Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, infektiöse Viruspartikel zu erzeugen, die vollständig aus einem geklonten cDNA-Molekül positivsträngiger RNA-Viren stammen, deren Genome dieselbe Polarität wie zelluläre mRNA aufweisen, beispielsweise des japanischen Enzephalitis-Virus. Diese auf cDNA basierende Reverse Genetik ist eine wegweisende Methode, die eine direkte Manipulation der viralen genomischen RNA ermöglicht und somit die Erzeugung rekombinanter Viren für molekulare und genetische Untersuchungen der viralen Replikation und Pathogenese erlaubt. Diese Technik bietet zudem eine wertvolle Plattform, die die Entwicklung genetisch definierter Vaccinia-Virusvektoren für die Expression fremder Gene ermöglicht.

Diese Methoden eignen sich zum Klonieren von kompletten cDNA-Konstrukten für RNA-Viren negativer oder positiver Polarität, insbesondere solcher mit Genomen größer als 10 kb. Die Durchführung des Verfahrens wird von mehreren Mitgliedern meines Labors demonstriert: der wissenschaftliche Mitarbeiter Sang-Im Yun, die Postdoktoranden Byung-Hak Song und Jin-Kyoung Kim sowie der Studierende Jordan Frank.

Der Videoteil dieser Veröffentlichung behandelt die Herstellung des bakteriellen künstlichen Chromosoms, das die Sequenzen von Interesse enthält, die Synthese der aus dem Rück-Plasmid transkribierten RNA sowie die Messung der Infektiosität der RNA und der Virusausbeute. Alle Verfahren, die vor der Erzeugung des BAC-Plasmids durchgeführt werden, sind im Textprotokoll ausführlich beschrieben. Zunächst wird für dieses Verfahren ein einzelner Kolonie von E. coli DH10B, das das BAC-Plasmid trägt, in drei Milliliter 2X-YT-Brühe mit Chloramphenicol angezogen. Die Kultur wird 10 Stunden bei 35 Grad Celsius unter Schütteln mit 225 bis 250 U/min inkubiert.

Nach 10 Stunden die Kultur vergrößern. Anschließend 500 Mikroliter des Wachstums in 500 Milliliter Medium impfen und das Inokulum sechs Stunden lang unter starkem Schütteln kultivieren. Nach sechs Stunden die Bakterienkultur in zwei 250-Milliliter-Flaschen bei 3.100 ×g 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Danach jedes Pellet in jeweils 30 Milliliter GTE-Lösung resuspendieren.

Fügen Sie 500 Mikroliter Lysozym zu und inkubieren Sie die Suspensionen 10 Minuten auf Eis. Bereiten Sie derweil frische Lysepufferlösung für den nächsten Schritt vor. Nach 10 Minuten geben Sie 60 Milliliter der Lysepufferlösung hinzu und mischen durch Schwenken, bis die Lösung klar erscheint.

Lassen Sie die Reaktionen 10 Minuten bei Raumtemperatur laufen. Fügen Sie anschließend 45 Milliliter Neutralisierungslösung zu jeder Flasche hinzu und kippen Sie die Flaschen um, bis sie gründlich vermischt sind. Stellen Sie sie dann 10 Minuten lang auf Eis.

Sammeln Sie die neutralisierten Lysate durch Zentrifugation bei hoher ×g-Kraft unter Kühlung. Sammeln Sie anschließend die Überstände in zwei neue 250-Milliliter-Flaschen. Geben Sie 0,6 Volumina 100 % Isopropanol zu jedem hinzu und stellen Sie sie 20 Minuten lang auf Eis.

Als Nächstes die Niederschläge abzentrifugieren, die Überstände verwerfen und die Pellets in fünf Milliliter TE-Puffer auflösen. Die beiden Volumina in einem einzigen 50-Milliliter-Röhrchen vereinigen und die RNA durch Zugabe eines gleichen Volumens fünfmolaren Lithiumchlorids ausfällen lassen, wobei das Gemisch zehn Minuten auf Eis inkubiert wird. Den RNA-Niederschlag durch eine 20-minütige kalte Zentrifugation gewinnen.

Anschließend den Überstand in ein neues 250-Milliliter-Gefäß überführen, zwei Volumina 100 % Isopropanol hinzufügen und das Gefäß auf Eis stellen, damit sich das DNA-Präzipitat bildet. Nach 20 Minuten das Präzipitat abzentrifugieren, den Überstand abpipettieren, den DNA-Pellet in 9,5 Milliliter TE-Puffer resuspendieren und die DNA-Lösung in ein 50-Milliliter-Gefäß überführen.

Fahren Sie mit der Vorbereitung fort, indem Sie den Cäsiumchlorid-Gradienten mit Bromidäthidium herstellen. Geben Sie die Mischung mit einer Spritze und einer 18-Gauge-Nadel in ein verschließbares Polypropylenrohr und verschließen Sie das Rohr. Zentrifugieren Sie das verschlossene Rohr über Nacht in einem Ultrazentrifugengerät, um einen Cäsiumchlorid-Gradienten zu bilden.

Am nächsten Tag sammeln Sie ein DNA-Band des BAC-Plasmids aus dem Cäsiumchlorid-Gradienten. Verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um eine Luftöffnung an der Oberseite des Gradienten zu erzeugen, und eine 20-Gauge-Nadel mit Spritze, um die BAC-DNA von der Seite des Gradienten zu sammeln. Überführen Sie die Probe anschließend in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie eine Waschung durch, geben Sie 2,5 Volumina wassergesättigten Butanol hinzu und mischen Sie durch normales Vortexen.

Zentrifugieren Sie die Mischung anschließend bei Raumtemperatur und überführen Sie die untere wässrige Phase in ein neues 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt sechsmal, um das gesamte Ethidiumbromid zu entfernen. Fällen Sie nun die BAC-DNA aus. Geben Sie ein Zehntelvolumen einer 3-molaren Natriumacetat-Lösung und 2,5 Volumina 100 %igen Ethanols in das Röhrchen. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie anschließend das Präzipitat bei Raumtemperatur und waschen Sie den DNA-Pellet mit einem Milliliter 70 %igem Ethanol. Wiederholen Sie die Zentrifugation und sammeln Sie den Pellet erneut ein. Trocknen Sie den DNA-Pellet abschließend 10 Minuten lang lufttrocken und lösen Sie ihn in 200 Mikrolitern TE-Puffer auf.

Beginnen Sie mit einer großskaligen Restriktionsenzymverdauung des BAC-Plasmids mit Xba-eins in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern. Führen Sie diesen Verdau bei 37 Grad Celsius über 12 bis 15 Stunden durch. Inkubieren Sie anschließend die Verdauungsansatz weitere zwei Stunden mit zusätzlichen 25 Einheiten Mung-Bohnen-Nuklease bei 30 Grad Celsius.

Nach der Inkubation das Volumen mit destilliertem Wasser auf 300 Mikroliter auffüllen. Führen Sie nun eine Phenolextraktion durch, indem Sie eine gleiche Menge Phenol-Chloroform, Isoamylalkohol zur verdünnten Probe hinzufügen, eine Minute kräftig verwirbeln, das Gefäß abzentrifugieren und die obere wässrige Phase in ein neues Gefäß überführen.

Wiederholen Sie anschließend die Extraktion mit Chloroform. Gewinnen Sie danach die linearisierte BAC-DNA durch Ethanolpräzipitation. Sammeln Sie das DNA-Pellet durch Zentrifugation, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter 70 %igem Ethanol. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und trocknen Sie das Pellet lufttrocken. Nach zehnminütiger Trocknung lösen Sie das DNA-Pellet in 30 Mikrolitern destilliertem Wasser auf. Untersuchen Sie anschließend ein Mikroliter der gewonnenen BAC-DNA in einem 0,8 %igen Agarosegel.

Als Nächstes bereiten Sie eine 25-Mikroliter-Absetztranskription der linearisierten BAC-DNA vor, einschließlich tritiiertem UTP zur RNA-Quantifizierung. Führen Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius durch. Untersuchen Sie anschließend ein bis zwei Mikroliter der Absetztranskriptionsreaktion in einem 0,6 %igen Agarosegel.

Beginnen Sie mit BHK-21-Zellen, die 24 Stunden lang in 150-Millimeter-Platten bei einer Dichte von 3 Millionen Zellen pro Platte kultiviert wurden. Spülen Sie den Zellmonolayer mit kalter Lösung A und lösen Sie die Zellen anschließend durch Trypsinisierung ab. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 270 ×g für zwei Minuten.

Suspenderen Sie die Zellen anschließend in 50 Milliliter kalter Lösung A und zentrifugieren Sie erneut. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie die Zellen in Lösung A mit einer Dichte von 20 Millionen pro Milliliter. Anschließend mischen Sie ein 400-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension mit zwei Mikrogramm synthetischer RNA in einer 2-Millimeter-Küvette.

Elektroporieren Sie die Mischung unverzüglich unter optimalen Bedingungen und lassen Sie die Zellen 10 Minuten ruhen. Überführen Sie anschließend die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 600 Mikroliter komplettes Kulturmedium enthält. Bereiten Sie nun zehnfache serielle Verdünnungen der elektroporierten Zellen in Ein-Milliliter-Volumina vor. Impfen Sie jeweils 100-Mikroliter-Aliquote jeder Verdünnung auf Monolagen normaler BHK21-Zellen aus. Nach einer Inkubation von vier bis sechs Stunden überdecken Sie die Zellen mit 0,5 % Agarose in MEM ergänzt mit FBS und kultivieren sie weitere vier Tage.

BHK21-Zellen wurden entweder als Mock-Behandlung elektroporiert oder mit RNA-Transkripten, die von zwei unabhängigen Klonen des vollständigen JEV-BAC stammten, elektroporiert. Vier Tage später wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt, um die infektiöse RNA in den Zellen sichtbar zu machen. Mithilfe dieser Färbung wurden die infektiösen Zentren quantifiziert. Anschließend wurde die virale Proteinausprägung in den mit RNA elektroporierten Zellen 20 Stunden nach der Transfektion mittels Anti-NS1-Kaninchen-Antiserum und einem mit Cy3 konjugierten sekundären Antikörper, der rot erscheint, untersucht. Die Kerne wurden mit DAPI als Gegenfärbung blau dargestellt. Später, 22 und 40 Stunden nach der Transfektion, wurde die Produktion infektiöser Virionen, die sich in den Kulturüberständen der mit RNA elektroporierten Zellen angesammelt hatten, mittels Plaque-Assays analysiert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man infektiöses Virus vollständig aus einem geklonten cDNA-Genom eines positiv-sinnigen RNA-Virus wie dem Japanischen Enzephalitis-Virus gewinnen kann. Vergessen Sie daher nicht, dass die Arbeit mit dem Japanischen Enzephalitis-Virus und anderen humanpathogenen Erregern äußerst gefährlich sein kann. Vor der Durchführung dieses Verfahrens ist eine angemessene Ausbildung im Bereich der Biosicherheit erforderlich.