Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, infektiöse Viruspartikel zu retten, die vollständig aus einer klonierten CDNA von positiven Strang-RNA-Viren bestehen, deren Genome die gleiche Polarität wie zelluläre Mr.NA haben, wie z. B. das Japanische Enzephalitis-Virus. Diese CNA-basierte regenerative Genetik ist eine semiale Methode, die eine direkte Manipulation der viralen genomischen RNA ermöglicht und dadurch rekombinante Viren für molekulare und genetische Studien in der viralen Replikation und Pathogenese erzeugt. Diese Technik bietet auch eine wertvolle Plattform, die die Entwicklung genetisch definierter Impfstoff- und Virusvektoren für die Verabreichung fremder Gene ermöglicht.

Diese Gefäße sind anwendbar für die Klonierung von CDNA in voller Länge für RNA-Viren mit Länge oder positivem Stamm, insbesondere solche mit Genomen größer als 10 kb. Das Verfahren wird von mehreren Mitgliedern meines Labors, dem Forschungsassistenten Professor San Nun, dem Postdoktoranden UNG und Xing y Kim und den Studenten Jordan Frank demonstriert. Der Videoteil dieser Veröffentlichung befasst sich mit der Präparation des bakteriellen künstlichen Chromosoms, das die interessierenden Sequenzen enthält, der Synthese von RNA, die aus dem Rückenplasmid transkribiert wird, und der Messung der Infektiosität der RNA und der Virusausbeute.

Alle Verfahren, die vor der Erzeugung des Rückplasmids verwendet wurden, sind im Textprotokoll sehr detailliert beschrieben. Für dieses Verfahren wird zunächst eine einzelne Kolonie von e coli DH 10 B gezüchtet, wobei das Rückenplasmid in drei Millilitern von zwei XYT-Bouillons mit Chloramphenicol transportiert wird. Inkubieren Sie die Kultur 10 Stunden lang bei 35 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 225 bis 250 U/min.

Nach 10 Stunden skalieren Sie die Kultur hoch, impfen Sie dann 500 Mikroliter Wachstum in 500 Milliliter Medium und kultivieren Sie das Inokulum sechs Stunden lang mit kräftigem Schütteln nach sechs Stunden. Die Bakterienkultur wird in 2 250-Milliliter-Flaschen bei 3.100 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Dann resuspendieren Sie jedes Pellet in 30 Millilitern GTE-Lösung.

Fügen Sie 500 Mikroliter Lysozym hinzu und inkubieren Sie die Suspensionen 10 Minuten lang auf Eis. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine frische Lyselösung für den nächsten Schritt vor. Nach 10 Minuten 60 Milliliter der Lyselösung hinzufügen und durch Schwenken mischen, bis die Lösung klar erscheint.

Lassen Sie die Reaktionen 10 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Geben Sie anschließend 45 Milliliter Neutralisationslösung in jede Flasche und drehen Sie die Flaschen um, bis sie gründlich vermischt sind. Dann 10 Minuten auf Eis legen.

Sammeln Sie die neutralisierten Lysate mit der gekühlten Zentrifugation mit hohem G-Gehalt. Sammeln Sie dann die Überstände auf zwei neue 250-Milliliter-Flaschen. Fügen Sie jeweils 0,6 Volumen 100%iges Isopropanol hinzu und legen Sie sie 20 Minuten lang auf Eis.

Schleudern Sie dann die Ausfällungen herunter, verwerfen Sie die Überstände und lösen Sie die Pellets in fünf Millilitern TE-Puffer auf. Kombinieren Sie die beiden Volumina in einem einzigen 50-Milliliter-Röhrchen und fällen Sie die RNA aus, indem Sie ein gleiches Volumen von fünf molaren Lithiumchlorid hinzufügen und die Mischung 10 Minuten lang auf Eis inkubieren. Verwenden Sie eine 20-minütige Kaltzentrifugation, um den RNA-Niederschlag aufzufangen.

Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues 250-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie zwei Volumen 100%iges Isopropanol hinzu und legen Sie das Röhrchen auf Eis, damit sich der DNA-Niederschlag bildet. Nach 20 Minuten wird der Niederschlag heruntergeschleudert, der Überstand aspiriert, das DNA-Pellet in 9,5 Millilitern TE-Puffer resuspendiert und die DNA-Lösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt.

Fahren Sie mit der Zubereitung fort, indem Sie den Cäsiumchlorid-Gradienten mit einem Th. Diumbromid einstellen. Laden Sie die Mischung mit einer Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel in ein verschließbares Polypropylenröhrchen und verschließen Sie das Röhrchen. Schleudern Sie das verschlossene Röhrchen über Nacht in einer Ultrazentrifuge, um einen Cäsiumchlorid-Gradienten zu bilden.

Am nächsten Tag wird eine DNA-Bande des Rückplasmids aus dem Cäsiumchlorid-Gradienten entnommen. Verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um einen Belüftungsschlitz am oberen Rand des Gradienten zu erzeugen, und eine 20-Gauge-Nadel mit Spritze, um die hintere DNA von der Seite des Gradienten zu sammeln, und übertragen Sie dann die Sammlung auf ein 1,7-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Führen Sie eine Wäsche durch, fügen Sie 2,5 Volumen wassergesättigtes Butanol hinzu und mischen Sie es mit normalem Vortexing.

Dann zentrifugieren Sie das Gemisch bei Raumtemperatur und überführen die untere wässrige Phase in ein neues 1,7-Milliliter-Mikrofugeröhrchen. Wiederholen Sie diese Wäsche insgesamt sechsmal, um das gesamte Ethidiumbromid zu entfernen. Nun fällt die hintere DNA aus.

Geben Sie ein 10. Volumen von drei molaren Natriumacetat und 2,5 Volumen von 100% Ethanol in das Röhrchen. Die Mischung 10 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie dann den Niederschlag bei Raumtemperatur und waschen Sie das DNA-Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol

Wiederholen Sie das Schleudern und sammeln Sie das Kügelchen erneut ein. Zum Schluss trocknen Sie die pelletierte DNA 10 Minuten lang an der Luft und legen Sie sie in 200 Mikroliter TE-Puffer ein. Beginnen Sie mit einem groß angelegten Restriktionsenzymverdau des Rückenplasmids mit xbo.

Einer von insgesamt 100 Mikrolitern. Führen Sie diese Verdauung bei 37 Grad Celsius für 12 bis 15 Stunden durch. Als nächstes inkubieren Sie den Verdau mit weiteren 25 Einheiten Mungobohnen-Nuklease bei 30 Grad Celsius für zwei Stunden.

Bringen Sie nach der Inkubation das Volumen mit destilliertem Wasser auf 300 Mikroliter. Führen Sie nun eine Phenolextraktion durch, indem Sie der verdünnten Probe ein gleiches Volumen Phenolchloroform, Isoamylalkohol hinzufügen. Eine Minute lang kräftig vortexen, das Röhrchen nach unten drehen und die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen übertragen.

Wiederholen Sie dann die Extraktion mit Chloroform. Als nächstes gewinnen Sie die linearisierte Back-DNA durch Ethanolfällung zurück. Sammeln Sie das DNA-Pellet mit Zentrifugation, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol

Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und trocknen Sie das Pellet an der Luft. Nach 10 Minuten Trocknung lösen Sie das DNA-Pellet in 30 Mikrolitern destilliertem Wasser auf. Untersuchen Sie dann einen Mikroliter des zurückgewonnenen Rückens auf einem 0,8%igen AROS-Gel.

Als nächstes richten Sie eine 25-Mikroliter-Abflusstranskription der linearisierten Back-DNA ein, einschließlich tritiiertem UTP für die RNA-Quantifizierung. Führen Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius durch. Untersuchen Sie dann ein oder zwei Mikroliter der Abfluss-Transkriptionsreaktion auf einem 0,6%igen AROS-Gel.

Beginnen Sie mit BHK 21 Zellen, die 24 Stunden lang in 150-Millimeter-Schalen mit 3 Millionen Zellen pro Schale gezüchtet wurden. Spülen Sie die Zellmonoschicht mit kalter Lösung A ab und lösen Sie sie dann mit Trypsin. Sensibilisierung. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 270 GS für zwei Minuten.

Anschließend werden die Zellen in 50 Millilitern kalter Lösung A resuspendiert und wieder heruntergeschleudert. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal nach der letzten Wäsche. Resuspendieren Sie die Zellen bei 20 Millionen pro Milliliter in Lösung A. Mischen Sie dann ein 400-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension mit zwei Mikrogramm synthetischer RNA in einem Zwei-Millimeter-Vete.

Reinigen Sie die Mischung umgehend unter optimalen Bedingungen und lassen Sie die Zellen 10 Minuten ruhen. Anschließend werden die Zellen in ein Mikrofuge-Röhrchen mit 600 Mikrolitern vollständigem Nährmedium überführt. Bereiten Sie nun die zehnfache Serienverdünnung der elektroporierten Zellen in einem Millilitervolumen vor, plattieren Sie nach vier bis sechs Stunden Inkubation 100 Mikroliter Aliquots jeder Verdünnung auf Monoschichten normaler BHK 21-Zellen, überlagern Sie die Zellen mit 0,5%aros in MEM plus FBS und kultivieren Sie sie für weitere vier Tage.

Bhk 21-Zellen wurden pseudo-elektroporiert oder mit RNA-Transkripten elektroporiert, die von zwei unabhängigen Klonen des JEV in voller Länge stammten. Vier Tage später wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt, um die infektiöse RNA in den Zellen zu sehen. Anhand dieser Färbung wurden die infektiösen Zentren quantifiziert. Als nächstes wurde die Expression des viralen Proteins in elektroporierten RNA-Zellen 20 Stunden nach der Transfektion mit Anti-NS, einem Kaninchen-Antis-Serum und einem SI-Drei-konjugierten Sekundärantikörper untersucht, der in Rot dargestellt ist.

Die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt, die in Blau zu sehen sind. Später, 22 und 40 Stunden nach der Transfektion, sammelte sich die Produktion von infektiösen Varianen in der Kultur an. Überstände von RNA-elektroporierten Zellen wurden mittels Plaque-Assays untersucht.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie infektiöse Viren vollständig aus einem geklonten CNA eines positiven RNA-Stammes, wie z. B. dem Japanischen Enzephalitis-Virus, retten können. Vergessen Sie also nicht, dass die Arbeit mit einem Japanischen Enzephalitis-Virus und anderen menschlichen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann. Vor der Durchführung dieses Verfahrens ist eine angemessene Biosicherheitsschulung erforderlich.