Peering am Gehirn Polysomen mit Rasterkraftmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine detaillierte Pipeline für die genaue Reinigung und Abscheidung von Polyribosomen im Gehirn auf Glimmer bereitzustellen und Tausende von Bildern mit einer Auflösung im Nanobereich zu erhalten, ohne dass umfangreiche Nachbearbeitungs- oder 3D-Rekonstruktionsanalysen erforderlich sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Translation und Translationskontrolle zu beantworten, wie z.B. das Verständnis des Einflusses der Ribosomenorganisation innerhalb von Polysomen während der Neuverdrahtung der Genexpression. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass keine Probenfixierung oder -markierung erforderlich ist und Messungen unter nahezu physiologischen Bedingungen durchgeführt werden können, um die Ribosomen und nackten RNA-Bestände leicht zu identifizieren.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Organisation des Polyribosoms von Säugetieren geben kann, kann sie auch auf andere Mikroorganismen wie Hefen, Bakterien und Insekten sowie auf den Status der translationalen Kontrolle der Genexpression angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Handhabung der polysomalen Probe zur Absorption von Glimmer und die Waschschritte recht knifflig sind und Handhabungsfähigkeiten und Erfahrung erfordern. Das Verfahren wird von Paola Bernabo und Lorenzo Lunelli vorgeführt.

Sammeln und frieren Sie zunächst Hirngewebe ein, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Ziehen Sie dann das gefrorene Taschentuch aus dem Gefrierschrank und bringen Sie es zur Werkbank. Geben Sie das gefrorene Hirngewebe und den flüssigen Stickstoff in einen vorgekühlten Mörser und pulverisieren Sie es mit einem Stößel, bis es ein Pulver bildet.

Übertragen Sie etwa 25 Milligramm des Gehirnpulvers in ein kaltes Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie sofort 0,8 Milliliter Lysepuffer hinzu. Pipettieren Sie die Mischung 25 Mal schnell auf und ab, um die Zellen aufzubrechen. Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 12.000 x g für eine Minute bei vier Grad Celsius, um die Zelltrümmer zu pelletieren.

Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und das Röhrchen 15 Minuten lang auf Eis halten. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen fünf Minuten lang, um Kerne und Mitochondrien zu pelletieren. Entfernen Sie anschließend vorsichtig einen Milliliter von der Oberseite eines zuvor vorbereiteten Saccharosegradienten.

Die Saccharose wird tropfenweise mit dem Überstand aus dem zytosolischen Lysat überlagert. Nachdem die Probe nun auf das Gefälle geladen ist, werden das Röhrchen und ein Ausgleichsrohr vorsichtig in die Eimer eines schwingenden Schaufelrotors abgesenkt. Zentrifugieren Sie den Gradienten 100 Minuten lang.

Lassen Sie die Röhrchen nach der Ultrazentrifugation 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius in ihren Eimern, damit sich der Gradient stabilisieren kann. Entfernen Sie dann vorsichtig das Probenröhrchen und montieren Sie es auf die Kollektorvorrichtung eines Dichtegradientenfraktionierungssystems. Sammeln Sie Ein-Milliliter-Fraktionen, während Sie die Absorption von Nukleinsäuren in 260 Nanometern mit einem UV-Detektor für sichtbares Licht überwachen, und legen Sie sie auf Eis.

Bereiten Sie als nächstes 30-40 Mikroliter Aliquots der interessierenden Fraktionen vor und bewahren Sie sie auf Eis auf. Wenn die Proben nicht sofort verwendet werden, lagern Sie sie bei 80 Grad Celsius und ergreifen Sie Maßnahmen, um die Anzahl der Gefrier- und Auftauzyklen zu begrenzen. Um Proben für die AFM-Bildgebung vorzubereiten, bedecken Sie zunächst eine gewaschene Glimmerplatte mit 200 Mikrolitern eines Millimolaren Nickel-II-Sulfats und inkubieren Sie die Platte drei Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie dann die Lösung, trocknen Sie die Oberfläche mit Druckluft ab und stellen Sie die Petrischale auf Eis. Fügen Sie dann vorsichtig das gesamte Aliquot aus dem Bruchteil des Zinses Tropfen für Tropfen auf den Glimmer hinzu. Verteilen Sie die Probe mit einer 100- oder 200-Mikroliter-Spitze über die gesamte Oberfläche des Glimmers und inkubieren Sie die Probe drei Minuten lang auf Eis.

Decken Sie dann das Glimmerblatt Tropfen für Tropfen mit 200 Mikrolitern Kaltpuffer-AFM ab und inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang auf Eis. Die Probe bei 40 Grad zu halten und kalten Puffer zu verwenden, die in RNase-freiem Wasser hergestellt wurden, sind wichtig, um die Polyribosomenorganisation zu erhalten. Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig den Puffer und waschen Sie den Glimmer drei- bis viermal mit 200 Mikrolitern Kaltpuffer AFM, um überschüssige Saccharose zu entfernen.

Waschen Sie dann den Glimmer dreimal mit kalter Waschlösung und lassen Sie das überschüssige Wasser mit Papier vom Glimmer ab. Die vollständige Entfernung von Saccharose aus den absorbierenden Proben ist entscheidend, da Sie sowohl das Ribosom als auch die nackte RNA im Polysom durchtrennt haben. Lassen Sie die Probe unter der Chemikalienhaube trocknen, wobei die Oberseite der Petrischale teilweise geöffnet ist.

Nach zwei Stunden die Petrischale verschließen. Die Probe kann nun bei Raumtemperatur gelagert werden. Befestigen Sie die vorbereitete Probe mit doppelseitigem Klebeband am Probenhalter des AFM.

Setzen Sie dann den Probenhalter gemäß den Anweisungen des Herstellers in den AFM-Tisch ein. Nähern Sie sich nach der Kalibrierung der Probe, bis die Cantilever-Spitze in die Oberfläche eingreift. Wählen Sie einen Scanbereich von zwei mal zwei Mikrometern mit einer Auflösung von mindestens 512 x 512 Pixeln, wählen Sie den Live-Hintergrundsubtraktionsmodus und wählen Sie eine Z-Skala von 20 bis 25 Nanometern.

Beginnen Sie dann mit der Bildaufnahme. Untersuchen Sie das Bild und suchen Sie bei der Aufnahme von Bildern in der Luft nach runden Objekten, die durch eine Höhe zwischen 10 und 15 Nanometern gekennzeichnet sind. Passen Sie als Nächstes die Sollwert- und Feedback-Parameter an, bis scharfe Objekte visualisiert werden.

Bei guten Proben mit einigen zwei bis vier Nanometer hohen Objekten sollte der Hintergrund relativ flach erscheinen. Sobald das Bild gut aussieht, nehmen Sie mehrere zwei mal zwei Mikrometer große Scans an verschiedenen Probenbereichen auf. Nach der Abscheidung von Saccharose-Aliquoten auf Glimmer liefert das AFM genaue Größenbeschreibungen einzelner Polysomen, die als Cluster dicht gepackter Ribosomen erscheinen.

Schaut man sich einen der ribosomalen Peaks mittels Querschnittsanalyse genauer an, so zeigt sich, dass die Höhe der ribosomalen Peaks bei etwa 14 Nanometern liegt. Dies entspricht dem, was zuvor für humane Ribosomen und Polysomen nach der Lufttrocknung beobachtet wurde. Im Bild rechts wurde ein Makro verwendet, um die Position des Ribosoms zu identifizieren und jedes Ribosom mit einem roten Kreis zu markieren.

Anhand dieser Informationen kann die Häufigkeitsverteilung der Anzahl der Ribosomen pro Polysom analysiert werden. Diese experimentelle Verteilung wurde mit einer Gaußschen Kurve versehen, die bei 5,8 Ribosomen pro Polysom zentriert war, mit einer Standardabweichung von 1,3. Einmal gemeistert, kann diese Technik von der Pulverisierung des Gehirns bis zur Aufnahme von Polyribosomenbildern in weniger als acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Probe auf Eis zu halten und kalte Puffer für die Probenabscheidung auf dem Glimmer zu verwenden. Wenn Sie diesem Verfahren folgen und das ImageJ-Plugin eines Entwicklers verwenden, um es in Ihrer Arbeit zur Verfügung zu stellen, können Sie die Anzahl der Ribosomen pro Polysom genau zählen. Nach jeder Entwicklung ebnet diese Technik den Weg, um die Kinetik der Polysomenbildung zu verstehen und die Veränderungen in der Polysomenorganisation und ihre unterschiedlichen Zell- oder Gewebebedingungen zu identifizieren.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Tausende von Polysomenbildern erhalten, um ihre Organisation systematisch zu analysieren und zu studieren.