Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit 'Single Virus Genomics'

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Virionen aus einem gemischten Konsortium zu isolieren und das gewonnene genomische Material zu sequenzieren, um Viren aus einer Vielzahl von Umgebungen ohne den Bedarf an Kultivierung zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst einzelne Virionen mittels Durchflusszytometrie-Sortierung auf Agarose-Beads isoliert werden. Die Erfassung einzelner Virionen wird anschließend durch konfokale Mikroskopie validiert.

Anschließend wird das genetische Material aus den Virionen isoliert und mittels mehrfacher Displacementsamplifikation (MDA) amplifiziert, um die für die Sequenzierung benötigte DNA-Menge zu gewinnen. Schließlich wird die virale DNA mithilfe von Hochdurchsatztechnologien sequenziert, wodurch eine hohe Überdeckung des Viriongenoms erzielt wird, was der Genomzusammenstellung und -anreicherung erheblich zugutekommt. Letztendlich ermöglichen bioinformatische Verfahren, die auf Sequenz-Unterstichprobenmethoden zur Vergrößerung der Contig-Länge abzielen, die Analyse isolierter Virionen.

Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Virusökologie zu beantworten, indem sie genomischen Kontext für den umfangreichen Pool unannotierter virioplanktischer Gene liefert und zudem die Entdeckung neuer Genome aus unterschiedlichen Ökosystemen ermöglicht. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, häufig Schwierigkeiten, da die Amplifikation und Isolierung einzelner Virionen an die Grenzen der derzeitigen Technologie stößt. Uns kam die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir die Anwendung der MDA auf Virioplankton-Gemeinschaften untersuchten und erkannten, dass es möglich ist, ein einzelnes Viruspartikel zu sortieren und zu sequenzieren und somit ein komplettes virales Genom aus diesen komplexen Gemeinschaften zusammenzusetzen. Zum Sortieren von Viren mittels Durchflusszytometer, das mit kundenspezifischen Vorwärtsstreuungs-Photomultiplierröhren oder FSCPMT ausgestattet ist. Verdünnen Sie zunächst die Viruspartikel in 0,1-Mikron-gefiltertem Tris-EDTA. Für ein Gemisch, das T4- und Lambda-Phagenpartikel enthält, stellen Sie den FSCPMT auf 1000 und den SSC auf 200 ein, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren.

Nachdem Kontrollproben durchgeführt wurden, werden etwa 100 Mikroliter der angefärbten Virus-Suspension bis zu insgesamt 5.000 Ereignisse durchlaufen gelassen. Anschließend wird mithilfe der SYBR Green One- und FSC-PMT-Diagramme ein enger Gate in der Mitte der Viruspartikel platziert. Danach werden je fünf Mikroliter 1 %iger, in TBE-Puffer auf 37 Grad Celsius abgekühlter Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in jedes Brunnen einer P-T-F-E-Mikroskopierplatte gegeben und die Platte anschließend in den Durchflusszytometer eingelegt, um die sortierten Viruspartikel einzufangen.

Beginnen Sie mit der Sortierung, wobei in einigen Vertiefungen 10 oder mehr Viruspartikelevents erfasst werden, um die Detektion der Virentiefe während der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie zu unterstützen. Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Objektträger aus dem Durchflusszytometer und geben Sie je fünf Mikroliter niedrigschmelzendes Agarose, das auf 37 Grad Celsius abgekühlt wurde, in jede Vertiefung, um die Viruspartikel einzubetten. Stellen Sie für einzelne Virionen das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop auf eine Anregung von 488 Nanometern ein. Bilden Sie anschließend die eingebetteten Partikel mit einem 63x-Objektiv mit langem Arbeitsabstand ab, um zu überprüfen, dass jeweils nur ein einzelnes Partikel vorhanden ist und sich keine mehreren Viren übereinander stapeln. Sobald die Vertiefungen mit einzelnen Viren identifiziert wurden, entfernen Sie die gewünschten Agarosekügelchen mit einer Rasierklinge vom Objektträger und geben Sie sie in ein steriles PCR-Röhrchen.

Stellen Sie das Röhrchen für drei Minuten in den Heizblock eines Thermocyclers, der auf 94 Grad Celsius eingestellt ist, um das virale Partikel vor Ort zu lysieren. Überführen Sie danach nach einer modifizierten MDA die genomische DNA in 1,7-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen und geben Sie ein Zehntel des Volumens einer dreimolaren Natriumacetat-Lösung in TBE-Puffer hinzu, um das amplifizierte genomische Material zu reinigen. Inkubieren Sie die Proben bei 55 Grad Celsius für 10 Minuten, um das Agarose aufzulösen, und bringen Sie die Röhrchen anschließend auf 42 Grad Celsius, um die Temperatur vor dem Hinzufügen des Enzyms zu senken. Geben Sie nun zwei Einheiten Beta-Agarase zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen für zwei Stunden.

Dann eine Volume einer gepufferten, gesättigten Phenollösung zu jedem Röhrchen hinzufügen. Gründlich mischen und die Röhrchen 15 Minuten bei 3.500×g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Die DNA-haltigen Überstände in ein neues 1,7-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen überführen. Als Nächstes eine Volume 100 % Isopropanol und einen Mikroliter Glyco-Blue zu den Röhrchen hinzufügen und die Röhrchen umdrehen, um zu mischen. Nach erneuter Zentrifugation der Röhrchen, diesmal 60 Minuten bei 28.000×g und vier Grad Celsius, das Isopropanol abgießen, wobei darauf geachtet werden muss, den Pellet nicht zu stören, und 150 Mikroliter 70 % Ethanol zu jedem Röhrchen hinzufügen. Die Röhrchen 10 Minuten bei 28.000×g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Das Ethanol abgießen, den DNA-Pellet an der Luft trocknen und die DNA in einem geeigneten Volumen Tris-EDTA-Puffer resuspendieren. Diese dreidimensionale Rekonstruktion eines SYBR Green-eingefärbten Viruspartikels innerhalb einer Agarosekugel zeigt, wie die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet werden kann, um zu visualisieren und zu bestätigen, dass nach Erfassung und Einbettung in Agarose in jeder Vertiefung ein einzelnes Virion vorliegt; der Ausschnitt zeigt eine höhere Vergrößerung des isolierten Viruspartikels.

Hier ist ein Profilplot der relativen Fluoreszenz des gefärbten einzelnen Viruspartikels innerhalb einer Agarosebeade dargestellt. Diese letzte Abbildungsreihe zeigt, wie nahezu das gesamte Lambda-Genom mit Ausnahme der ersten fünf Basenpaare für diesen repräsentativen Virus rekonstruiert wurde. Hier ist die GC-Plot für das identifizierte Einzelvirusgenom dargestellt. Diese Abbildung zeigt die Genomkarte von Lambda. Schließlich ist die Abbildung eines einzelnen Virusgenoms für den repräsentativen isolierten und amplifizierten Bakteriophagen Lambda dargestellt. Die X-Achse zeigt die Genomposition. Die Y-Achse zeigt die prozentuale Abdeckung.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sterile Techniken anzuwenden und sich die Zeit zu nehmen, um sicherzustellen, dass Kontaminationen vermieden werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden verwendet werden, um die Taxonomie der isolierten Virionen vor der Ganzgenomsequenzierung zu bestimmen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man einzelne Virionen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung, konfokaler Mikroskopie und Ganzgenomverstärkung isoliert.