Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Zellen aus einem mehrzelligen Steroid hinsichtlich ihres Zellzyklusstatus und ihrer Position innerhalb des Steroids zu identifizieren, zu charakterisieren und zu isolieren – im Vergleich zur 2D-Zellkultur. Das 3D-OID-Modell bildet die Biologie des Krebses in vivo nach, da es die Tumorarchitektur und ihre Mikroumgebung nachahmt. Durch die Kombination von Sphäroiden mit Durchflusszytometrie und bildgebenden Verfahren kann diese Methode zentrale Fragen im Krebsforschungsbereich beantworten, beispielsweise wie die Tumormikroumgebung die Arzneimittelsensitivität, Zellmotilität und Proliferation verändert.

Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie die Echtzeit-Visualisierung des Zellzyklus ermöglicht und die Anreinigung lebender Zellen aus einem bestimmten Steroidbereich erlaubt, was zeigt, dass das Verfahren durchgeführt werden wird. A sharp, eine wissenschaftliche Hilfskraft aus unserem Labor, beginnt mit den Vorbereitungen für die 3D-Steroidbildung, indem 1,5 % Aros in 100 Milliliter Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) für drei bis fünf Minuten im Mikrowellenofen erhitzt werden. Dabei wird das Gefäß intermittierend geschwenkt, um sicherzustellen, dass das Aros vollständig gelöst ist. Anschließend werden sofort 100 Mikroliter der Aros-Lösung in jedes Loch einer flachen 96-Loch-Gewebekulturplatte pipettiert. Die Platte wird eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, damit das Aros erstarren kann.

Entfernen Sie anschließend eine 80 % konfluente Zellkultur von Melanomzellen, die die FCI-Konstrukte exprimieren, aus dem Zellkulturgehäuse. Waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter HBSS. Geben Sie 1,5 Milliliter 0,05 % in EDTA hinzu und inkubieren Sie die Zellen anschließend etwa zwei Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nachdem sich die Zellen gelöst haben, resuspendieren Sie sie in 10 Milliliter Zellkulturmedium. Zählen Sie die Zellen manuell mithilfe eines Hämozytometers und eines invertierten Mikroskops und verdünnen Sie sie auf 25.000 Zellen pro Milliliter in Zellkulturmedium. Pipettieren Sie anschließend 200 Mikroliter der Zellsuspension, um jede Vertiefung der 96-Loch-Aros-Platte zu überziehen.

Die Platte etwa drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren, um Zellsphäroide zu bilden. Nach der Inkubation werden die Sphäroide mit einem umgekehrten Mikroskop unter Verwendung eines Forex-Objektivs und eines Phasenkontrastfilters abgebildet. Die Sphäroide sollten als kompakte, annähernd kugelförmige Zellaggregate erscheinen, um den Zellverband für das Schneiden und die Bildgebung vorzubereiten.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um sie in ein Falcon-Gefäß zu überführen. Lassen Sie anschließend das Steroid am Boden des kegelförmigen Gefäßes absetzen. Entfernen Sie danach das Medium durch Absaugen und fixieren Sie die Sphäroide, indem Sie sie mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur in 10 % neutral gepuffertem Formalin inkubieren.

SP kann nach der Schnittführung und Bildgebung der Zelle mehrere Tage lang in HBSS bei vier Grad Celsius gelagert werden. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software und wählen Sie die Konfiguration „Nur Quantifizierung“. Erstellen Sie anschließend eine neue Bibliothek und importieren Sie die Sphäroid-Konfokal-Bilddatei, indem Sie die Rohdatendatei in die Bibliothek ziehen.

Nächster Schritt: Wechseln Sie zum Reiter „Measurements“ und erstellen Sie ein Protokoll zur Bildanalyse, indem Sie Befehle per Drag & Drop in der richtigen Reihenfolge im Protokollfenster anordnen. Um Objekte im grünen Kanal zu finden, ziehen Sie den Befehl „Find Objects“ aus dem Abschnitt „Finding“ in das Protokollfenster und wählen den entsprechenden Kanal aus. Fügen Sie einen „Open“-Befehl aus dem Bereich „Processing“ hinzu und anschließend einen separaten „Touching Objects“-Befehl, um die Zellen voneinander zu trennen.

Schließlich fügen Sie im Filterabschnitt Objekte nach Größe hinzu und schließen sie aus. Weisen Sie den Befehl an, Objekte kleiner als 50 Mikrometer auszuschließen, um kleine, nicht zelluläre Objekte zu entfernen. Ziehen Sie anschließend einen neuen „Objekte finden“-Befehl in das Protokollfenster.

Befolgen Sie dieselben Schritte, wählen Sie den roten Kanal aus und wenden Sie alle nachfolgenden Befehle an. Sobald die Objekte gefunden wurden, verwenden Sie die Befehle Kanal ausblenden oder Kanal anzeigen, um visuell sicherzustellen, dass rote und grüne Objekte den roten und grünen Kernen entsprechen. Klicken Sie gegebenenfalls auf Messungen und dann auf Feedback-Optionen, um das Erscheinungsbild der Objektmasken anzupassen.

Nun, um gelbe Objekte zu finden, die frühen Zellen in der S-Phase entsprechen, verwenden Sie den Befehl „Schnittmenge“ im Abschnitt „Kombinieren“ und wählen Sie die Schnittmenge von roten und grünen Objekten. Schließen Sie erneut Objekte mit einer Größe unter 50 Mikrometern aus. Um Zellen in der G1-Phase zu identifizieren, verwenden Sie den Befehl „Subtrahieren“ im Abschnitt „Kombinieren“ und wählen Sie, um ausschließlich rote Objekte zu finden, die Subtraktion der gelben Objekte von den roten Objekten.

Entsprechend gelbe Objekte von grünen Objekten subtrahieren, um ausschließlich grüne Objekte zu identifizieren, die mit SG zwei und MPH-Phasen-Zellen korrelieren, und zwar sowohl für die ausschließlich roten als auch für die ausschließlich grünen Objekte. Entfernen Sie nicht-zelluläre Objekte nach Bedarf, indem Sie einen Filter-Populations-Befehl aus dem Filterbereich anwenden, bei dem der Formfaktor größer als 0,25 ist. Anschließend die S-Sphäroid-Umrisslinie bestimmen.

Verwenden Sie einen „Objekte finden“-Befehl aus dem Abschnitt „Suchen“ im grünen oder roten Kanal. Verwenden Sie anschließend einen „Schließen“-Befehl aus dem Verarbeitungsabschnitt, um die einzelnen Zellen zu einem Objekt zu verbinden. Fügen Sie dann einen „Löcher in Objekten füllen“-Befehl hinzu, um Lücken in der Sphäre zu schließen.

Verwenden Sie anschließend einen Feinfilter, um Rauschen aus dem Sphero-Objekt zu entfernen. Schließen Sie die Bestimmung der Sphäroidkontur ab, indem Sie „Objekte nach Größe ausschließen“ auswählen, um Objekte kleiner als 30.000 Mikrometer zu entfernen. Sobald alle Objekte definiert sind, fügen Sie „Abstände messen“ aus dem entsprechenden Abschnitt hinzu, um den Abstand jedes OID zur Kante der S-Sphäroidkontur zu bestimmen.

Führen Sie dies in jeder der gelben sowie in den ausschließlich roten und ausschließlich grünen Populationen durch. Um die minimalen Abstände der Zelle zur nächstgelegenen Kante des S-Sphäroids zu visualisieren, öffnen Sie die Registerkarte „Messungen“ und wählen Sie „Feedback-Optionen“ gefolgt von „Beziehungen“. Wählen Sie anschließend „Abstände anzeigen“.

Speichern Sie abschließend das Protokoll, um die vom Protokoll erzeugten Daten zu speichern. Wählen Sie den Punkt Messung erstellen aus dem Messabschnitt. Um dann die Daten zu interpretieren, wählen Sie den Messpunkt aus, wechseln Sie zum Analyse-Tab im Messabschnitt und wählen Sie unter dem Analysemenü die Option Analysieren, um die Zellen zu zählen, die sich in einem bestimmten Abstand zur Steroidkante befinden.

Erstellen Sie einen Filter, indem Sie Filter im Analyse-Tab auswählen. Beispielsweise sollen nur Daten angezeigt werden, bei denen der Abstand zur Kugelkante weniger als 100 Mikrometer beträgt. Um die Rohdaten zu exportieren, wählen Sie Export im Datei-Tab und speichern Sie die Daten als kommagetrennte oder tabulatorgetrennte Textdatei.

Diese Daten können zur weiteren Analyse in einem Tabellenkalkulationsprogramm geöffnet werden. Zellenkugeln, die aus C 8 1 16 1 generiert wurden. Menschliche Melanomzellen, die mit dem Fuji-System transduziert worden waren, wurden fixiert und geschnitten.

Konfokale Bildgebung für AZA grün, das Zellen in der SG2-M-Phase des Zellzyklus markiert, und Berra orange, das Zellen in der G1-Phase markiert, wurde durchgeführt. Wenn diese Bilder überlagert werden, sind Schlüsselmerkmale wie ein nekrotischer Kern wie erwartet beobachtbar. Rote, in der G1-Phase arrestierte Zellen dominieren in der Nähe dieses nekrotischen Kerns, während rote und grüne proliferierende Zellen gradientenartig in Richtung der äußeren Kante zunehmen, wo der Zugang zu Sauerstoff und Nährstoffen am größten ist.

Nach der halbautomatischen Bildanalyse können die Fucci-Zellmasken und die S-Sphäroid-Umrisslinie definiert werden. Mit Hilfe einer Bildanalyse-Software wurden rote und grüne Zellen im inneren oder äußeren Bereich des S-Sphäroids quantifiziert. Diese Analyse zeigte, dass sich Zellen im G1-Phasen-Arrest im inneren Bereich anreichern, während proliferierende Zellen näher zur Steroid-Kante vorherrschen.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie innerhalb von ein bis zwei Wochen durchgeführt werden, wobei dieser Zeitraum das Kultivieren des Steroids, die Bildgebung und die Analyse umfasst. Nach diesen Verfahren können Rads in eine Kollagenmatrix implantiert und anschließend mittels Zeitraffer-Mikroskopie abgebildet werden. Danach können sie einer Protein- oder RNA-Analyse unterzogen werden, was uns helfen kann, Fragen zu beantworten, beispielsweise ob die Position im Steroid und der Zugang zu Sauerstoff und Nährstoffen die Phänotypen von Krebszellen verändern können.