Mikrofluidik-basierte Hochdurchsatz-Sortierung von zirkulierenden Tumorzellen und Einzelzellsequenzierungstechnologie

Wir konzentrieren uns auf die Entwicklung leistungsstarker CTC-Isolations- und Analysemethoden, um die präzise Onkologie durch Flüssigkeitsbiopsie voranzutreiben. Aktuelle kommerzielle CTC-Isolationsplattformen haben einen geringen Durchsatz und eine geringe Effizienz. Sie sind zudem mit nachgelagerten Analyseplattformen inkompatibel, was die biologische Informationsgewinnung einschränkt.

Diese Studie verwendet eine mikrofluidische CTC-Isolationsplattform, um die Nachweisraten erheblich zu verbessern. Wir verwenden außerdem einen seltenen Einzelzell-Sequenzierchip für eine tiefere Flüssigkeitsbiopsieanalyse. Zunächst pipettierte man 25 Mikroliter gewaschenes und resuspendiertes Streptavidin-modifizierte magnetische Perlen in ein Rohr mit einem Mikrogramm biotinylierten EpCAM-Antikörpers.

Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur und drehen Sie sich mit 20 Umdrehungen pro Minute für 40 Minuten, um die immunmagnetischen Perlen vorzubereiten. Mit einem magnetischen Rack trennen Sie die Perlen vom Supernatant. Nach dem Entfernen des Supernatants werden die Perlen in 25 Mikrolitern Isolationspuffer wieder aufgehängt.

Pipettieren Sie innerhalb von ein bis zwei Sekunden 20 Mikroliter der magnetischen Perlenfederung, damit keine Luftblasen entstehen. Setzen Sie den Chip sofort vertikal auf einen Magneten und lassen Sie die Perlen fünf Minuten lang ungestört einwirken. Sammeln Sie vier Milliliter der Blutprobe in einer Spritze, um Luftblasen zu entfernen.

Versiegeln Sie den Ein- und Auslass des Chips mit Flüssigkeit, um Luftblasen zu vermeiden, und führen Sie dann den Probeneinlass und die Auslassrohre in den Chip ein. Mit einer Spritzenpumpe wird die Probe mit einer Durchflussrate von 1,5 Millilitern pro Stunde eingespritzt. Nach dem Laden der Probe wird 60 Mikroliter DPBS mit einer Durchflussrate von 0,2 Millilitern pro Stunde in den HB-Chip eingespritzt, um ungebundene Zellen abzuwaschen.

Entfernen Sie den Magneten und injizieren Sie manuell 1,5 Milliliter 5 % BSA, um den Chip zu reinigen und die gefangenen Tumorzellen freizusetzen. Bereite eine 10%MPTS-Lösung in Ethanol vor. Geben Sie sofort 20 Mikroliter der Lösung in den HB-Chip ein und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Den HB-Chip einmal mit wasserfreiem Ethanol abspülen und dann eine Stunde bei 100 Grad Celsius trocknen. Als Nächstes bereiten Sie eine GMBS-Lösung in Ethanol mit einer Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter her. Nachdem der Chip auf 37 Grad Celsius abgekühlt wurde, gib die GMBS-Lösung ein und inkubiere.

Den HB-Chip zweimal mit doppeltem destilliertem Wasser abspülen, gefolgt von zwei Spülungen mit DPBS. Gib sofort 15 Mikrogramm Streptavidin pro Milliliter in den HB-Chip und inkubiere bei Zimmertemperatur eine Stunde oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation spülen Sie den HB-Chip zweimal mit DPBS-Kochsalzlösung.

Bereiten Sie nun den CD45-Antikörperpuffer vor, indem Sie 0,2 % BSA und 20 Mikrogramm pro Milliliter biotinylierten CD45-Antikörper zu DPBS hinzufügen und an das Endvolumen anpassen. Injizieren Sie 20 Mikroliter des CD45-Antikörperpuffers in den HB-Chip zur negativen Selektion weißer Blutkörperchen. Nach einer einstündigen Inkubation bei Zimmertemperatur spülen Sie den Chip mit DPBS ab.

Fügen Sie eine Blockierungslösung mit 3 % BSA und 0,05 % Tween 20 in den HB-Chip ein. Aspirieren Sie die vorbereitete Probe in eine Spritze und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Dann versiegeln Sie den Ein- und Auslass des Chips mit Flüssigkeit und verbinden Sie Ein- und Auslassrohre mit dem Chip.

Mit einer Spritzenpumpe wird die Probe mit einer Durchflussrate von 0,6 Millilitern pro Stunde injiziert. Sammeln Sie gereinigte Tumorzellen am Chip-Ausgang zum Zählen und zur Einzelzellsequenzierung. Pipettieren Sie 200 Mikroliter 0,5%F-68-Lösung, die in DPBS vorbereitet werden, in den Chipeinlass.

Führen Sie eine Wasserbad-Sonikation durch, während Sie den Chip halten. Wenn Blasen im mikroporösen Bereich sichtbar sind, wird die Sonikation für 30 Sekunden fortgesetzt, um die Blasen aus den Doppelbrunnen zu entfernen. Anschließend injizieren Sie 200 Mikroliter Tumorzellsuspension in den Chip mit 60.000 Doppelwellen.

Pipette die Zellsuspension im Chip zweimal vorsichtig auf und ab. Dann legen Sie sie erneut für fünf Minuten auf einen entfärbungsgebenden Shaker, um unbefestigte Zellen wieder aufzuhängen und sie wieder absetzen zu lassen. Nun 200 Mikroliter DPBS und 0,5 % F-68-Lösung durch den Einlass hinzufügen und aus dem Auslass aspirieren.

Nach dem Wiederaufhängen der barcodeierten Perlenaufhängung wird sofort 200 Mikroliter Suspension in den Chipeinlass eingespritzt und 20 Sekunden lang mit 10 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Sanft eine Perlensuspension zweimal pipetten, bevor Sie sie wieder auf den Shaker legen. Entziehe nun die Suspensionen der Barcode-Perle aus dem Auslass, dann pipettiere 200 Mikroliter 20X Tris-EDTA und 50 millimolare Dithiothreitol-Lösung.

Flüssigkeit aus dem Auslass entziehen. Für Zelllyse und MRNA-Erfassung werden langsam 200 Mikroliter Zelllysepuffer in den Chip-Einlass gegeben. Fügen Sie sofort 200 Mikroliter Mineralöl hinzu, um die Doppelbrunnen zu versiegeln.

Entferne die Lösung, die vom Chip-Auslass in den Abwasserbehälter fließt. Dann legen Sie den Chip waagerecht und lassen Sie ihn fünf Minuten bei Zimmertemperatur stehen. Gib langsam 200 Mikroliter 6-fache Salzlösung Natriumcitrat in den Einlauf.

Entferne die Abfallflüssigkeit und sauge die restliche Lösung aus dem Chip-Ausgang ab. Fügen Sie langsam 200 Mikroliter 6-fache salzhaltige Natriumcitrat hinzu, um den Chip zu füllen. Halte einen Magneten in der Nähe der Chipoberfläche und bewege ihn langsam vom Einlass zum Auslass, um mit Barcode versehene Perlen zu sammeln.

Schnell aspirieren Sie die Lösung und Perlen in ein Zentrifugenrohr mit 6-facher Kochsalzlösung von Natriumcitrat. Waschen Sie die mit dem Barcode versehenen Perlen dreimal mit 200 Mikrolitern 6-facher Salzlösungsnatriumcitrat, gefolgt von einem Umkehr-Transkriptionspuffer. Eine gleichmäßige Verteilung der immunmagnetischen Perlen wurde unter einem Magnetfeld beobachtet, während minimale Restperlen nach der magnetischen Entfernung eine erfolgreiche Freisetzung bestätigten.

Der CTC-Isolationschip erfasste effizient Tumorzellen sowohl aus 1-Milliliter- als auch 10-Milliliter-Proben. Die Hinzufügung des Reinigungschips erhöhte die Reinheit der Tumorzellen zusätzlich. In peripheren Blutproben, die mit minimalen LNCaP-Zellen versehen waren, bewahrte das CTC-Sortiersystem eine hohe Erfassungseffizienz und Reinheit.

Der Single-Cell-Barcoding-Chip erreichte eine Auslastungsquote von 85,6 % und 95,7 % der Barcode-Perlen, was zu einer Paarungsrate von 81,9 % führte. Die Erhöhung der Anzahl der geladenen Zellen verbesserte das Mikrowell-Belegungsverhältnis, ohne die Erfassungseffizienz zu verringern. Der integrierte CTC-Isolations- und Einzelzellsequenzierungs-Workflow erzeugte hochreine Tumorzellen und behielt die ursprünglichen Tumorzellverhältnisse genau bei. Die TSNE-Analyse unterteilte PC3-, LNCaP- und Jurkat-Zellen klar in drei Cluster, die jeweils durch eine eindeutige Markerexpression gekennzeichnet sind.

Der Jurkat-Zellcluster wurde durch starke Expression von TRBC1, IGLL1, CD1E und CD3D identifiziert, was durch eine Anreicherung der Signalwege zur T-Zell-Aktivierung bestätigt wurde. Die Cluster PC3 und LNCaP wurden durch differenziell exprimierte Gene unterschieden, wobei PC3 eine hohe Mikroseminoprotein-Expression zeigte und LNCaP NEDD4 exprimierte.