Mikrowelle gesteuerte Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für die schnelle Erkennung von Atherosclerosis

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist der Einsatz von Mikrowellentechnologie zur schnellen Synthese und Funktionalisierung von Eisenoxid-Nanopartikeln mit einem Bisphosphonat-Anteil für den schnellen Nachweis von Atherosklerose mittels MRT in Mausmodellen. Der Einsatz der Mikrowellentechnologie bei der Synthese und Funktionalisierung von Eisenoxid-Nanopartikeln ist noch begrenzt. Wir zeigen jedoch, wie qualitativ hochwertige Nanopartikel und extrem schnelle Protokolle entwickelt werden können.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass in extrem kurzer Zeit qualitativ hochwertige funktionalisierte Nanopartikel hergestellt und zur Katheterisierung von Atherosklerose-Plaques verwendet werden können, die auf Mikroverkalkungen abzielen. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 0,5 Gramm Eisen-3-Acetylacetenat, 1,4 Milliliter Ölsäure, 0,6 Milliliter Oleylamin und 1,19 Gramm 1,2-Hexadodecandiol in einen mikrowellengeeigneten Kolben. 10 Milliliter Phenylether werden vorsichtig mit einer graduierten Pipette an der Kolbenwand entlang gegeben

Anschließend wird der Kolben in einen Mikrowellenreaktor gestellt und das Mikrowellenprotokoll gestartet, indem eine dynamische Studie in die Mikrowelle geladen wird. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist und der Kolben auf Raumtemperatur abgekühlt ist, wird das Reaktionsgemisch mit einer Glaspipette in einen Erlenmeyerkolben überführt und 10 Milliliter 98 Prozent Ethanol hinzugefügt. Stellen Sie den Kolben auf einen Neodym-Niob-Bor-Magneten und entfernen Sie den Überstand mit einer Glaspipette nach 5 Minuten.

Geben Sie anschließend 10 Milliliter Ethanol in den Kolben. Die Probe wird zwei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 40 Kilohertz beschallt. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Probe auf den Magneten und entfernen Sie den Überstand.

Die mit Ölsäure überzogenen Nanopartikel werden in 30 Millilitern Chloroform dispergiert und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 40 Kilohertz beschallt. Nach der Beschallung werden 0,5 Milliliter der Nanopartikel in eine Glasküvette überführt und 0,5 Milliliter Chloroform hinzugefügt. Überprüfen Sie die hydrodynamische Größe in einem Zetasizer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Lösen Sie zu diesem Zeitpunkt 44,3 Milligramm Kaliumpermanganat und 150,4 Milligramm Benzoyltrimethylammoniumchlorid in einer Mischung aus Wasser und Chloroform. Die resultierende Lösung wird in einem mikrowellengeeigneten Kolben zu einem 5-Milliliter-Aliquat der mit Ölsäure überzogenen Nanopartikel gegeben. Starten Sie das Mikrowellenprotokoll für Azelainsäure-Nanopartikel, indem Sie die Temperatur auf 105 Grad Celsius, die Zeit auf neun Minuten, den Druck auf 250 psi und die Leistung auf 300 Watt einstellen.

Anschließend werden 10 Milliliter Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 2,9 in den Kolben gegeben. Nach Wiederholung des Mikrowellenprotokolls und Entfernen des Überstands werden 10 Milliliter Wasser in den Kolben gegeben und die Mischung in einen Erlenmeyerkolben überführt. Der kritischste Schritt ist die Reinigung von Azelainsäure-Nanopartikeln.

Geben Sie anschließend 5 Milliliter 10-prozentiges Natriumbisulfat in den Erlenmeyerkolben und beschallen Sie ihn zwei Minuten lang bei 40 Kilohertz bei 25 Grad Celsius. Nachdem Sie die Partikel gesammelt und den Überstand entfernt haben, waschen Sie die Nanopartikel noch dreimal mit 1 Prozent Natriumhydroxid. Redispergieren Sie die Partikel in 5 Millilitern Phosphatpuffer mit pH 7,2

Um die hydrodynamische Größe und das Zetapotenzial zu überprüfen, übertragen Sie 0,7 Milliliter der Azelainsäure-Nanopartikel in eine gefaltete Einweg-Kapillarzelle und legen Sie sie zur Analyse in den Zetasizer. 12 Milligramm EDC und 15 Milligramm Sulfo-NHS in ein Zentrifugenröhrchen mit einem 2 Milliliter Aliquat der Azelainsäure-Nanopartikel geben. Die Mischung bei Raumtemperatur 35 Minuten lang zerkleinern.

Nachdem Sie einen Magneten unter das Zentrifugenröhrchen gelegt haben, um die Nanopartikel zu destabilisieren, aspirieren Sie den Überstand und waschen die Partikel mit 1,5 Millilitern 1 Millimolar Hepespuffer. Fügen Sie dann 5 Milligramm Neridronat hinzu und wirbeln Sie die Mischung zwei Stunden lang ein. Trennen Sie die Nanopartikel mit einem Magneten und waschen Sie sie mit 1 Millimolar Hepespuffer.

Zum Schluss dispergieren Sie die Neridronat-Nanopartikel in 2 Millilitern 1 Millimolar Hepespuffer. Um die hydrodynamische Größe und das Zetapotenzial zu überprüfen, geben Sie 0,7 Milliliter der Neridronat-Nanopartikel in eine gefaltete Einweg-Kapillarzelle und legen Sie sie zur Analyse in den Zetsizer. Alle Nanopartikel wiesen eine kleine hydrodynamische Größe in einer sehr engen Größenverteilung auf.

Die Partikel weisen eine hervorragende Kristallinität auf, wie in den TEM-Bildern zu sehen ist. Darüber hinaus wurden nach vier Wiederholungen der Synthese die gleichen Ergebnisse für die hydrodynamische Größe und Verteilung erzielt, was einen der wichtigsten Aspekte des Mikrowellenansatzes zeigt, seine Reproduzierbarkeit. Die Calciumionen-Bindungseigenschaften durch Bisphosphonate, die in den Neridronat-Nanopartikeln vorhanden sind, wurden durch Relaxometrie überprüft und gezeigt, dass die T2-Relaxationszeit linear mit der Calciumionenmenge und der Inkubationszeit aufgrund der Bildung von Nanopartikelclustern zunimmt, während Nanopartikel ohne Calciumionen stabil bleiben.

In vivo MRT-Experimente wurden an 48 Wochen alten Apoe-Knockout-Mäusen durchgeführt, und eine Stunde nach der Injektion war das Signal der Plaque im Vergleich zu den basalen Bildern hypointense. Darüber hinaus unterschied sich das Verhältnis von Plaque zu Muskel signifikant zwischen den basalen und einstündigen Bildern nach der Injektion. Das Signal in der Leber wurde auch nach Injektion der Neridronat-Nanopartikel überwacht, die nach 20 Minuten vollständig aus dem Kreislauf entfernt wurden, was die selektive Akkumulation dieser Nanopartikel in Richtung atherosklerotischer Plaque bestätigt.

Ex-vivo-Bildgebung und Histologie wurden durchgeführt und die Bildgebung von Aorten mit und ohne Nanopartikel zeigte Unterschiede in der Signalintensität in Übereinstimmung mit den in vivo-Experimenten. Einmal gemeistert, ermöglicht die Mikrowellentechnologie die Synthesecharakterisierung und den Nachweis von Plaques in einer Gesamtzeit von 3 Stunden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Ein weiterer Vorteil dieser Methode besteht darin, dass mit einer kleinen Modifikation auch andere bildgebende Verfahren, wie z.B. die Thermografie, durchgeführt werden können, um zusätzliche Fragestellungen wie die Quantifizierung von Atherosklerose zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der kardiovaskulären Bildgebung, um die Früherkennung von Atherosklerose mit einem Versuchsaufbau zu erforschen, der leicht an die klinischen Bedürfnisse angepasst werden kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hydrophile Eisenoxid-Nanopartikel mit Mikrowellen herstellt und wie sie in der kardiovaskulären Bildgebung eingesetzt werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mikrowellenherden je nach verwendetem Ofen gefährlich sein kann und dass bei diesem Vorgang immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Druckkontrolle des Spülkastens getroffen werden sollten.