Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein umfassendes System zur Sequenzierung anspruchsvoller Krebsproben zu beschreiben, das nasschemische Reagenzien, standardisierte Kontrollen und eine eigenständige Bioinformatik-Suite kombiniert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise wie Tumorbiopsien mit geringer Menge und geringer Qualität sequenziert werden können, um genaue Analysen und Interpretationen von DNA-Varianten zu erzielen. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass Proben, die schwer zu sequenzieren sind – insbesondere solche mit begrenzt verfügbaren DNA-Mengen – mithilfe einheitlicher Reagenzien und Kontrollen sowie einer vollständig integrierten Bioinformatik-Software schnell und zuverlässig analysiert werden können.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Komplexität der gezielten NGS Schwierigkeiten, was durch diese Methode vereinfacht wird. Die Verfahren zur Bibliotheksquantifizierung und zur Probenvermischung erfordern jedoch besondere Sorgfalt, um eine gleichmäßige Abdeckung über alle Probenbibliotheken hinweg zu erreichen. Dieses Protokoll integriert nass- und trockenchemische Arbeitsabläufe zur Sequenzierung anspruchsvoller Krebsproben.

Der erste Schritt ist die Quantifizierung und Qualifizierung der DNA, um die Anzahl der DNA-Vorlagenkopien zu bestimmen, die mittels Echtzeit-PCR amplifiziert werden können. Beginnen Sie das Verfahren zur Probenquantifizierung und Qualitätskontrolle, indem Sie eine ausreichende Menge einer Master-Mischung in einem Mikrozentrifugenröhrchen vorbereiten. Verwenden Sie pro Probe folgende Volumina: 5 Mikroliter 2x Master-Mix, 0,5 Mikroliter Primer-Probe-Mix, 0,5 Mikroliter Inhibitions-Primer-Probe-Mix, 0,05 Mikroliter ROX und 2,95 Mikroliter Verdünnungsmittel.

Geben Sie neun Mikroliter der Master-Mix-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte. Fügen Sie ein Mikroliter der DNA-Standards in Duplikat hinzu und mischen Sie durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren. Stellen Sie sicher, dass die Nukleinsäureprobe gut gemischt ist, geben Sie ein Mikroliter der Probe zur Master-Mix-Lösung hinzu und mischen Sie durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren.

Stellen Sie die verschlossene Platte in das PCR-System. Führen Sie PCR-Zyklen von 10 Minuten bei 95 Grad Celsius durch, gefolgt von 40 Zyklen mit jeweils 15 Sekunden bei 95 Grad Celsius und einer Minute bei 60 Grad Celsius. Analysieren Sie die qPCR-Daten, indem Sie für jeden der duplizierten DNA-Standards ein lineares Regressionsdiagramm erstellen.

Die Konzentration der unbekannten DNA in funktionellen oder amplifizierbaren Kopien pro Mikroliter wird anschließend wie im Protokolltext beschrieben berechnet. Der nächste Schritt nach der Probeneinwaage und Qualitätskontrolle ist die Anreicherung von Krebs-Hotspot-Sequenzen mittels Multiplex-PCR in einem einzelnen Ansatz. Die gen-spezifische PCR (gsPCR) wird durchgeführt, um 46 Loci in 21 Krebsgenen anzureichern.

Bereiten Sie eine ausreichende Menge der gsPCR-Master-Mix-Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung der folgenden Volumina pro Probe vor: fünf Mikroliter 2x Amplifikations-Master-Mix und ein Mikroliter Pan-Krebs-Primer-Panel. Portionieren Sie sechs Mikroliter der gsPCR-Master-Mix-Lösung in jedes Loch einer 96-Loch-Platte. Geben Sie vier Mikroliter jeder Nukleinsäureprobe in einzelne Löcher.

Mischen Sie durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren. Fügen Sie die entsprechenden Kontrollen hinzu. Stellen Sie die verschlossene Platte in den Thermocycler für die folgenden PCR-Zyklen.

Fünf Minuten bei 95 Grad Celsius. 15 Sekunden bei 95 Grad Celsius, gefolgt von vier Minuten bei 60 Grad Celsius für zwei Zyklen. 15 Sekunden bei 95 Grad Celsius, gefolgt von vier Minuten bei 72 Grad Celsius für 23 Zyklen.

Eine abschließende Verlängerung von 10 Minuten bei 72 Grad Celsius, gefolgt von einer Lagerung bei vier Grad Celsius. Führen Sie nach der genspezifischen PCR 10 Zyklen einer Tag-PCR durch, um plattformspezifische Adapter für die Kompatibilität mit der Next-Generation-Sequenzierung einzubauen. Geben Sie 7,5 µL der 2x Index-Master-Mischung und 5,5 µL eines Index-Codes in eine bestimmte Vertiefung einer 96-Loch-Platte und mischen Sie durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren.

Öffnen Sie die gsPCR-Platte vorsichtig und geben Sie zwei Mikroliter des gsPCR-Produkts in die neue Platte mit dem Master-Mix. Stellen Sie die verschlossene Platte in den Thermocycler für die folgenden PCR-Zyklen: fünf Minuten bei 95 Grad Celsius, 30 Sekunden bei 95 Grad Celsius, 30 Sekunden bei 55 Grad Celsius und eine Minute bei 72 Grad Celsius für 10 Zyklen sowie eine abschließende Verlängerung von 10 Minuten bei 72 Grad Celsius. Anschließend Halten bei vier Grad Celsius.

Nach dem Tag-PCR wird die Bibliothekspurifizierung und Größenselektion mithilfe von Magnetbead-Chemie durchgeführt. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie 11 Mikroliter Library Pure Prep Magnetbeads in separate Vertiefungen einer 96-Loch-Platte geben. Öffnen Sie die Tag-PCR-Platte und geben Sie 10 Mikroliter Tag-PCR-Produkt zu den Beads, anschließend mischen Sie durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren.

Inkubieren Sie die Mischung vier Minuten lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie die 96-Well-Platte vier Minuten lang auf einen Magnethalter. Entfernen und entsorgen Sie mit einer Pipette den Überstand, während die 96-Well-Platte weiterhin auf dem Halter steht.

Spülen Sie die Kügelchen zweimal mit Ethanol, der Spülpuffer enthält, wie im Protokolltext beschrieben, trocknen Sie die Kügelchen anschließend zwei Minuten bei Raumtemperatur und nehmen Sie die Platte dann vom Ständer. Resuspendieren Sie die Kügelchen, indem Sie 20 Mikroliter Elutionspuffer in jede Vertiefung geben und fünfmal auf- und abpipettieren. Inkubieren Sie zwei Minuten bei Raumtemperatur.

Stellen Sie die 96-Well-Platte erneut vier Minuten lang auf den Magnethalter und entfernen Sie vorsichtig 18 Mikroliter des klaren Überstandes, die in ein Well einer neuen 96-Well-Platte überführt werden. Der nächste Schritt dieses Protokolls ist die Quantifizierung jeder gereinigten Probenbibliothek mittels relativer kompetitiver Echtzeit-PCR. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen eine ausreichende Menge der LQ-Master-Mix-Lösung unter Verwendung der folgenden Volumina pro Probe vorbereiten: fünf Mikroliter 2x LQ-Master-Mix, zwei Mikroliter LQ-Primer-Probe-Mix, 0,5 Mikroliter LQ-Standard und 0,5 Mikroliter LQ-ROX.

Geben Sie 8 µL der LQ-Master-Mix in eine Vertiefung einer optischen 96-Well-Platte. In separate Vertiefungen geben Sie jeweils 2 µL einer seriellen Verdünnung der Bibliothek, 2 µL LQ-Positivkontrolle und 2 µL LQ-Verdünnungspuffer und mischen Sie durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren. Stellen Sie die verschlossene Platte in das PCR-System und weisen Sie jedem Probenansatz sowohl den FAM- als auch den VIC-Detektor zu.

Führen Sie die PCR-Amplifikation unter Verwendung der folgenden Zyklenbedingungen durch: fünf Minuten bei 95 Grad Celsius und 15 Sekunden bei 95 Grad Celsius, gefolgt von einer Minute bei 60 Grad Celsius für 40 Zyklen. Die Konzentration jeder Probe wird anschließend wie im Protokolltext beschrieben berechnet. Nach der Bibliotheksquantifizierung wird jede Probenbibliothek basierend auf ihrer gemessenen Konzentration normalisiert und in ein einzelnes Röhrchen zur Sequenzierung gepoolt.

Ein vereinfachtes Analysemodul wird verwendet, um die Berechnungen für die Bibliotheksnormierung und die Probenanreicherung zu erleichtern. Um die Bibliothek zu normieren, ermitteln Sie zunächst die mediane Konzentration in Nanomolar über alle Proben hinweg, wobei jede Probe ein eindeutiges paarweises Index enthält, das angereichert werden soll. Anschließend ermitteln Sie das individuelle Probenvolumen in Mikrolitern für die Anreicherung, indem Sie die mediane Konzentration über alle Proben mit fünf multiplizieren und dann durch die individuelle Konzentration dividieren.

Geben Sie das normalisierte Volumen jeder Probe in ein einzelnes Mikrozentrifugenröhrchen, um den Probenpool herzustellen. Verdünnen Sie den Probenpool mit Sequenzierverdünnungsmittel auf 1,25 Nanomolar. Bereiten Sie den Probenpool für die Sequenzierung vor, indem Sie ihn in Gegenwart des Phix-Kontrollstamms V3 denaturieren. Kombinieren Sie hierfür 15 Mikroliter des 1,25-nanomolaren Probenpools, 3 Mikroliter des 0,5-nanomolaren Phix und 2 Mikroliter 1N Natriumhydroxid.

Nach kurzer Vortex- und Zentrifugationsbehandlung fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie 8 Mikroliter der denaturierten Bibliothek in 992 Mikroliter vorab gekühlten HT1-High-Puffers in einem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Fügen Sie 600 Mikroliter der denaturierten und verdünnten Bibliothek an Position Nummer 17 der Reagenzkartusche hinzu.

In Mikrozentrifugenröhrchen jeweils vier Mikroliter jedes Sequenzierungsprimers mit 636 Mikrolitern HT1-Hochpuffer separat verdünnen. 600 Mikroliter verdünnte Read-1-Sequenzierungsprimer an Position Nummer 18 der Sequenzierungsreagenz-Kassette zugeben. 600 Mikroliter verdünnte Index-Read-Primer an Position Nummer 19 und 600 Mikroliter verdünnte Read-2-Sequenzierungsprimer an Position Nummer 20 zugeben.

Laden Sie die Reagenzien auf das Instrument für die Next-Generation-Sequenzierung auf und führen Sie einen paired-end-Lauf mit zwei Zyklen à 150 gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Analysieren Sie abschließend die Sequenzierungsdaten mit der beiliegenden Bioinformatik-Software. Insgesamt konnten 90 Proben in einem einzigen NGS-Lauf unter Verwendung eines Tischsequenzierers verarbeitet werden.

Für den gezeigten Datensatz enthielten die Proben Zelllinien, restliches klinisches formalinfixiertes und paraffineingebettetes (FFPE) Material sowie synthetische Vorlagen-DNA und führten zu einer tiefen Sequenzierung mit gleichmäßiger Abdeckung. Ausreißer bestanden aus Negativkontrollen ohne Vorlage, einer Verdünnungsreihe einer Zelllinien-DNA mit großer Kopienzahl-Amplifikation und einer FFPE-DNA, die in dem präanalytischen, auf qPCR basierenden Qualitätskontrolltest auf PCR-Hemmung hingewiesen hatte. Die Gleichmäßigkeit der Abdeckung über die 46 Amplikone wurde mit drei verschiedenen Bedienern und verschiedenen FFPE-DNA-Proben geringer Qualität aufrechterhalten.

In der FFPE-Tumor-DNA-Kontrollmischung, die eine bekannte 5 % BRAF V600E-Mutation enthielt, wurde die Ziel-BRAF-Mutation durch drei Bediener bei einer Eingabemenge von 400 amplifizierbaren Kopien im Durchschnitt mit einer Häufigkeit von 5,2 ± 1,3 Prozent berichtet. Verdünnungen von Zelllinien- und FFPE-DNA-Proben mit Kopienzahlvervielfachungen zeigten eine Dosisabhängigkeit für die Amplifikation von EGFR und KRAS. Wichtig ist, dass die FFPE-DNA-Eingabemenge auf bis zu 50 amplifizierbare Kopien oder 1,2 Nanogramm Gesamt-DNA reduziert werden konnte.

Unter Beibehaltung des Nachweises bekannter Mutationen ohne falsch positive Ergebnisse. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in 11 Stunden durchgeführt werden, wobei etwa dreiinhalb Stunden manuelle Arbeitszeit für eine Chargengröße von jeweils 24 Proben erforderlich sind, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.