Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein umfassendes System für die Sequenzierung anspruchsvoller Krebsproben zu beschreiben, das nasse Laborreagenzien, standardisierte Kontrollen und eine Stand-Along-Bioinformatik-Suite kombiniert. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Krebsbereich zu beantworten, z. B. wie Tumorbiopsien in geringer Menge und geringer Qualität sequenziert werden können, um genaue DNA-Variantenanalysen und -interpretationen zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass Proben, die schwer zu sequenzieren sind, solche sind, die einfach begrenzte DNA-Mengen zur Verfügung haben, schnell und zuverlässig mit Reagenzien und Kontrollen aus einer einzigen Quelle sowie einer vollständig integrierten Bioinformatik-Software analysiert werden können.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Komplexität des gezielten NGS, das diese Methode vereinfacht, Schwierigkeiten haben. Den Verfahren zur Bibliotheksquantifizierung und zum Probenpooling ist jedoch besondere Aufmerksamkeit zu widmen, um eine einheitliche Abdeckung über alle Probenbibliotheken hinweg zu erreichen. Dieses Protokoll integriert Nass- und Trockenbankprozesse für die Sequenzierung anspruchsvoller Krebsproben.

Der erste Schritt ist die Quantifizierung und Qualifizierung der DNA, um die Anzahl der DNA-Template-Kopien zu bestimmen, die durch Echtzeit-PCR amplifiziert werden können. Beginnen Sie das Verfahren zur Probenquantifizierung und Qualitätskontrolle, indem Sie eine ausreichende Menge eines Mastermixes in einem Mikrozentrifugenröhrchen vorbereiten. Verwenden Sie die folgenden Volumina pro Probe: 5 Mikroliter 2x Mastermix, 0,5 Mikroliter Primersondenmix, 0,5 Mikroliter Inhibitionsprimersondenmix, 0,05 Mikroliter ROX und 2,95 Mikroliter Verdünnungsmittel.

Gib neun Mikroliter des Mastermixes in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Fügen Sie einen Mikroliter der DNA-Standards in doppelter Ausführung hinzu und mischen Sie, indem Sie fünfmal auf und ab pipettieren. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Nukleinsäureprobe gut gemischt ist, fügen Sie einen Mikroliter der Probe zum Mastermix hinzu und mischen Sie, indem Sie fünfmal auf und ab pipettieren.

Setzen Sie die versiegelte Platte in das PCR-System ein. Führen Sie PCR-Zyklen von 10 Minuten bei 95 Grad Celsius durch, gefolgt von 40 Zyklen von 15 Sekunden bei 95 Grad Celsius und einer Minute bei 60 Grad Celsius. Analysieren Sie die qPCR-Daten, indem Sie ein lineares Regressionsdiagramm für jeden der doppelten DNA-Standards erstellen.

Die Konzentration der unbekannten DNA in funktioneller oder amplifizierbarer Kopienzahl pro Mikroliter wird dann wie im Protokolltext beschrieben berechnet. Der nächste Schritt nach der Probenquantifizierung und Qualitätskontrolle ist die Anreicherung von Krebs-Hot-Spot-Sequenzen durch Einzelröhrchen-Multiplex-PCR. Genspezifisch oder gsPCR wird durchgeführt, um 46 Loci in 21 Krebsgenen anzureichern.

Bereiten Sie eine ausreichende Menge des gsPCR-Mastermixes in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor, indem Sie die folgenden Volumina pro Probe, fünf Mikroliter des 2x-Amplifikationsmastermixes und einen Mikroliter des Pan-Krebs-Primer-Panels verwenden. Aliquotieren Sie sechs Mikroliter des gsPCR-Mastermixes in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Geben Sie vier Mikroliter jeder Nukleinsäureprobe in einzelne Vertiefungen.

Mischen Sie, indem Sie fünfmal auf und ab pipettieren. Fügen Sie die entsprechenden Steuerelemente hinzu. Legen Sie die versiegelte Platte für die folgenden PCR-Zyklen in den Thermocycler.

Fünf Minuten bei 95 Grad Celsius. 15 Sekunden bei 95 Grad Celsius, gefolgt von vier Minuten bei 60 Grad Celsius für zwei Zyklen. 15 Sekunden bei 95 Grad Celsius, gefolgt von vier Minuten bei 72 Grad Celsius für 23 Zyklen.

Eine letzte Verlängerung um 10 Minuten bei 72 Grad Celsius, gefolgt von einem Halten bei vier Grad Celsius. Führen Sie nach der genspezifischen PCR 10 Zyklen der Tag-PCR durch, um plattformspezifische Adapter für die Kompatibilität mit der Sequenzierung der nächsten Generation zu integrieren. Geben Sie 7,5 Mikroliter des 2x-Index-Mastermixes und 5,5 Mikroliter eines Indexcodes in eine angegebene Vertiefung in einer 96-Well-Platte und mischen Sie, indem Sie fünfmal auf und ab pipettieren.

Öffnen Sie vorsichtig die gsPCR-Platte und geben Sie zwei Mikroliter gsPCR-Produkt in die neue Platte mit dem Mastermix. Legen Sie die versiegelte Platte für die folgenden PCR-Zyklen in den Thermocycler, fünf Minuten bei 95 Grad Celsius, 30 Sekunden bei 95 Grad Celsius, 30 Sekunden bei 55 Grad Celsius und eine Minute bei 72 Grad Celsius für 10 Zyklen und eine abschließende Verlängerung von 10 Minuten bei 72 Grad Celsius. Gefolgt vom Halten bei vier Grad Celsius.

Im Anschluss an die Tag-PCR erfolgt die Aufreinigung der Bibliothek und die Größenauswahl mit Hilfe der magnetischen Bead-Chemie. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie 11 Mikroliter reine Vorbereitungsmagnetbeads in separate Vertiefungen einer 96-Well-Platte geben. Öffnen Sie die Tag-PCR-Platte, geben Sie 10 Mikroliter Tag-PCR-Produkt zu den Beads und mischen Sie, indem Sie fünfmal auf und ab pipettieren.

Inkubieren Sie die Mischung vier Minuten lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie die 96-Well-Platte vier Minuten lang auf einen Magnetständer. Wenn sich die 96-Well-Platte noch auf dem Ständer befindet, entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn mit einer Pipette.

Nachdem Sie die Kügelchen zweimal mit ethanolhaltigem Waschpuffer gewaschen haben, wie im Protokolltext beschrieben, trocknen Sie die Kügelchen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur und nehmen Sie dann die Platte vom Ständer. Resuspendieren Sie die Kügelchen, indem Sie 20 Mikroliter Elutionspuffer in jede Vertiefung geben und fünfmal auf und ab pipettieren. Zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Setzen Sie die 96-Well-Platte wieder für vier Minuten auf den Magnetständer und entfernen Sie vorsichtig 18 Mikroliter des klaren Überstands und überführen Sie sie in eine Vertiefung in einer neuen 96-Well-Platte. Der nächste Schritt in diesem Protokoll ist die Quantifizierung jeder gereinigten Probenbibliothek durch relativ kompetitive Echtzeit-PCR. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine ausreichende Menge des LQ-Mastermixes in einem Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung der folgenden Volumina pro Probe vor: fünf Mikroliter 2x LQ-Mastermix, zwei Mikroliter LQ-Primersondenmix, 0,5 Mikroliter LQ-Standard und 0,5 Mikroliter LQ ROX.

Geben Sie 8 Mikroliter des LQ-Mastermixes in eine Vertiefung einer optischen 96-Well-Platte. In getrennten Vertiefungen werden zwei Mikroliter einer seriellen Verdünnung der Bibliothek, zwei Mikroliter LQ-Positivkontrolle und zwei Mikroliter LQ-Verdünnungsmittel hinzugefügt und durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt. Setzen Sie die versiegelte Platte in das PCR-System ein und weisen Sie jeder Probe sowohl FAM- als auch VIC-Detektoren zu.

Führen Sie die PCR-Amplifikation unter den folgenden Zyklusbedingungen durch: fünf Minuten bei 95 Grad Celsius und 15 Sekunden bei 95 Grad Celsius, gefolgt von einer Minute bei 60 Grad Celsius für 40 Zyklen. Die Konzentration jeder Probe wird dann wie im Protokolltext beschrieben berechnet. Nach der Quantifizierung der Bibliothek wird jede Probenbibliothek auf der Grundlage ihrer gemessenen Konzentration normalisiert und für die Sequenzierung in einem einzigen Röhrchen zusammengefasst.

Ein vereinfachtes Analysemodul wird verwendet, um die Berechnungen für die Bibliotheksnormalisierung und das Probenpooling zu erleichtern. Um die Bibliothek zu normalisieren, bestimmen Sie zunächst die mediane Konzentration in Nanomolaren über alle Proben hinweg, die jeweils einen eindeutigen paarweisen Index enthalten, der gepoolt werden soll. Bestimmen Sie als Nächstes das Volumen der einzelnen Probe in Mikrolitern, indem Sie die Mediankonzentration aller Proben mit fünf multiplizieren und dann durch die individuelle Konzentration dividieren.

Geben Sie das normalisierte Volumen für jede Probe in ein einzelnes Mikrozentrifugenröhrchen, um den Probenpool zu erstellen. Verdünnen Sie den Probenpool mit einem Sequenzierungsverdünnungsmittel auf 1,25 Nanomolar. Bereiten Sie den Probenpool für die Sequenzierung vor, indem Sie ihn in Gegenwart von phix control V3 denaturieren. Kombinieren Sie Folgendes: 15 Mikroliter 1,25 nanomolare Probenpool, drei Mikroliter 0,5 nanomolare phix und zwei Mikroliter 1N Natriumhydroxid.

Nach einem kurzen Vortex und Zentrifugieren fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie 8 Mikroliter der denaturierten Bibliothek zu 992 Mikrolitern vorgekühltem HT1-Hochpuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 600 Mikroliter der denaturierten und verdünnten Bibliothek an Position Nummer 17 der Reagenzkartusche.

In Mikrozentrifugenröhrchen vier Mikroliter jedes Sequenzierungsprimers separat mit 636 Mikrolitern HT1 High Buffer verdünnen. Geben Sie 600 Mikroliter verdünnte read-1-Sequenzierprimer an Position Nummer 18 der Sequenzierreagenzkartusche. 600 Mikroliter verdünnte Index-Read-Primer auf Position Nummer 19 und 600 Mikroliter verdünnte Read-2-Sequenzierungsprimer auf Position Nummer 20.

Laden Sie die Reagenzien auf das Sequenziergerät der nächsten Generation und führen Sie einen Sequenzierungslauf mit zwei mal 150 Zyklen mit paarigem Ende gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Analysieren Sie abschließend die Sequenzierungsdaten mit der begleitenden Bioinformatik-Software. Insgesamt konnten 90 Proben in einem einzigen NGS-Lauf mit einem Bench-Top-Sequenzer verarbeitet werden.

Für den gezeigten Datensatz enthielten die Proben Zelllinien, verbleibende klinische formale und fixierte Parafin eingebettet (FFPE) und synthetische Template-DNA und führten zu einer Tiefensequenzierung und einer gleichmäßigen Abdeckung. Die Ausreißer bestanden aus keinen Matrizenkontrollen, einer Verdünnungsreihe einer Zelllinien-DNA mit einer großen Kopienzahlamplifikation und einer FFPE-DNA, die durch den präanalytischen qPCR-basierten QC-Assay für die PCR-Hemmung markiert wurde. Die Gleichmäßigkeit der Abdeckung über die 46 Amplikons hinweg wurde mit drei verschiedenen Operatoren und für unterschiedliche FFPE-DNA-Proben von geringer Qualität aufrechterhalten.

In einer FFPE-Tumor-DNA-Kontrollmischung, die aus einer bekannten 5%BRAF-V600E-Mutation bestand, wurde berichtet, dass die Ziel-BRAF-Mutation mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von 5,2 plus oder minus 1,3 Prozent von drei Operatoren unter Verwendung einer Eingabe von 400 amplifizierbaren Kopien aufwies. Verdünnungen von Zelllinien- und FFPE-DNA-Proben mit Kopienzahlamplifikationen zeigten eine Abhängigkeit für die Amplifikation von EGFR und KRAS. Wichtig ist, dass der FFPE-DNA-Eintrag auf nur 50 amplifizierbare Kopien oder 1,2 Nanogramm Massen-DNA reduziert werden kann.

Dabei bleibt die Erkennung bekannter Mutationen ohne falsch positive Aufrufe erhalten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 11 Stunden mit etwa dreieinhalb Stunden Handarbeit für eine Chargengröße von 24 Proben gleichzeitig durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.