurde die Produktion infektiöser Virionen, die sich in den Kulturüberständen der mit RNA elektroporierten Zellen angesammelt hatten, mittels Plaque-Assays analysiert.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man infektiöses Virus vollständig aus einem geklonten cDNA-Genom eines positiv-sinnigen RNA-Virus wie dem Japanischen Enzephalitis-Virus gewinnen kann. Vergessen Sie daher nicht, dass die Arbeit mit dem Japanischen Enzephalitis-Virus und anderen humanpathogenen Erregern äußerst gefährlich sein kann. Vor der Durchführung dieses Verfahrens ist eine angemessene Ausbildung im Bereich der Biosicherheit erforderlich.

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Research

Forschung

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In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um den pVAX1-PRRSV-Expressionsvektor durch Einführung geeigneter Restriktionsstellen am 3'-Ende der Inserts zu erhalten. Wir können den Vektor linearisieren und DNA-Fragmente durch homologe Rekombinationstechnologie nacheinander mit dem Vektor verbinden.

Ein nahtloser Klonierungsansatz für die Konstruktion von Expressionsvektoren für das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom

Wir beschreiben eine effiziente Methode, um Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA-und RNA-Molekülen aus Umwelt-virale Gemeinden zu trennen. Nukleinsäuren sind fraktionierte mit Hydroxyapatit-Chromatographie mit steigenden Konzentrationen von Phosphat-haltigen Puffer. Diese Methode erlaubt die Isolierung aller viralen Nukleinsäure-Typen aus Umweltproben.

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Erfahren Sie, wie man mit bakteriellen künstlichen Chromosomen infektiöse Viruspartikel aus geklonter cDNA von Positiv-Strang-RNA-Viren wie dem Japan-Enzephalitis-Virus rettet. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung rekombinanter Viren für die Virologieforschung und Impfstoffentwicklung.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

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