Schnelle magnetische Mikrobead-Methode zur effizienten Aufreinigung von Neutrophilen niedriger Dichte

Wir untersuchen Neutrophile mit niedriger Dichte in peripheren mononuklearen Blutzellen, um deren Funktionen zu charakterisieren und ihre Rolle bei verschiedenen Krankheiten zu definieren. Neutrophile mit niedriger Dichte sind in gesundem Blut selten, nehmen aber bei Krankheiten wie systemischem Lupus erythematodes und Krebs deutlich zu. Zunächst geben Sie 10 Einheiten Heparin pro Milliliter als Antikoagulans in ein 15-Milliliter-konisches Zentrifugenrohr.

Dann fügen Sie zwei Milliliter 6 % T500 in PBS hinzu. Entnehmen Sie 10 Milliliter Blut von einem gesunden erwachsenen Freiwilligen durch Venenpunktion. In ein weiteres frisches 15-Milliliter-Zentrifugenrohr fügen Sie fünf Milliliter Dichtegradientmedium hinzu.

Pipettiere das Plasma vorsichtig aus, ohne die Erythrozyten zu berühren, und schichte es auf das Medium, um zwei separate Phasen zu bilden. Zentrifugiere das Rohr bei 516 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Um PBMCs zu isolieren, aspirieren und entsorgen Sie das Plasma oberhalb des PBMC-Bands, ohne die Zellen zu stören.

Sammeln Sie das mononukleare Zellband zwischen Plasma und Medium auf, wodurch die Ansammlung des Mediums minimiert wird. Gib 20 Milliliter PBS in das Rohr mit PBMCs und zentrifugiere dann mit 400 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie vorsichtig das Überdachungsmittel ab und kratzen Sie das Rohr, um das Pellet zu trennen.

Gib 10 Milliliter kaltes PBS dazu, um die Zellen wieder aufzuheben. Um Neutrophile zu isolieren, kratzen Sie das Rohr ab, um die Zellen nach dem Pipettern des Mediums zu trennen. Dann 10 Milliliter kaltes PBS hinzufügen.

Jetzt werden die Zellen in ein frisches, 50-Milliliter-konisches Zentrifugenrohr und Zentrifuge transportiert. Saugen Sie das Supernatant ab und kratzen Sie den Schlauch erneut. Jetzt pipettiere 10 Milliliter kalte hypotonische Lösung in das Rohr und rühre vorsichtig ein.

Rühren Sie vorsichtig genau eine Minute lang. Fügen Sie schnell 10 Milliliter kalte, hypertone Lösung hinzu, um die Lösung isoton zu machen. Dann zählen Sie die Neutrophile mit einer Neubauer-Kammer und stellen Sie sicher, dass die Reinheit über 95 % liegt. Zentrifugieren Sie die Suspension, um ein Zellpellet zu erhalten.

Anschließend wird das Pellet in kaltem PBS wieder suspendiert. Zentrifugiere die peripheren mononuklearen Blutzellen bei 400 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Supernatanten werden die Zellen in 120 Mikrolitern Kaltwaschpuffer wieder suspendiert.

Dann pipettieren Sie 35 Mikroliter CD66b magnetische Mikroperlen in die Zellsuspension. Brüten Sie die Mischung 30 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius aus. Pipettiere jetzt einen Milliliter Kaltwasserputzer auf den Schlauch.

Zentrifugiere das Rohr bei 400 g für drei Minuten. Kratze den Schlauch, um das Zellpellet nach dem Entfernen des Supernatants zu trennen. Und die Zellen in einem Milliliter Waschpuffer wieder suspendieren.

Setze eine magnetische Trennsäule auf einen Magneten. Gib 0,5 Milliliter Waschpuffer zur Säule, damit sie vollständig durchgehen kann. Übertragen Sie einen Milliliter der resuspendierten Zellen auf die Säule und lassen Sie den Puffer Tropfen für Tropfen durchlaufen.

Nach dem Waschen wird die Säule in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Dann pipettiere ich einen Milliliter Waschpuffer in die Säule. Jetzt setzen Sie den Kolben oben auf die Säule.

Üben Sie vorsichtig Druck aus, um die Zellen zu elutieren. Dann nehmen Sie den Kolben heraus und setzen Sie die Säule auf ein neues Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie der Säule einen weiteren Milliliter Waschpuffer hinzu.

Dann stecken Sie den Kolben erneut ein und üben Sie vorsichtig Druck aus, um die restlichen Zellen zu eluieren. Zentrifugiere beide Mikrozentrifugenröhren bei 800 g für drei Minuten. Lass die Zellpellets aus beiden Röhren in einen Milliliter kaltes PBS aufhängen.

Lass die Zellsuspension auf Eis. Die gereinigten Zellen in einem Etikettierungspuffer aus 1 % fetalem Rinderserum in PBS wieder suspendieren. Übertragen Sie 250 Mikroliter der Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.

Füge die entsprechenden Antikörper gegen Neutrophilenmembranmoleküle dem Röhrchen hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius, geschützt vor Licht. Jetzt pipettiere einen Milliliter PBS auf die Röhre.

Drehen Sie das Rohr in einer Mikrozentrifuge bei 800 g für drei Minuten. Aspiriere das Supernatant heraus. Klopfe auf das Rohr, um das Pellet zu brechen.

Und die Zellen in 0,5 Millilitern 1%-Paraformaldehyd wieder suspendieren. Dann halten Sie die Zellen bei vier Grad Celsius und schützen sie vor Licht, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert werden. Analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie und erfassen 10.000 Ereignisse pro Probe.

Neutrophile mit niedriger Dichte bei gesunden Personen machten etwa 5 % der peripheren mononuklearen Blutzellen aus, während das beschriebene magnetische Isolationsprotokoll bei etwa 98 % Neutrophile mit niedriger Dichte erzielte. Neutrophile exprimieren die Membranmarker CD10, CD11b, CD15, CD62L und CD66b. Magnetisch gereinigte niederdichte Neutrophile exprimierten dieselben Membranmarker wie Neutrophile.

Gereinigte Neutrophile mit niedriger Dichte wiesen einen multilobulären Kern auf und waren in der Größe Neutrophilen ähnlich. Sowohl Neutrophile als auch niedrigdichte Neutrophile erzeugten reaktive Sauerstoffspezies als Reaktion auf PMA-Stimulation, wobei niedrigdichte Neutrophile höhere Werte als Neutrophile erzeugen. Neutrophile mit niedriger Dichte setzten neutrophile extrazelluläre Fallen als Reaktion auf PMA-Stimulation frei, wie die Kolokalisierung der DNA mit Elastase und mit Citrullin zeigt.

Sowohl gereinigte Neutrophile als auch Neutrophile mit niedriger Dichte setzten nach der PMA-Behandlung NETs mit ähnlicher Kinetik und Mengen frei. Unser Protokoll bietet eine schnelle und reproduzierbare Methode, um hochreine und funktionale Neutrophile mit niedriger Dichte zu gewinnen. Wir gehen auf das Fehlen eines standardisierten, zeiteffizienten Protokolls zur Isolierung niedrigdichter Neutrophile aus menschlichem Blut ein.

Dieses Protokoll erfordert keine spezielle Ausbildung für komplexe Instrumente und ist zudem wirtschaftlicher und schneller als FACS.