Name: Eine schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Ausbeute an Plasma-Peptidkonzentrationen im menschlichen Blut zu erhöhen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Lernen Sie die RAPID-Blutverarbeitungsmethode zur Steigerung der Ausbeute endogener Peptidhormone im menschlichen Blut. Diese Technik ermöglicht die genaue Bestimmung molekularer Formen für die Forschung.

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Diese Arbeit wurde von Deutsche Forschungsgemeinschaft STE 1765 / 3-1 (AS) und Bundesministerium für Bildung und Forschung 03IPT614A (CG) unterstützt. Wir danken Reinhard Lommel und Petra Buße für ihre hervorragenden technischen Support sowie Karin Johansson und Christina Hentzschel für die Hilfe bei Organisation und Durchführung von anthropometrische Messungen

Das Protokoll wurde von der Ethikkommission für Humanforschung genehmigt (Protokollnummer EA1 / 114/10). 1. Blutverarbeitung <ol><li> Venöses Blut von 7.00 bis 08.00 Uhr nach nächtlichem Fasten aus einem Unterarm Vene und Verfahren nach Standardverfahren oder der RAPID-Methode. Weisen Sie die Themen nicht ausüben oder rauchen vor der Blutentnahme. </li><li> Für Standard-Verarbeitung, sammeln Blut in gekühlten EDTA-enthaltenden Röhrchen und Zentrifuge innerhalb von 10 min bei 3000 × g für 10 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und halten bei -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung durch Radioimmunoassay. </li><li> Für die schnelle Verarbeitung, sofort Blut verdünnen (innerhalb von 1 min nach der Blutentnahme) 1:10 in eiskaltem Puffer (pH 3,6), enthaltend 0,1 M Ammoniumacetat, 0,5 M NaCl und Enzyminhibitoren (Diprotin A, E-64-d, Antipain , Leupeptin, Chymostatin, 1 &amp; mgr; g / ml). Dann Zentrifuge innerhalb von 10 min bei 3000 xg für 10 min bei 4 ° C und sammle Überstand using einer Pipette in Polypropylenröhrchen nach wie vor 6 bei Ratten beschrieben. <ol><li> Lade Chromatographie Patronen (360 mg, 55 bis 105 &amp; mgr; m) mit 100% Acetonitril (Rate 10 ml / min), ins Gleichgewicht mit 0,1% Trifluoracetat (TFA, Rate 10 ml / min) und die Last mit dem Überstand bei einer konstanten Geschwindigkeit von 1 ml / min eine Spritzenpumpe. </li><li> Danach waschen Kartuschen mit 3 ml 0,1% TFA (Rate 10 ml / min) und langsam mit 2 ml 70% Acetonitril, das 0,1% TFA (2 ml / min) eluiert. </li><li> Trockene eluierten Proben unter Verwendung von Vakuum Zentrifugation und bei -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung durch Radioimmunoassay. HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in Polypropylen (RAPID - Verarbeitung) und Borosilikat (Radioimmunoassay) Rohre , die deutlich niedrigere Oberflächenbindungseigenschaften aufweisen und somit Peptidverlust für die meisten der vor 26 suchten Peptide minimieren. </li></ol></li></ol> 2. Messungen Hinweis: Die Schritte in diesem Abschnitt sollte in einem Labor durchgeführt werden,für die Arbeit mit radioaktiven Stoffen zertifiziert. Standard - Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeit mit 125 I genommen werden sollte. <ol><li> Wiederherstellung von radiomarkiertem Peptides <ol><li> Erhalten Sie 125 I-radiomarkierte menschliche Peptide (z. B. Acyl-Ghrelin, GLP-1, Glukagon, Insulin, kisspeptin, Leptin, nesfatin-1, PYY 3-36 und Somatostatin-28). </li><li> Halten Peptide in Pulverform, bis das Experiment, dann frisch verdünnt in 0,1% Essigsäure (~ 100.000 cpm pro ml). </li><li> Für Standard-Blutverarbeitung, direkt nach der Blutentnahme in ein gekühltes EDTA enthaltenden Röhrchen, je 1 ml Blut in ein Röhrchen mit 50 ul radioaktiven Marker enthält 3000-6000 cpm (direkt gezählt, bevor das Experiment beginnt). </li><li> Für die schnelle Verarbeitung, Übertragung 1 ml Blut aus EDTA-Blut in ein Röhrchen mit 9 ml RAPID-Puffer, enthaltend (Zusammensetzung siehe 1.3) und 500 &amp; mgr; l radioaktiven Marker enthält 30.000-60.000 cpm. Aufgrund der 1:10 Verdünnung Einsatz 10-mal höheres Volumen an radiolabel für eine schnelle Verarbeitung. </li><li> Danach Prozessproben wie in den Schritten 1.2 bis 1.3.2 beschrieben. </li><li> Für die Wiederfindungsversuche, nicht trockene Proben durch Vakuum Zentrifugation und lagern nicht bei -80 ° C. Stattdessen beurteilen Gewinnung von radioaktiv markierten Peptiden direkt danach einen Gamma-Zähler verwendet wird. </li><li> Messen Sie die gesamte Überstand in Standardproben, während in RAPID Proben 1/10 des Gesamtvolumens analysieren Vergleichbarkeit der Menge an radioaktiver Markierung verwendet zu erhalten. Zur Messung den Überstand in den Rohren in den Gamma-Zähler Einbau und die Zählungen pro Minute beurteilen </li><li> Als 100% ige Standard, verwenden Sie zwei Proben mit 50 ul 125 I-radiomarkierten Peptid , das die Verarbeitung nicht unterziehen. Messen, die gleichzeitig mit anderen Proben, wie in 2.1.7 beschrieben. </li><li> Führen Sie die Experiment fünf bis sechs Mal für jedes Peptid. </li></ol></li><li> High Performance Liquid Chromatography of Radiolabeled Ghrelin <ol><li> Ziehen Sie Blut in chilled EDTA-Röhrchen und je 1 ml in Röhrchen, die 200 &amp; mgr; l radiomarkierten-acyl Ghrelin enthält 15.000-20.000 cpm (gezählt direkt bevor das Experiment beginnt) enthält. </li><li> Für die schnelle Verarbeitung, Übertragung 1 ml Blut in ein Röhrchen mit 9 ml RAPID-Puffer (Zusammensetzung siehe 1.3) und 200 &amp; mgr; l radiomarkierte Acyl- Ghrelin enthält 15.000-20.000 cpm. </li><li> Danach Prozessproben wie in den Schritten 1.2 bis 1.3.2 beschrieben. </li><li> Zur weiteren Analyse durch Umkehrphasen-HPLC, laden direkt Proben auf eine stabile Bindung C18-Säule (2,1 mm x 50 mm, 1,8 &amp; mgr; m), äquilibriert in 17% Acetonitril in Wasser (beide mit 0,1% TFA ergänzt). </li><li> Nach 5 min Äquilibrierung mit einem Gradienten von 17 bis 40% Acetonitril verwenden, um die Probe in 40 min (Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min) zu eluieren. </li><li> Sammle Fraktionen von 1 ml pro Minute und zu analysieren, die Radioaktivität eines Gamma-Zählers verwendet wird. </li><li> In einem separaten Experiment, Last 200 ul radioaktiv markiertes Acyl Ghrelin enthält 15.000-20.000cpm auf die Säule direkt und HPLC zuführen, wie 2.2.4 bis 2.2.6 in Schritten beschrieben. </li></ol></li><li> Radioimmunoassay <ol><li> Für Radioimmunoassay, auftauen gefrorenen Stände (Standardverarbeitung) und getrocknete Pulver (RAPID-Methode) bei Raumtemperatur-Vakuum. </li><li> Unmittelbar vor dem Radioimmunoassay, resuspendieren trockenen RAPID Proben in doppelt destilliertem H 2 O nach dem ursprünglichen Volumen von Plasma (500 ul). </li><li> Beurteilen kisspeptin und insgesamt (einschließlich sowohl Desacyl und Acyl Ghrelin) sowie acyl Ghrelin wie zuvor beschrieben 12,27 kommerziellen Radioimmunoassays verwendet , gemäß der Herstellerprotokolle. Verwenden Sie Borosilikat-Rohre, die stabile Pelletbildung ermöglichen. <ol><li> Am ersten Tag, inkubiere die Proben mit Testpuffer und primärem Antikörper (z. B. anti-Ghrelin) in der Verdünnung durch den Hersteller für einen Zeitraum von 24 Stunden vorgesehen ist . </li><li> Am zweiten Tag, fügen Sie die 125 I - Tracer (zB 125 I-Ghrelin), voRTEX und für einen Zeitraum von 24 Stunden inkubieren. </li><li> Am dritten Tag, fügen Sie das Fällungsreagenz, Wirbel und Inkubation, wie vom Hersteller empfohlen. Dann Zentrifugenröhrchen bei 3.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie die Überstände und zählen Radioaktivität in den Pellets mit einem Gamma-Zähler mit </li></ol></li><li> Berechnen Desacyl Ghrelin als Differenz der gesamten minus Acyl- Ghrelin. Beurteilen Sie die Acyl / Desacyl Ghrelin Verhältnis von Acyl von Desacyl Ghrelin für jede einzelne Probe dividiert wird. </li><li> Verarbeiten Sie alle Proben - wenn möglich - in einer Charge Variabilität zwischen den Tests zu vermeiden. Die Intra-Assay-Variabilität in dem vorliegenden Experiment war &lt;8% für kisspeptin, &lt;7% für insgesamt und &lt;9% für Acyl Ghrelin. </li></ol></li></ol> 3. Statistische Analyse <ol><li> Bestimmen Sie die Verteilung der Daten des Kolmogorov-Smirnov-Test. Express-Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). </li><li> Beurteilen, Unterschiede zwischen zweiGruppen durch t-Test. Beurteilen Sie die Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen von allen paarweisen Mehrfachvergleichsverfahren (Tukey post hoc - Test) oder Zwei-Wege - ANOVA , gefolgt von Holm-Sidak Methode. </li><li> Betrachten Sie p &lt;0,05 signifikant und führen Analysen ein Statistik - Programm. </li></ol>

<ol><li>Finucane, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National%2C+regional%2C+and+global+trends+in+body-mass+index+since+1980%3A+systematic+analysis+of+health+examination+surveys+and+epidemiological+studies+with+960+country-years+and+9.1+million+participants%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants.</a> Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).</li>
<li>James, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+obesity%3A+the+size+of+the+problem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of obesity: the size of the problem.</a> J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).</li>
<li>Stengel, A., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+peptides+and+their+regulation+of+hunger+and+satiety%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gastroenterol+Rep%22%5BJournal%5D)">Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety.</a> Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).</li>
<li>Hussain, S. S., Bloom, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+food+intake+by+the+gut-brain+axis%3A+implications+for+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity.</a> Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).</li>
<li>Hosoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+collection+and+storage+conditions+for+ghrelin+measurements%3A+octanoyl+modification+of+ghrelin+is+rapidly+hydrolyzed+to+desacyl+ghrelin+in+blood+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples).</a> Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAPID+method+for+blood+processing+yields+new+insight+in+plasma+concentrations+and+molecular+forms+of+circulating+gut+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides.</a> Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+differentially+decreases+plasma+acyl+and+desacyl+ghrelin+levels+in+rats%3A+Potential+role+of+the+circulating+ghrelin-acylating+enzyme+GOAT%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT.</a> Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+ambient+temperature+reverses+abdominal+surgery-induced+delayed+gastric+emptying+and+decreased+plasma+ghrelin+levels+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats.</a> Peptides. 31, 2229-2235 (2010).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+administration+of+pan-somatostatin+agonist+ODT8-SST+prevents+abdominal+surgery-induced+inhibition+of+circulating+ghrelin%2C+food+intake+and+gastric+emptying+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats.</a> Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+surgery+inhibits+circulating+acyl+ghrelin+and+ghrelin-O-acyltransferase+levels+in+rats%3A+role+of+the+somatostatin+receptor+subtype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+urocortin+1+induces+a+CRF2+mediated+increase+in+circulating+ghrelin+and+glucose+levels+through+distinct+mechanisms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats.</a> Peptides. 39, 164-170 (2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexigenic+response+to+tail+pinch%3A+role+of+brain+NPY%281%29+and+corticotropin+releasing+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).</li>
<li>Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+increases+plasma+levels+of+corticotropin-releasing+hormone+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats.</a> Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).</li>
<li>Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ethylenediamine+tetraacetic+acid+%28EDTA%29+as+in+vitro+anticoagulant+for+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes.</a> Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).</li>
<li>Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrally+injected+kisspeptin+reduces+food+intake+by+increasing+meal+intervals+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice.</a> Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).</li>
<li>De Bond, J. A., Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kisspeptin+and+energy+balance+in+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Kisspeptin and energy balance in reproduction.</a> Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).</li>
<li>Wren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+enhances+appetite+and+increases+food+intake+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans.</a> J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992(2001).</li>
<li>Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glucagon+on+food+intake+and+body+weight+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of glucagon on food intake and body weight in man.</a> J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).</li>
<li>Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+glucagon-like+peptide+1+or+peptide+YY+3-36+affects+food+intake+in+healthy+male+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects.</a> Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).</li>
<li>Dewan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+insulin-induced+hypoglycaemia+on+energy+intake+and+food+choice+at+a+subsequent+test+meal%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal.</a> Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).</li>
<li>Schlogl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+24-hour+ad+libitum+food+intake+is+associated+with+lower+plasma+irisin+concentrations+the+following+morning+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Appetite%22%5BJournal%5D)">Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans.</a> Appetite. 90, 154-159 (2015).</li>
<li>Heymsfield, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+leptin+for+weight+loss+in+obese+and+lean+adults%3A+a+randomized%2C+controlled%2C+dose-escalation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial.</a> JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).</li>
<li>Shimizu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+administration+of+nesfatin-1+reduces+food+intake+in+mice%3A+the+leptin-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism.</a> Endocrinology. 150, 662-671 (2009).</li>
<li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+food+intake+in+obese+subjects+by+peptide+YY3-36%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36.</a> N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).</li>
<li>Shibasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+effect+of+somatostatin+on+corticotropin-releasing+factor-induced+anorexia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat.</a> Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>Smets, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+plasma+levels+of+metastin+in+early+pregnancy+are+associated+with+small+for+gestational+age+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat+Diagn%22%5BJournal%5D)">Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates.</a> Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).</li>
<li>Kojima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+is+a+growth-hormone-releasing+acylated+peptide+from+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach.</a> Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).</li>
<li>Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((the+Gastric+X%2FA-like+Cell+as+Possible+Dual+Regulator+of+Food+Intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake.</a> J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).</li>
<li>Inhoff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desacyl+ghrelin+inhibits+the+orexigenic+effect+of+peripherally+injected+ghrelin+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats.</a> Peptides. 29, 2159-2168 (2008).</li>
<li>Hirayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+effects+of+ghrelin+and+des-acyl+ghrelin+on+the+lumbo-sacral+defecation+center+and+regulation+of+colorectal+motility+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats.</a> Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).</li>
<li>Horikoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+elevation+of+plasma+metastin+concentrations+in+human+pregnancy%3A+metastin+as+a+novel+placenta-derived+hormone+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans.</a> J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).</li>
<li>Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+of+kisspeptin+levels+in+girls+with+idiopathic+central+precocious+puberty+and+its+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance.</a> Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).</li>
<li>Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+and+des-acyl+ghrelin%3A+two+major+forms+of+rat+ghrelin+peptide+in+gastrointestinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue.</a> Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).</li>
<li>Raff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+and+active+ghrelin+in+developing+rats+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia.</a> Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+anticoagulants+and+storage+temperatures+on+stability+of+plasma+and+serum+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones.</a> Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).</li>
<li>Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+degradation+pathway+of+recombinant+human+parathyroid+hormone%3A+deamidation+of+asparaginyl+residue+and+peptide+bond+cleavage+at+aspartyl+and+asparaginyl+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues.</a> Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).</li>
<li>White, A., Handler, P., Smith, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+A+%22Principles+of+Biochemistry%22">Principles of Biochemistry</a>. , 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir berichteten vor , dass die schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Erholung für 12.11 Peptide im Vergleich zu Standardblutverarbeitung bei Ratten verbessert 6. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass dieses Verfahren auch für die Anwendung beim Menschen geeignet ist. Im Anschluss an eine schnelle Verarbeitung, die Erholung für 9 von 9 125 I-markierten Peptiden getestet wurde verbessert im Vergleich zu Standard - Blutverarbeitung (EDTA - Blut auf Eis). Die beobachtete Verbesserung r...

Angesichts der weltweit zunehmenden Verbreitung von Fettleibigkeit 1,2, Forschung auf dem Gebiet der Nahrungsaufnahme Regulierung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Während bisher nur ein Peptid bekannt ist , dass peripher produziert und wirkt zentral Nahrungsaufnahme zu stimulieren, nämlich Ghrelin 3, in den letzten Jahrzehnten hat sich ein breites Spektrum von Peptiden worden , die Aufnahme zu reduzieren Lebensmittel identifiziert, z. B. Leptin, Peptid YY (PYY) und auch Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) und Insulin - 4 daher in Studien , die die Regulationsmechanismen von Hunger und Sättigung Peptidspiegel sucht werden oft beurteilt und zugleich wird angenommen , dass das Peptid untersucht ist stabil und mit hoher Ausbeute während der Plasmabildung wiedergewonnen. Doch sehr oft ist dies nicht der Fall aufgrund der schnellen endogenen Abbau nach wie vor für zB gezeigt. Ghrelin , die aus Acyl abgebaut wird Ghrelin 5 bis Desacyl. Deshalb haben wir beschrieben, vor kurzem die schnelle Methode zur Blut VorarbVerwendung von R educed Temperaturen bei Ratten singen, A cidification, rotease P Hemmung, ich sotopic 6 exogene Kontrollen und D ilution. Dieses Verfahren verbessert die Erholung für 11 von 12 Peptiden getestet und für die Bestimmung des richtigen zirkulierende molekularer Form im Vergleich zu Standardblutverarbeitung (EDTA - Blut auf Eis) erlaubt 6. Dieses Verfahren wurde in mehreren nachfolgenden Studien 7-12 zur Detektion von zirkulierenden Ghrelin sowie Corticotropin-Releasing - Faktor 13 verwendet. Daher hat das Verfahren für die Peptidforschung in Nagetieren als nützlich erwiesen. da Nagetier Studien sind jedoch nicht immer übersetzbar zu anderen Spezies, soll das Verfahren auch für die Verwendung im menschlichen Blut hergestellt werden. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die schnelle Methode zur Blutverarbeitung beim Menschen im Vergleich zu Standard - Blutverarbeitung, EDTA - Blut auf dem Eis zu testen, die weit 14 empfohlen und häufig uin der klinischen sowie Forschungs Einstellung sed. Wir testeten die Wiederherstellung einer Auswahl von 125 I-markierten Peptiden in der Regulation der Nahrungsaufnahme einschließlich etablierten Peptide beteiligt sowie neue Kandidaten vor kurzem in der Fütterung Regulierung eine Rolle zu spielen vorgeschlagen folgende Verarbeitung (Auswirkungen auf die Nahrungsaufnahme sind in Tabelle 1 gezeigt) mit beiden Methoden. Hormone wurden auch verwendet, um Peptide von unterschiedlicher Länge und Ladung (Tabelle 2) ausgewählt. Darüber hinaus für Ghrelin untersuchten wir die molekularen Form (en) nach dem Standard und schnelle Methode. Schließlich wir endogene Ghrelin (acyl und Desacyl Ghrelin) sowie kisspeptin Ebenen bewertet, ein Peptid , auch vor kurzem vorgeschlagen , eine Rolle bei der Regulation der Nahrungsaufnahme 15,16 folgenden RAPID oder Standard - Verarbeitung zu spielen. Darüber hinaus untersuchten wir auch diese Peptid - Werte in einer Population von Patienten mit einer breiten Palette von Body - Mass - Index ( im Bereich von 10,2 bis 67,6 kg / m 2) possib zu studierenle Unterschiede zu chronisch veränderte Körpergewicht bezogen. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/53959/53959table1.jpg" /><img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/53959/53959table2.jpg" /> Diagnose, Bewertung und Plan: Die Studienteilnehmer Alle Studienteilnehmer wurden neu Patienten im Krankenhaus (Aufnahme innerhalb von zwei Tagen nach der Aufnahme ins Krankenhaus war) der Abteilung für Psychosomatische Medizin an der Charité-Universitätsmedizin Berlin und gab informierte Zustimmung geschrieben. Um zu vermeiden, wurden keine Auswirkungen von Geschlecht nur weibliche Patienten eingeschlossen. Insgesamt 42 Probanden nahmen an dieser Studie und wurden in drei Gruppen eingeteilt: Normalgewicht (BMI 18,5 bis 25 kg / m 2, n = 12), Anorexia nervosa (BMI &lt;17,5 kg / m 2, n = 15) und Adipositas (BMI&gt; 30 kg / m 2, n = 15). Anorexic und adipösen Patienten warennach der Internationalen Klassifikation der Krankheiten-10 diagnostiziert und für die Gewichtszunahme (Anorexia nervosa) oder Gewichtsreduktion (Adipositas), die jeweils im Krankenhaus. Alle Normalgewicht Patienten wurden ausschließlich auf somatoforme Symptome ohne relevante somatische Störungen ins Krankenhaus. Patienten mit Magen-Darm-somatoforme Symptome oder einer Vorgeschichte von Magen-Darm-Chirurgie wurden ausgeschlossen. Ausschlusskriterien umfassten auch ein Alter &lt;18 Jahre, aktuelle Schwangerschaft und unbehandeltem psychotischen Erkrankungen. Die Blutentnahme wurde am Tag 2 oder 3 nach Einlieferung ins Krankenhaus durchgeführt, bevor diätetischen Behandlung, um Aufnahmekörpergewicht zu erhöhen oder zu verringern, beziehungsweise. Anthropometrische Parameter wurden am selben Tag untersucht.

<table><tbody><tr><td>Diprotin A</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IDP-4132</td><td></td></tr><tr><td>E-64-d</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IED-4321-v</td><td></td></tr><tr><td>Antipain</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IAP-4062</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>ILP-4041</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin</td><td>Peptide International, Louisville, KY, USA</td><td>ICY-4063</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 Patronen</td><td>Waters Corporation, Milford, MA, USA</td><td>WAT051910</td><td>360 mg, 55-105 & Mikro; m</td></tr><tr><td>Acyl-ghrelin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9088-HK</td><td>Radioaktives</td></tr><tr><td>GLP-1</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9035-HK</td><td>Radioaktives</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9030</td><td>Radioaktives</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9011S Radioaktives</td><td></td></tr><tr><td>Leptin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9081-HK</td><td>Radioaktives</td></tr><tr><td>Kisspeptin-10</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-048-56</td><td>Radioaktives</td></tr><tr><td>Nesfatin-1</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-003-26</td><td>Radioaktives</td></tr><tr><td>PYY3-36</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-059-02&nbsp;</td><td>radioaktiv</td></tr><tr><td>Somatostatin-28</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-060-16&nbsp;</td><td>radioaktiv</td></tr><tr><td>ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 Säule</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA</td><td>822700-902</td><td>2,1 mm x 50 mm, 1,8 & Mikro; m</td></tr><tr><td>Agilent 1200 LC&nbsp;</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>HPLC, mehrere Komponenten, daher keine einzige Katalognummer</td></tr><tr><td>Kisspeptin&nbsp; RIA</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td># RK-048-56</td><td>Radioaktives</td></tr><tr><td>Gesamt-Ghrelin RIA</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td># GHRT-89HK&nbsp;</td><td>radioaktiv</td></tr><tr><td>Aktives Ghrelin RIA</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td># GHRA-88HK</td><td>Radioaktives</td></tr><tr><td>SigmaStat 3.1</td><td>Systat Software, San Jose, CA, USA</td><td>Online-Download</td><td></td></tr></tbody></table>

eine schnelle methode zur blutverarbeitung die ausbeute an plasma-peptidkonzentrationen im menschlichen blut zu erhöhen

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Die Forschung im Bereich der Nahrungsaufnahme Regulierung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Dazu gehört oft die Messung von Peptiden Regulierung der Nahrungsaufnahme. Für die korrekte Bestimmung der Konzentration des Peptids, sollte es während der Blutverarbeitung stabil sein. Dies ist jedoch nicht der Fall für mehrere Peptide, die durch endogene Peptidasen schnell abgebaut werden. Vor kurzem haben wir eine Blutverarbeitungsverfahren unter Verwendung von R educed Temperaturen entwickelt, A cidification, rotease P Hemmung, I sotopic exogenen Kontrollen und D ilution (RAPID) für die Verwendung in Ratten. Hier haben wir diese Technik für den Einsatz beim Menschen festgestellt und untersucht Erholung, molekulare Form und zirkulierende Konzentration der Nahrungsaufnahme regulatorischen Hormone. Die RAPID Verfahren erheblich verbessert die Erholung für 125 I-markierte Somatostatin-28 (+ 39%), Glucagon-like Peptid-1 (+ 35%), Acyl- Ghrelin und Glukagon (+ 32%), Insulin und kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), Leptin(+ 21%) und Peptid YY 3-36 (+ 19%) im Vergleich zu Standard - Verarbeitung (EDTA - Blut auf dem Eis, p &lt;0,001). Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zeigte die Elution von endogenen Acyl Ghrelin an der erwarteten Position, nachdem eine schnelle Verarbeitung, während nach Standardverarbeitungs 62% der Acyl Ghrelin abgebaut wurden in einem früheren Peak resultierende Wahrscheinlichkeit darstellt Desacyl Ghrelin. Nach dem schnellen Verarbeitung der Acyl- / Desacyl Ghrelin - Verhältnis im Blut von normalen gewichtigen Probanden betrug 1: 3 im Vergleich zu 1.23 folgende Standardverarbeitung (p = 0,03). Auch endogene kisspeptin Werte waren höher nach RAPID Vergleich zu Standardverarbeitung (+ 99%, p = 0,02). Die RAPID Blutverarbeitungsverfahren kann beim Menschen verwendet werden, ergibt höhere Peptidspiegel und ermöglicht die Beurteilung der richtigen molekularen Form.

RAPID Blutverarbeitung erhöht die Ausbeute von 125 I-radiomarkierten Peptide im menschlichen Blut im Vergleich zu Standard - Blutverarbeitung. Nach Standardblutverarbeitungs (EDTA Blut auf Eis), war die Rückgewinnung von radiomarkierten Peptide ~ 60% in 9/9 Peptide ( im Bereich von 48 bis 68%, 1A - K). Schnellverarbeitung , die Ausbeute in allen 125 I-markierte Peptide, nämlich in Somatostatin-28 (+ 39%, 1A),...

Die RAPID Blutverarbeitungsverfahren kann beim Menschen eingesetzt werden und liefert höhere Peptidspiegel sowie ermöglicht die Beurteilung der richtigen molekularen Form. Daher wird dieses Verfahren ein wertvolles Werkzeug in der Peptid Forschung sein.

Eine schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Ausbeute an Plasma-Peptidkonzentrationen im menschlichen Blut zu erhöhen

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Das übergeordnete Ziel dieser RAPID-Methode besteht darin, die Ausbeute endogener Peptidhormone zu verbessern, die in menschlichem Blut gemessen werden sollen. Die RAPID-Methode wurde kürzlich für die Anwendung bei Ratten etabliert und eignet sich ebenfalls für die Verwendung in menschlichem Blut. Die RAPID-Methode erhöht die Ausbeute und ermöglicht die Detektion der korrekten molekularen Form des endogenen Peptids.Die RAPID-Methode ist einfach anzuwenden. Allerdings ist die RAPID-Methode im Vergleich zur Standard-Blutentnahme zeitaufwändiger und teurer. Daher könnte sie eher im Forschungskontext Anwendung finden.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die rechtzeitige Verdünnung der Proben sowie die Elution von großer Bedeutung für eine korrekte Peptidkonzentration sind. Sammeln Sie venöses Blut zu einem standardisierten Zeitpunkt nach einer Nachtfastenperiode aus einer Vene des Unterarms und verarbeiten Sie es gemäß Standardverfahren oder der RAPID-Methode.Weisen Sie die Probanden an, vor der Blutentnahme nicht zu trainieren oder zu rauchen. Für die Standardverarbeitung sammeln Sie das Blut in gekühlten Röhrchen mit EDTA und zentrifugieren es innerhalb von 10 Minuten bei 3000 Gs für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und lagern Sie ihn bis zur weiteren Verarbeitung mittels Radioimmunoassay bei minus 80 Grad Celsius. Für die RAPID-Verarbeitung das Blut sofort im Verhältnis 1 zu 10 in eiskaltem RAPID-Puffer verdünnen. pH 3,6, enthaltend 0,1 molare Ammoniumacetat, 0,5 molare Natriumchlorid und Enzyminhibitoren.Zentrifugieren Sie die RAPID-Probe innerhalb von 10 Minuten bei 3000 Gs für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand mittels Pipette. Laden Sie danach die Chromatographiesäulen mit 100 % Acetonitril bei 10 Milliliter pro Minute. Anschließend erfolgt die Äquilibrierung mit 0,1 % Trifluoressigsäure oder TFA.Laden Sie mit dem RAPID-Probenüberstand bei einer konstanten Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute mittels einer Spritzenpumpe auf. Nach dem Waschen der Kartuschen mit drei Milliliter 0,1 %iger TFA bei 10 Milliliter pro Minute, eluieren Sie die RAPID-Probe langsam mit zwei Milliliter 70%iger Acetonitril-Lösung, die 0,1 % TFA enthält, bei zwei Milliliter pro Minute. Trocknen Sie die eluierten Proben durch Vakuumzentrifugation und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie weiter durch Radioimmunoassay verarbeitet werden.Beziehen Sie radioaktiv mit Iod-125 markierte humane Peptide. Lagern Sie die Peptide bis zum Experiment in Pulverform. Verdünnen Sie sie anschließend frisch in 0,1 %iger Essigsäure.Für die Standardverarbeitung unmittelbar nach der Blutentnahme ein Milliliter Blut in ein Gefäß mit 50 Mikrolitern Radiomarker, das 3000 bis 6000 CPM enthält, in ein gekühltes EDTA-haltiges Röhrchen überführen. Für die RAPID-Verarbeitung ein Milliliter EDTA-haltiges Blut in ein Gefäß mit neun Millilitern RAPID-Puffer und 500 Mikrolitern Radiomarker, der 30.000 bis 60.000 CPM enthält, überführen. Aufgrund der 1:10-Verdünnung für die RAPID-Verarbeitung ein zehnmal höheres Volumen an Radiomarker verwenden.Unmittelbar nach Anwendung der verschiedenen Schritte der RAPID-Methode die Wiederfindung radioaktiv markierter Peptide mittels eines Gammazählers bestimmen. Die Proben nicht im Vakuumzentrifugator trocknen und nicht bei minus 80 Grad Celsius lagern. Zum Messen das Überstand auf Röhrchen überführen, die in den Gammazähler passen.Und bewerten Sie die Zählraten pro Minute. Messen Sie den gesamten Überstand in Standardproben. Bei RAPID-Proben analysieren Sie ein Zehntel des Gesamtvolumens, um eine vergleichbare Menge des radioaktiven Labels zu verwenden.Verwenden Sie als 100 %-Standard zwei Proben mit je 50 Mikrolitern Iod-125-markiertem Peptid, die keiner Verarbeitung unterzogen werden. Messen Sie die Radioaktivität aller Proben gleichzeitig. Entnehmen Sie Blut in gekühlte Röhrchen mit EDTA und überführen Sie ein Milliliter in Röhrchen, die 200 Mikroliter markiertes acyliertes Ghrelin mit 15.000 bis 20.000 CPM enthalten, zur Standardverarbeitung.Für DIE RASCHEN VERARBEITUNG wird ein Milliliter Blut in ein Gefäß mit neun Millilitern Schnellpuffer und 200 Mikroliter radioaktiv markiertem acyliertem Ghrelin mit 15.000 bis 20.000 CPM überführt. Danach werden die Proben wie zuvor verarbeitet. Für eine weitere Analyse mittels umgekehrter Phasen-HPLC werden die Proben direkt auf eine mit 17 % Acetonitril in Wasser, ergänzt mit 0,1 % TFA, vorgläubigte stabile Bond-C18-Säule aufgegeben.Nach fünfminütiger Equilibrierung verwenden Sie einen Gradienten von 17 bis 40 % Acetonitril, um die Probe innerhalb von 40 Minuten bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute zu eluieren. Sammeln Sie Fraktionen von jeweils einem Milliliter pro Minute und analysieren Sie die Radioaktivität mithilfe eines Gammazählers. Führen Sie in einem separaten Experiment 200 Mikroliter radiomarkiertes acyliertes Ghrelin mit 15.000 bis 20.000 CPM direkt auf die Säule auf und führen Sie die HPLC wie zuvor durch.Bei der Radioimmunoassay-Methode gefrorene Überstände und vakuumgetrocknetes Pulver bei Raumtemperatur auftauen. Unmittelbar vor dem Radioimmunoassay trockene RAPID-Proben gemäß dem ursprünglichen Plasma-Volumen in zweifach destilliertem Wasser resuspendieren. Kisspeptin sowie Gesamtghrelin und Acylghrelin mit kommerziellen Radioimmunoassays gemäß den Herstellerprotokollen bestimmen.Verwenden Sie Borosilikatgefäße, die eine stabile Palettenbildung ermöglichen. Am ersten Tag inkubieren Sie die Proben mit dem Assaypuffer und dem primären Antikörper in der vom Hersteller angegebenen Verdünnung über einen Zeitraum von 24 Stunden. Am zweiten Tag geben Sie die Iod-125-Markierungssubstanz hinzu, wirbeln um und inkubieren erneut für einen Zeitraum von 24 Stunden.Am dritten Tag das fällende Reagenz hinzufügen, vortexen und gemäß den Empfehlungen des Herstellers inkubieren. Anschließend die Röhrchen bei 3.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die Überstände abnehmen und die Radioaktivität in den Proben mithilfe eines Gammazählers bestimmen.Berechnen Sie das Desazyl-Ghrelin als Differenz zwischen Gesamt-Ghrelin und Acyl-Ghrelin. Bestimmen Sie das Verhältnis von Acyl- zu Desazyl-Ghrelin, indem Sie für jede einzelne Probe das Acyl-Ghrelin durch das Desazyl-Ghrelin dividieren. Falls möglich, sollten alle Proben in einem Durchgang verarbeitet werden, um interassay-Variabilität zu vermeiden.Die RAPID-Blutverarbeitung erhöht die Ausbeute an mit Iod-125 markierten Peptiden im menschlichen Blut im Vergleich zur Standard-Blutverarbeitung. Nach der Standard-Blutverarbeitung lag die Rückgewinnung markierter Peptide bei neun Peptiden zwischen 48 % und 68 %. Die RAPID-Verarbeitung verbesserte die Ausbeute bei allen mit Iod-125 markierten Peptiden, wobei die Rückgewinnung zwischen 71 % und 98 % betrug. Dargestellt ist hier das Elutionsprofil von mit Iod-125 markiertem acyliertem Ghrelin im menschlichen Blut nach Standard- oder RAPID-Blutverarbeitung.Nach der RAPID-Verarbeitung eluierte Ghrelin, das mit Iod-125 markiert war, an der erwarteten Position. Bei dem Standardverfahren wurde hingegen ein früherer Peak beobachtet, der wahrscheinlich dem Desacyl-Ghrelin entspricht.Dies repräsentierte einen 62 %igen Abbau des Peptids. Die RAPID-Blutverarbeitung verbessert das Verhältnis von akyl- zu desazyl-Ghrelin im Vergleich zur Standardverarbeitung. Nach der RAPID-Verarbeitung betrug das Verhältnis von akyl- zu desazyl-Ghrelin im Blut von Probanden mit Normalgewicht eins zu drei.Im Vergleich zu einem bis 23 nach der Standard-Blutverarbeitung. Ähnliche Ergebnisse wurden unter anorektischen und adipösen Bedingungen beobachtet. Die RAPID-Blutverarbeitung führt im Vergleich zur Standardverarbeitung zu erhöhten endogenen Blutspiegel des Kisspeptins.Bei sowohl anorektischen als auch normalgewichtigen Probanden waren die zirkulierenden endogenen Kisspeptin-Spiegel nach RAPID signifikant höher als nach Standardverarbeitung. Der Unterschied erreichte bei Adipositas keine Signifikanz. Sobald die Technik beherrscht und ordnungsgemäß durchgeführt wird, kann sie in weniger als einer Stunde durchgeführt werden.Diese Methode ist besonders wichtig, wenn die erwartete Konzentration des Peptids niedrig ist oder die Unterschiede zwischen den Gruppen gering sind. Eine allgemeine Empfehlung für Peptide kann nicht gegeben werden. Der potenzielle Nutzen für jedes Peptid sollte einmal zu Beginn getestet werden.Diese Technik er&ouml;ffnet Forschern verschiedener Fachgebiete die M&ouml;glichkeit, die Ausbeute und, noch wichtiger, die korrekte molekulare Form endogener Peptidhormone zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verst&auml;ndnis daf&uuml;r haben, wie die RAPID-Methode f&uuml;r die Blutverarbeitung beim Menschen angewendet wird.

a-rapid-method-for-blood-processing-to-increase-yield-plasma-peptide

Research

Forschung

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