Schnelle magnetische Mikrobead-Methode zur effizienten Aufreinigung von Neutrophilen niedriger Dichte
11. November 2025
Neutrophile niedriger Dichte (LDN) nehmen bei mehreren Krankheiten signifikant zu. LDN werden in der Regel durch Zellsortierung isoliert. Wir stellen eine praktische Methode vor, um reines und lebensfähiges LDN zu erhalten. Nach der Dichtegradientenzentrifugation von peripherem Blut werden die Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen inkubiert und dann LDN durch magnetische Säulen getrennt.
Wir untersuchen Neutrophile mit niedriger Dichte in peripheren mononuklearen Blutzellen, um deren Funktionen zu charakterisieren und ihre Rolle bei verschiedenen Krankheiten zu definieren. Neutrophile mit niedriger Dichte sind in gesundem Blut selten, nehmen aber bei Krankheiten wie systemischem Lupus erythematodes und Krebs deutlich zu. Zunächst geben Sie 10 Einheiten Heparin pro Milliliter als Antikoagulans in ein 15-Milliliter-konisches Zentrifugenrohr.
Dann fügen Sie zwei Milliliter 6 % T500 in PBS hinzu. Entnehmen Sie 10 Milliliter Blut von einem gesunden erwachsenen Freiwilligen durch Venenpunktion. In ein weiteres frisches 15-Milliliter-Zentrifugenrohr fügen Sie fünf Milliliter Dichtegradientmedium hinzu.
Pipettiere das Plasma vorsichtig aus, ohne die Erythrozyten zu berühren, und schichte es auf das Medium, um zwei separate Phasen zu bilden. Zentrifugiere das Rohr bei 516 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Um PBMCs zu isolieren, aspirieren und entsorgen Sie das Plasma oberhalb des PBMC-Bands, ohne die Zellen zu stören.
Sammeln Sie das mononukleare Zellband zwischen Plasma und Medium auf, wodurch die Ansammlung des Mediums minimiert wird. Gib 20 Milliliter PBS in das Rohr mit PBMCs und zentrifugiere dann mit 400 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie vorsichtig das Überdachungsmittel ab und kratzen Sie das Rohr, um das Pellet zu trennen.
Gib 10 Milliliter kaltes PBS dazu, um die Zellen wieder aufzuheben. Um Neutrophile zu isolieren, kratzen Sie das Rohr ab, um die Zellen nach dem Pipettern des Mediums zu trennen. Dann 10 Milliliter kaltes PBS hinzufügen.
Jetzt werden die Zellen in ein frisches, 50-Milliliter-konisches Zentrifugenrohr und Zentrifuge transportiert. Saugen Sie das Supernatant ab und kratzen Sie den Schlauch erneut. Jetzt pipettiere 10 Milliliter kalte hypotonische Lösung in das Rohr und rühre vorsichtig ein.
Rühren Sie vorsichtig genau eine Minute lang. Fügen Sie schnell 10 Milliliter kalte, hypertone Lösung hinzu, um die Lösung isoton zu machen. Dann zählen Sie die Neutrophile mit einer Neubauer-Kammer und stellen Sie sicher, dass die Reinheit über 95 % liegt. Zentrifugieren Sie die Suspension, um ein Zellpellet zu erhalten.
Anschließend wird das Pellet in kaltem PBS wieder suspendiert. Zentrifugiere die peripheren mononuklearen Blutzellen bei 400 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Supernatanten werden die Zellen in 120 Mikrolitern Kaltwaschpuffer wieder suspendiert.
Dann pipettieren Sie 35 Mikroliter CD66b magnetische Mikroperlen in die Zellsuspension. Brüten Sie die Mischung 30 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius aus. Pipettiere jetzt einen Milliliter Kaltwasserputzer auf den Schlauch.
Zentrifugiere das Rohr bei 400 g für drei Minuten. Kratze den Schlauch, um das Zellpellet nach dem Entfernen des Supernatants zu trennen. Und die Zellen in einem Milliliter Waschpuffer wieder suspendieren.
Setze eine magnetische Trennsäule auf einen Magneten. Gib 0,5 Milliliter Waschpuffer zur Säule, damit sie vollständig durchgehen kann. Übertragen Sie einen Milliliter der resuspendierten Zellen auf die Säule und lassen Sie den Puffer Tropfen für Tropfen durchlaufen.
Nach dem Waschen wird die Säule in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Dann pipettiere ich einen Milliliter Waschpuffer in die Säule. Jetzt setzen Sie den Kolben oben auf die Säule.
Üben Sie vorsichtig Druck aus, um die Zellen zu elutieren. Dann nehmen Sie den Kolben heraus und setzen Sie die Säule auf ein neues Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie der Säule einen weiteren Milliliter Waschpuffer hinzu.
Dann stecken Sie den Kolben erneut ein und üben Sie vorsichtig Druck aus, um die restlichen Zellen zu eluieren. Zentrifugiere beide Mikrozentrifugenröhren bei 800 g für drei Minuten. Lass die Zellpellets aus beiden Röhren in einen Milliliter kaltes PBS aufhängen.
Lass die Zellsuspension auf Eis. Die gereinigten Zellen in einem Etikettierungspuffer aus 1 % fetalem Rinderserum in PBS wieder suspendieren. Übertragen Sie 250 Mikroliter der Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.
Füge die entsprechenden Antikörper gegen Neutrophilenmembranmoleküle dem Röhrchen hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius, geschützt vor Licht. Jetzt pipettiere einen Milliliter PBS auf die Röhre.
Drehen Sie das Rohr in einer Mikrozentrifuge bei 800 g für drei Minuten. Aspiriere das Supernatant heraus. Klopfe auf das Rohr, um das Pellet zu brechen.
Und die Zellen in 0,5 Millilitern 1%-Paraformaldehyd wieder suspendieren. Dann halten Sie die Zellen bei vier Grad Celsius und schützen sie vor Licht, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert werden. Analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie und erfassen 10.000 Ereignisse pro Probe.
Neutrophile mit niedriger Dichte bei gesunden Personen machten etwa 5 % der peripheren mononuklearen Blutzellen aus, während das beschriebene magnetische Isolationsprotokoll bei etwa 98 % Neutrophile mit niedriger Dichte erzielte. Neutrophile exprimieren die Membranmarker CD10, CD11b, CD15, CD62L und CD66b. Magnetisch gereinigte niederdichte Neutrophile exprimierten dieselben Membranmarker wie Neutrophile.
Gereinigte Neutrophile mit niedriger Dichte wiesen einen multilobulären Kern auf und waren in der Größe Neutrophilen ähnlich. Sowohl Neutrophile als auch niedrigdichte Neutrophile erzeugten reaktive Sauerstoffspezies als Reaktion auf PMA-Stimulation, wobei niedrigdichte Neutrophile höhere Werte als Neutrophile erzeugen. Neutrophile mit niedriger Dichte setzten neutrophile extrazelluläre Fallen als Reaktion auf PMA-Stimulation frei, wie die Kolokalisierung der DNA mit Elastase und mit Citrullin zeigt.
Sowohl gereinigte Neutrophile als auch Neutrophile mit niedriger Dichte setzten nach der PMA-Behandlung NETs mit ähnlicher Kinetik und Mengen frei. Unser Protokoll bietet eine schnelle und reproduzierbare Methode, um hochreine und funktionale Neutrophile mit niedriger Dichte zu gewinnen. Wir gehen auf das Fehlen eines standardisierten, zeiteffizienten Protokolls zur Isolierung niedrigdichter Neutrophile aus menschlichem Blut ein.
Dieses Protokoll erfordert keine spezielle Ausbildung für komplexe Instrumente und ist zudem wirtschaftlicher und schneller als FACS.
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Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf neutrophile Granulozyten mit niedriger Dichte (LDN), die in mononukleären Zellen des peripheren Blutes gefunden werden, die bei gesunden Personen selten sind, sich aber bei verschiedenen Krankheiten erheblich erhöhen. Der Artikel präsentiert eine praktische Methode zur Isolierung reiner und lebensfähiger LDN durch Dichtegradientenzentrifugation und magnetische Trenntechniken.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- Neutrophile Granulozyten mit niedriger Dichte sind mit Krankheiten wie systemischem Lupus erythematodes und Krebs verbunden.
- Das Verständnis von LDN kann Einblicke in ihre Rollen bei Krankheitsmechanismen liefern.
- Die Isolierung von LDN ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Funktionen und des therapeutischen Potenzials.
- Aktuelle Methoden zur Isolierung von LDN liefern möglicherweise keine reinen und lebensfähigen Zellen.
Zweck der Studie
- Um die Funktionen neutrophiler Granulozyten mit niedriger Dichte zu charakterisieren.
- Um die Rolle von LDN bei verschiedenen Krankheiten zu definieren.
- Um eine effiziente Methode zur Isolierung von LDN aus peripherem Blut zu präsentieren.
Verwendete Methoden
- Verwendung von Heparin als Antikoagulans bei der Blutentnahme.
- Anwendung von Dextran T500 für die Dichtegradienten-Trennung.
- Inkubation mit magnetischen Mikroperlen für die Zellsortierung.
- Trennung von LDN mittels magnetischer Säulen.
Hauptergebnisse
- Die Methode isoliert erfolgreich reine und lebensfähige neutrophile Granulozyten mit niedriger Dichte.
- LDN können hinsichtlich ihrer funktionellen Rollen bei Krankheiten charakterisiert werden.
- Ein besseres Verständnis von LDN kann zu besseren therapeutischen Strategien führen.
- Die Isolationstechnik kann in verschiedenen Forschungsumgebungen angewendet werden.
Schlussfolgerungen
- Die Isolierung von LDN ist wesentlich für die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheit.
- Die vorgestellte Methode verbessert die Reinheit und Lebensfähigkeit der isolierten Zellen.
- Weitere Forschung an LDN kann zu Fortschritten in der Immunologie und therapeutischen Ansätzen beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of low-density neutrophils (LDN) addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery, enabling robust functional studies of disease-associated neutrophil subpopulations. This rapid magnetic-microbead method delivers high-purity, viable LDN, supporting mechanistic de-risking and target validation in autoimmune, oncology, and infectious disease pipelines. Scalable, reproducible LDN purification enhances predictive confidence for translational biomarker and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LDN-mediated disease mechanisms and immune pathway clarification.
- Supports biological de-risking by isolating functionally intact LDN for hypothesis testing.
- Facilitates target validation by providing pure cell populations for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated LDN samples for quantitative flow cytometry and functional assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through high-purity cell isolation.
- Accelerates screening readiness by reducing isolation time and preserving cell viability.
Translational & Preclinical Research
- Enables disease-relevant functional studies of LDN in autoimmune, cancer, and infection models.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing scalable LDN yields.
- Facilitates omics and biomarker analyses aligned with translational research objectives.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, reproducible LDN isolation for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and immune pathway analysis using purified LDN.
- Screening: Delivers standardized, viable LDN for quantitative flow cytometry and functional readouts.
- Analytics: Supports robust measurement of LDN marker expression and functional outputs such as ROS and NET formation.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease model development by enabling scalable LDN purification.
- Enterprise Reuse: Offers a reproducible, time-efficient protocol adaptable across disease areas and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes LDN isolation, improving reproducibility and scalability for high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and translational biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires basic cell biology expertise and standard laboratory instrumentation.
- Utilizes magnetic separation columns and flow cytometry for validation.
- Enables cross-team standardization due to protocol simplicity and reproducibility.
- Adaptable to various disease models and sample volumes for scalable studies.
- Limited by the need for specific antibodies and magnetic bead reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Neutrophils from Human Blood
2:55
Purification of Low-Density Neutrophils (LDNs) Using Magnetic Microbeads
4:59
Multicolor Flow Cytometry Staining and Analysis of Purified Neutrophils
6:13
Results
7:43
Conclusion
