Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Zellen aus einem mehrzelligen Steroid in Bezug auf ihren Zellzyklusstatus und ihre Position innerhalb des Steroids im Vergleich zu 2D-Zellkulturen zu identifizieren, zu charakterisieren und zu isolieren. Das 3D-OID-Modell rekapituliert die Biologie von Krebs in vivo, indem es die Tumorarchitektur und seine Mikroumgebung nachahmt, indem es Sphärozellen mit Durchflusszytometrie und bildgebenden Verfahren kombiniert. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich Krebs beantworten, z. B. wie die Mikroumgebung des Tumors die Empfindlichkeit von Medikamenten, die Zellmotilität und die Proliferation verändert.

Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine Echtzeit-Visualisierung des Zellzyklus ermöglicht und die Reinigung lebender Zellen aus einer bestimmten Steroidregion ermöglicht, um zu demonstrieren, dass das Verfahren durchgeführt wird Ein scharfer, ein Forschungsassistent aus unserem Labor Beginnen Sie mit der Vorbereitung auf die 3D-Steroidbildung, indem Sie 1,5 %aros in 100 Millilitern Hank's Balance Salt Solution oder HBSS in der Mikrowelle erhitzen oder den Kolben drei bis fünf Minuten lang intermittierend schwenken, um sicherzustellen dass das Aros vollständig aufgelöst ist. Pipettieren Sie dann sofort 100 Mikroliter der Arous-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur, damit sich die Aros verfestigen können.

Als nächstes entnehmen Sie eine 80%ige Konfluenz-Zellkultur von Melanomzellen, die die FCI-Konstrukte exprimieren, aus dem Zellkultur-Inkubator. Waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern HBSS. Fügen Sie 1,5 Milliliter 0,05 % EDTA hinzu und inkubieren Sie die Zellen dann etwa zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Sobald die Zellen die Reanimation abgelöst haben, suspendieren Sie sie in 10 Millilitern Zellkultur. Mittel. Zählen Sie die Zellen manuell mit einem Hämometer, einem Zytometer und einem inversen Mikroskop und verdünnen Sie sie in Zellkulturmedium auf 25.000 Zellen pro Milliliter. Pipettieren Sie dann 200 Mikroliter der Zellsuspension, um jede Vertiefung der 96-Well-Aros-Platte zu überlagern.

Inkubieren Sie die Platte etwa drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um Zellsphäroide zu bilden. Nach der Inkubation werden die Sphäroide an einem inversen Mikroskop mit einem Forex-Objektiv und einem Phasenkontrastfilter abgebildet. Sphäroide sollten als kompakte, etwa kugelförmige Zellaggregate erscheinen, um das Zellsteroid für die Schnittung und Bildgebung vorzubereiten.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um sie in ein Falkenröhrchen zu befördern. Lassen Sie dann das Steroid am Boden des Konischen absetzen. Entfernen Sie anschließend die mittlere Bi-Saugung und fixieren Sie die Sphäroide, indem Sie sie mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 10%ig neutral gepufferter Form inkubieren.

SP kann dann nach dem Schnitt und der Bildgebung der Zelle mehrere Tage lang bei vier Grad Celsius in HBSS gelagert werden. Öffnen Sie dann die Bildanalysesoftware und wählen Sie die Konfiguration Nur Quantifizierung. Erstellen Sie dann eine neue Bibliothek und importieren Sie die sphäroide konfokale Bilddatei, indem Sie die Rohdatendatei in die Bibliothek ziehen.

Gehen Sie als Nächstes zur Registerkarte Messungen, um ein Bildanalyseprotokoll zu erstellen, indem Sie die Befehle in der richtigen Reihenfolge in das Protokollfenster ziehen und dort ablegen. Um Objekte im grünen Kanal zu finden, ziehen Sie den Befehl "Objekte suchen" per Drag & Drop aus dem Abschnitt "Suchen" in das Protokollfenster und wählen Sie den entsprechenden Kanal aus. Fügen Sie einen Öffnen-Befehl hinzu, der sich unter Verarbeitung befindet, und fügen Sie dann einen separaten Befehl zum Berühren von Objekten hinzu, um die Zellen zu trennen.

Fügen Sie schließlich im Filterbereich Objekte nach Größe hinzu und schließen Sie sie aus. Befehl für Objekte kleiner als 50 Mikrometer, um kleine nicht-zelluläre Objekte auszuschließen. Ziehen Sie als Nächstes einen neuen Befehl zum Suchen von Objekten per Drag & Drop in das Protokollfenster.

Wählen Sie nach den gleichen Schritten den roten Kanal aus und wenden Sie alle nachfolgenden Befehle an. Nachdem Objekte gefunden wurden, verwenden Sie die Befehle Kanal ausblenden oder Kanal anzeigen, um visuell sicherzustellen, dass rote und grüne Objekte roten und grünen Kernen entsprechen. Klicken Sie ggf. auf Messungen und dann auf Feedback-Optionen, um das Erscheinungsbild der Objektmasken zu ändern.

Um nun gelbe Objekte zu finden, die frühen S-Phase-Zellen entsprechen, verwenden Sie den Befehl "Überschneiden" im Kombinationsbereich und wählen Sie "Rote Objekte mit grünen Objekten schneiden". Auch hier gilt: Schließen Sie Objekte mit einer Größe von weniger als 50 Mikrometern aus. Um G einphasige Zellen zu identifizieren, verwenden Sie den Subtraktionsbefehl im Kombinationsbereich und wählen Sie Gelbes Objekt von Rotem Objekt subtrahieren, um ausschließlich rote Objekte zu finden.

In ähnlicher Weise subtrahieren Sie gelbe Objekte von grünen Objekten, um ausschließlich grüne Objekte zu identifizieren, die sowohl für die ausschließlich roten als auch für die ausschließlich grünen Objekte mit SG zwei und MPH-Phasenzellen korrelieren. Entfernen Sie bei Bedarf nicht-zellulare Objekte, indem Sie einen Befehl zum Auffüllen von Filtern mit einem Formfaktor von mehr als 0,25 aus dem Filterbereich anwenden. Suchen Sie dann den Sphäroidumriss.

Verwenden eines Befehls zum Suchen von Objekten aus dem Suchbereich im grünen oder roten Kanal. Verwenden Sie einen geschlossenen Befehl aus dem Verarbeitungsbereich, um die einzelnen Zellen zu einem Objekt zu verbinden. Fügen Sie dann einen Befehl zum Füllen von Löchern in Objekten hinzu, um Löcher in der Kugel zu füllen.

Verwenden Sie als Nächstes einen Feinfilter, um Rauschen aus dem Sphero-Objekt zu entfernen. Schließen Sie die Suche nach dem Sphäroidumriss ab, indem Sie Objekte nach Größe ausschließen auswählen, um Objekte zu entfernen, die kleiner als 30.000 Mikrometer sind. Nachdem Sie alle Objekte definiert haben, fügen Sie Messabstände aus dem zugehörigen Schnitt hinzu, um den Abstand zwischen den einzelnen OIDs und der Kante des Sphäroidumrisses zu bestimmen.

Tun Sie dies in jeder der gelben, ausschließlich roten und ausschließlich grünen Populationen. Um die minimalen Abstände von der Zelle zur nächsten Sphäroidkante zu visualisieren, öffnen Sie die Registerkarte "Messungen" und wählen Sie Feedback-Optionen gefolgt von Beziehungen aus. Wählen Sie dann "Entfernungen anzeigen" aus.

Speichern Sie abschließend das Protokoll, um die vom Protokoll erstellten Daten zu speichern. Wählen Sie das Element Messung vornehmen aus dem Messbereich aus. Um die Daten zu interpretieren, wählen Sie dann das Messelement aus, gehen Sie zur Registerkarte Analyse im Messbereich und wählen Sie Analysieren im Analysemenü, um die Zellen zu zählen, die in einem bestimmten Abstand vom Steroidrand gefunden wurden.

Erstellen Sie einen Filter, indem Sie auf der Registerkarte "Analyse" die Option "Filter" auswählen. Zeigen Sie z. B. nur Daten an, bei denen der Abstand von der Kugelkante weniger als 100 Mikrometer beträgt. Um die Rohdaten zu exportieren, wählen Sie auf der Registerkarte Datei die Option Exportieren aus, und speichern Sie die Daten dann als durch Kommas getrennten oder tabulatorbegrenzten Text.

Diese Daten können zur weiteren Analyse in einem Tabellenkalkulationsprogramm geöffnet werden. Zellsphe erzeugt aus C 8 1 16 1. Menschliche Melanomzellen, die mit dem Fuji-System transduziert worden waren, wurden fixiert und geschnitten.

Es wurde eine konfokale Bildgebung für AZA grün, das Zellen in der SG zwei M-Phase des Zellzyklus markiert, und Berra orange, das Zellen in der G ersten Phase markiert, durchgeführt. Wenn sich diese Bilder überlagern, können Schlüsselmerkmale wie ein nekrotischer Kern wie erwartet beobachtet werden. Rote G eins-arrestierte Zellen überwiegen näher an diesem nekrotischen Kern, während rote und grüne proliferierende Zellen in einer gradienten Weise zum äußeren Rand des Steroids hin zunehmen oder der Zugang zu Sauerstoff und Nährstoffen am größten ist.

Nach einer halbautomatischen Bildanalyse können die Fucci-Zellmasken und der Sphäroid-Umriss definiert werden. Eine Bildgebungssoftware wurde verwendet, um rote und grüne Zellen im inneren oder äußeren Bereich des S-Sphäroids zu quantifizieren. Diese Analyse zeigte, dass G-einphasige fixierte Zellen im inneren Bereich angereichert sind, während proliferierende Zellen näher am Steroidrand überwiegen.

Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in ein bis zwei Wochen durchgeführt werden, ein Zeitrahmen, der das Wachstum des Steroids, die Bildgebung und die Analyse umfasst. Nach diesem Verfahren können Rads in die Kollagenmatrix implantiert und dann über eine Zeitraffermikroskopie abgebildet werden. Sie können dann einer Protein- oder RNA-Analyse unterzogen werden, was uns helfen kann, Fragen zu beantworten, z. B. ob die Position im Steroid und der Zugang zu Sauerstoff und Nährstoffen die Phänotypen von Krebszellen verändern können.