Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit 'Single Virus Genomics'

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne Variane aus einem gemischten Konsortium zu isolieren und das gewonnene genomische Material zu sequenzieren, um Viren aus einer Vielzahl von Umgebungen zu identifizieren, ohne dass eine Kultivierung erforderlich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst die einzelnen Variane mit Hilfe der zytometrischen Sortierung des Durchflusses auf aro-Kügelchen isoliert werden. Der Einzelioneneinfang wird dann durch konfokale Mikroskopie validiert.

Als nächstes wird das genomische Material aus den Ionen isoliert und mit Hilfe der Mehrfachverdrängungsamplifikation (MDA) amplifiziert, um die für die Sequenzierung benötigte DNA-Menge zu erzeugen. Schließlich wird die virale DNA unter Verwendung von Hochdurchsatztechnologien sequenziert, um eine übermäßige Abdeckung des Viriongenoms zu erzeugen, was die Assemblierung und Annotation des Genoms erheblich unterstützt. Letztendlich ermöglichen bioinformatische Techniken, die darauf abzielen, Sequenz-Sub-Sampling-Ansätze zu verwenden, um die Con-Größe zu erhöhen, die Analyse isolierter Vons.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der viralen Ökologie zu beantworten, indem sie dem riesigen Pool an annotierten OC-Plankton-Genen einen genomischen Kontext verleiht und die Entdeckung neuer Genome aus verschiedenen Ökosystemen ermöglicht. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Verstärkung und Isolierung einzelner Ionen die Grenzen der aktuellen Technologie überschreitet. Wir hatten die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als wir die Verwendung von MDA in Vero-Planktongemeinschaften untersuchten und feststellten, dass es möglich ist, ein einzelnes Viruspartikel und eine Sequenz zu sortieren und somit ein vollständiges virales Genom aus diesen komplexen Gemeinschaften zusammenzusetzen. Um Viren mit einem Durchflusszytometer zu sortieren, das mit kundenspezifischen Vorwärtsstreu-Photomultiplier-Röhren oder F-S-C-P-M-T ausgestattet ist, beginnen Sie mit der Verdünnung der Viruspartikel in 0,1 Mikrometer filtriertem Tris. EDTA für eine gemischte Anordnung, die T-4- und Lambda-Phagenpartikel enthält, setzte den F-S-C-P-M-T auf 1000 und den SSC auf 200, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren.

Nach der Durchführung von Kontrollproben werden etwa 100 Mikroliter der anhaltenden Virussuspension auf insgesamt 5.000 Ereignisse übertragen. Verwenden Sie dann die cybergrünen und F-S-C-P-M-T-Diagramme, um ein dichtes Tor in der Mitte der Viruspartikel zu platzieren. Geben Sie nun fünf Mikroliter Aros mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 1 % in auf 37 Grad Celsius gekühltem FSME-Puffer in jede Vertiefung des A-P-T-F-E-Objektträgers und laden Sie den Objektträger dann in das Durchflusszytometer, um die sortierten Viruspartikel aufzufangen.

Beginnen Sie mit der Sortierung und erfassen Sie 10 oder mehr Viruspartikelereignisse in einigen der Vertiefungen, um die Erkennung der Tiefe von Viren während der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie zu unterstützen. Wenn die Sortierung abgeschlossen ist, nehmen Sie den Objektträger aus dem Durchflusszytometer und geben Sie fünf weitere Mikroliter mit niedrigem Schmelzpunkt und auf 37 Grad Celsius abgekühltes Aroma in jede Vertiefung. Einbettung der Viruspartikel für ein einzelnes Varion.

Stellen Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop auf 488 Nanometer ein. Die Anregung bildet dann die eingebetteten Partikel mit einem 63-fachen Arbeitsabstand ab, um zu überprüfen, ob nur ein einzelnes Partikel vorhanden ist und dass nicht mehrere Viren übereinander gestapelt sind. Sobald die Vertiefungen mit einzelnen Viren identifiziert wurden, entfernen Sie mit einer Rasierklinge die gewünschten Agros-Kügelchen vom Objektträger und legen Sie sie in ein steriles PCR-Röhrchen.

Legen Sie das Röhrchen drei Minuten lang in den Heizblock eines Thermocyclers, der auf 94 Grad Celsius eingestellt ist, um das Viruspartikel in situ zu läusieren. Übertragen Sie dann nach der Durchführung einer modifizierten MDA die genomische DNA in 1,7-Milliliter-Einor-Röhrchen und fügen Sie ein 10stel Volumen von drei molaren Natriumacetat in FSME-Puffer hinzu. Um das amplifizierte genomische Material zu reinigen, legen Sie die Proben 10 Minuten lang auf 55 Grad Celsius, um das Aros aufzulösen, und bewegen Sie dann die Röhrchen auf 42 Grad Celsius, um die Temperatur vor der Zugabe des Enzyms zu senken. Geben Sie nun zwei Einheiten Beta-Aase in jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen zwei Stunden lang.

Geben Sie dann ein Volumen einer mit Puffer gesättigten Phenollösung in jedes Röhrchen. Die Röhrchen kräftig mischen und 15 Minuten lang bei 3.50 G.At 0-facher Raumtemperatur zentrifugieren, dann die ÜBERSTÄNDE enthaltende DNA in ein neues 1,7-Milliliter-Einor-Röhrchen überführen. Geben Sie als Nächstes ein Volumen 100% Isopropanol und einen Mikroliter Glykoblau in die Röhrchen und drehen Sie die Röhrchen um, um sie zu mischen, nachdem Sie die Röhrchen erneut zentrifugiert haben.

Diesmal für 60 Minuten bei 28.000 mal G und vier Grad Celsius. Dekantieren Sie das Isopropanol, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, und geben Sie 150 Mikroliter 70%iges Ethanol in jedes Röhrchen. Drehen Sie die Röhren 10 Minuten lang mit 28.000 Mal.

G bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie das Ethanol an der Luft, das DNA-Pellet und resuspendieren Sie die DNA in einem geeigneten Volumen Tris-EDTA-Puffer. Diese dreidimensionale Rekonstruktion eines cybergrünen, eingefärbten Viruspartikels innerhalb einer Agrogeschwindigkeit zeigt, wie die konfokale Lasermikroskopie verwendet werden kann, um zu visualisieren und zu bestätigen, dass ein einzelnes Virion in jeder Vertiefung erhalten wird, nachdem es eingefangen und in Arous eingebettet wurde.

Hier wird ein Profildiagramm der relativen Fluoreszenz des gefärbten einzelnen Viruspartikels innerhalb eines Arous-Beads gezeigt. Diese letzte Abbildungsreihe zeigt, wie fast das gesamte Lambda-Genom, mit Ausnahme der ersten fünf Basenpaare, für dieses repräsentative Virus gewonnen wurde. Hier ist das GC-Diagramm für das einzelne Virus.

Das identifizierte Genom wird dargestellt. Diese Abbildung zeigt die Genomkarte von Lambda. Schließlich wird die Kartierung eines einzelnen Virusgenoms für das repräsentative isolierte und amplifizierte Bakterium phage lambda gezeigt.

Die X-Achse zeigt die Position des Genoms. Die Y-Achse zeigt die prozentuale Abdeckung an. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, eine sterile Technik zu verwenden und sich die Zeit zu nehmen, um sicherzustellen, dass die Kontamination vermieden wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden verwendet werden, um die Taxonomie der isolierten Variane vor der Sequenzierung des gesamten Genoms zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie einzelne Variane mithilfe von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung, konfokaler Mikroskopie und Ganzgenomamplifikation isolieren können.