Eine schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Ausbeute an Plasma-Peptidkonzentrationen im menschlichen Blut zu erhöhen

Das übergeordnete Ziel dieser RAPID-Methode besteht darin, die Ausbeute endogener Peptidhormone zu verbessern, die in menschlichem Blut gemessen werden sollen. Die RAPID-Methode wurde kürzlich für die Anwendung bei Ratten etabliert und eignet sich ebenfalls für die Verwendung in menschlichem Blut. Die RAPID-Methode erhöht die Ausbeute und ermöglicht die Detektion der korrekten molekularen Form des endogenen Peptids.

Die RAPID-Methode ist einfach anzuwenden. Allerdings ist die RAPID-Methode im Vergleich zur Standard-Blutentnahme zeitaufwändiger und teurer. Daher könnte sie eher im Forschungskontext Anwendung finden.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die rechtzeitige Verdünnung der Proben sowie die Elution von großer Bedeutung für eine korrekte Peptidkonzentration sind. Sammeln Sie venöses Blut zu einem standardisierten Zeitpunkt nach einer Nachtfastenperiode aus einer Vene des Unterarms und verarbeiten Sie es gemäß Standardverfahren oder der RAPID-Methode.

Weisen Sie die Probanden an, vor der Blutentnahme nicht zu trainieren oder zu rauchen. Für die Standardverarbeitung sammeln Sie das Blut in gekühlten Röhrchen mit EDTA und zentrifugieren es innerhalb von 10 Minuten bei 3000 Gs für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und lagern Sie ihn bis zur weiteren Verarbeitung mittels Radioimmunoassay bei minus 80 Grad Celsius.

Für die RAPID-Verarbeitung das Blut sofort im Verhältnis 1 zu 10 in eiskaltem RAPID-Puffer verdünnen. pH 3,6, enthaltend 0,1 molare Ammoniumacetat, 0,5 molare Natriumchlorid und Enzyminhibitoren.

Zentrifugieren Sie die RAPID-Probe innerhalb von 10 Minuten bei 3000 Gs für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand mittels Pipette. Laden Sie danach die Chromatographiesäulen mit 100 % Acetonitril bei 10 Milliliter pro Minute. Anschließend erfolgt die Äquilibrierung mit 0,1 % Trifluoressigsäure oder TFA.

Laden Sie mit dem RAPID-Probenüberstand bei einer konstanten Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute mittels einer Spritzenpumpe auf. Nach dem Waschen der Kartuschen mit drei Milliliter 0,1 %iger TFA bei 10 Milliliter pro Minute, eluieren Sie die RAPID-Probe langsam mit zwei Milliliter 70%iger Acetonitril-Lösung, die 0,1 % TFA enthält, bei zwei Milliliter pro Minute. Trocknen Sie die eluierten Proben durch Vakuumzentrifugation und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie weiter durch Radioimmunoassay verarbeitet werden.

Beziehen Sie radioaktiv mit Iod-125 markierte humane Peptide. Lagern Sie die Peptide bis zum Experiment in Pulverform. Verdünnen Sie sie anschließend frisch in 0,1 %iger Essigsäure.

Für die Standardverarbeitung unmittelbar nach der Blutentnahme ein Milliliter Blut in ein Gefäß mit 50 Mikrolitern Radiomarker, das 3000 bis 6000 CPM enthält, in ein gekühltes EDTA-haltiges Röhrchen überführen. Für die RAPID-Verarbeitung ein Milliliter EDTA-haltiges Blut in ein Gefäß mit neun Millilitern RAPID-Puffer und 500 Mikrolitern Radiomarker, der 30.000 bis 60.000 CPM enthält, überführen. Aufgrund der 1:10-Verdünnung für die RAPID-Verarbeitung ein zehnmal höheres Volumen an Radiomarker verwenden.

Unmittelbar nach Anwendung der verschiedenen Schritte der RAPID-Methode die Wiederfindung radioaktiv markierter Peptide mittels eines Gammazählers bestimmen. Die Proben nicht im Vakuumzentrifugator trocknen und nicht bei minus 80 Grad Celsius lagern. Zum Messen das Überstand auf Röhrchen überführen, die in den Gammazähler passen.

Und bewerten Sie die Zählraten pro Minute. Messen Sie den gesamten Überstand in Standardproben. Bei RAPID-Proben analysieren Sie ein Zehntel des Gesamtvolumens, um eine vergleichbare Menge des radioaktiven Labels zu verwenden.

Verwenden Sie als 100 %-Standard zwei Proben mit je 50 Mikrolitern Iod-125-markiertem Peptid, die keiner Verarbeitung unterzogen werden. Messen Sie die Radioaktivität aller Proben gleichzeitig. Entnehmen Sie Blut in gekühlte Röhrchen mit EDTA und überführen Sie ein Milliliter in Röhrchen, die 200 Mikroliter markiertes acyliertes Ghrelin mit 15.000 bis 20.000 CPM enthalten, zur Standardverarbeitung.

Für DIE RASCHEN VERARBEITUNG wird ein Milliliter Blut in ein Gefäß mit neun Millilitern Schnellpuffer und 200 Mikroliter radioaktiv markiertem acyliertem Ghrelin mit 15.000 bis 20.000 CPM überführt. Danach werden die Proben wie zuvor verarbeitet. Für eine weitere Analyse mittels umgekehrter Phasen-HPLC werden die Proben direkt auf eine mit 17 % Acetonitril in Wasser, ergänzt mit 0,1 % TFA, vorgläubigte stabile Bond-C18-Säule aufgegeben.

Nach fünfminütiger Equilibrierung verwenden Sie einen Gradienten von 17 bis 40 % Acetonitril, um die Probe innerhalb von 40 Minuten bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute zu eluieren. Sammeln Sie Fraktionen von jeweils einem Milliliter pro Minute und analysieren Sie die Radioaktivität mithilfe eines Gammazählers. Führen Sie in einem separaten Experiment 200 Mikroliter radiomarkiertes acyliertes Ghrelin mit 15.000 bis 20.000 CPM direkt auf die Säule auf und führen Sie die HPLC wie zuvor durch.

Bei der Radioimmunoassay-Methode gefrorene Überstände und vakuumgetrocknetes Pulver bei Raumtemperatur auftauen. Unmittelbar vor dem Radioimmunoassay trockene RAPID-Proben gemäß dem ursprünglichen Plasma-Volumen in zweifach destilliertem Wasser resuspendieren. Kisspeptin sowie Gesamtghrelin und Acylghrelin mit kommerziellen Radioimmunoassays gemäß den Herstellerprotokollen bestimmen.

Verwenden Sie Borosilikatgefäße, die eine stabile Palettenbildung ermöglichen. Am ersten Tag inkubieren Sie die Proben mit dem Assaypuffer und dem primären Antikörper in der vom Hersteller angegebenen Verdünnung über einen Zeitraum von 24 Stunden. Am zweiten Tag geben Sie die Iod-125-Markierungssubstanz hinzu, wirbeln um und inkubieren erneut für einen Zeitraum von 24 Stunden.

Am dritten Tag das fällende Reagenz hinzufügen, vortexen und gemäß den Empfehlungen des Herstellers inkubieren. Anschließend die Röhrchen bei 3.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die Überstände abnehmen und die Radioaktivität in den Proben mithilfe eines Gammazählers bestimmen.

Berechnen Sie das Desazyl-Ghrelin als Differenz zwischen Gesamt-Ghrelin und Acyl-Ghrelin. Bestimmen Sie das Verhältnis von Acyl- zu Desazyl-Ghrelin, indem Sie für jede einzelne Probe das Acyl-Ghrelin durch das Desazyl-Ghrelin dividieren. Falls möglich, sollten alle Proben in einem Durchgang verarbeitet werden, um interassay-Variabilität zu vermeiden.

Die RAPID-Blutverarbeitung erhöht die Ausbeute an mit Iod-125 markierten Peptiden im menschlichen Blut im Vergleich zur Standard-Blutverarbeitung. Nach der Standard-Blutverarbeitung lag die Rückgewinnung markierter Peptide bei neun Peptiden zwischen 48 % und 68 %. Die RAPID-Verarbeitung verbesserte die Ausbeute bei allen mit Iod-125 markierten Peptiden, wobei die Rückgewinnung zwischen 71 % und 98 % betrug. Dargestellt ist hier das Elutionsprofil von mit Iod-125 markiertem acyliertem Ghrelin im menschlichen Blut nach Standard- oder RAPID-Blutverarbeitung.

Nach der RAPID-Verarbeitung eluierte Ghrelin, das mit Iod-125 markiert war, an der erwarteten Position. Bei dem Standardverfahren wurde hingegen ein früherer Peak beobachtet, der wahrscheinlich dem Desacyl-Ghrelin entspricht.

Dies repräsentierte einen 62 %igen Abbau des Peptids. Die RAPID-Blutverarbeitung verbessert das Verhältnis von akyl- zu desazyl-Ghrelin im Vergleich zur Standardverarbeitung. Nach der RAPID-Verarbeitung betrug das Verhältnis von akyl- zu desazyl-Ghrelin im Blut von Probanden mit Normalgewicht eins zu drei.

Im Vergleich zu einem bis 23 nach der Standard-Blutverarbeitung. Ähnliche Ergebnisse wurden unter anorektischen und adipösen Bedingungen beobachtet. Die RAPID-Blutverarbeitung führt im Vergleich zur Standardverarbeitung zu erhöhten endogenen Blutspiegel des Kisspeptins.

Bei sowohl anorektischen als auch normalgewichtigen Probanden waren die zirkulierenden endogenen Kisspeptin-Spiegel nach RAPID signifikant höher als nach Standardverarbeitung. Der Unterschied erreichte bei Adipositas keine Signifikanz. Sobald die Technik beherrscht und ordnungsgemäß durchgeführt wird, kann sie in weniger als einer Stunde durchgeführt werden.

Diese Methode ist besonders wichtig, wenn die erwartete Konzentration des Peptids niedrig ist oder die Unterschiede zwischen den Gruppen gering sind. Eine allgemeine Empfehlung für Peptide kann nicht gegeben werden. Der potenzielle Nutzen für jedes Peptid sollte einmal zu Beginn getestet werden.

Diese Technik eröffnet Forschern verschiedener Fachgebiete die Möglichkeit, die Ausbeute und, noch wichtiger, die korrekte molekulare Form endogener Peptidhormone zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die RAPID-Methode für die Blutverarbeitung beim Menschen angewendet wird.