Intra-Beckenarterie Injection für effiziente und selektive Modellierung von Mikroskopische Knochenmetastasen
26. September 2016
Dieses Manuskript beschreibt das detaillierte Verfahren der intra-iliakalen Arterie (IIA) Injektion, eine Technik, um Krebszellen spezifisch in das Gewebe der hinteren Gliedmaßen, einschließlich Knochen, zu bringen, um experimentelle Knochenmetastasen zu etablieren. Obwohl dieses Protokoll ursprünglich mit Brusttumormodellen etabliert wurde, kann es leicht auf andere Krebsarten ausgeweitet werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, experimentelle Knochenmetastasen zu etablieren, indem Krebszellen durch intra-iliakale Arterieninjektion direkt in das Gewebe der Hintergliedmaßen, einschließlich der Knochen, abgegeben werden. Diese Methode kann uns also helfen, die Schlüsselfragen zur Knochenbesiedlung von Brustkrebs zu beantworten, insbesondere in der frühen Phase dieses Prozesses, wie Brustkrebszellen mit Zellen der Mikroumgebung im Knochen interagieren. Wir haben heute eine Injektion in die Beckenarterie durchgeführt.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie effizient und selektiv ein experimentelles mikroskopisches Knochenmetastasenmodell für verschiedene Krebsarten etablieren kann, ohne lokale Gewebeschäden zu verursachen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es Übung sein kann, eine Injektion zu finden, die eine genaue Injektionsposition für die Beckenarterie am Mikroskop aufweist, um eine Erfolgsquote von mehr als neunzig Prozent zu erreichen. Beginnen Sie damit, den angemessenen Grad der Sedierung durch Kneifen der Zehen einer fünf bis sechs Wochen alten zwanzig Gramm schweren Maus zu bestätigen.
Wischen Sie nach dem Auftragen der Augensalbe die rasierte rechte Leistengegend mehrmals mit nacheinander mit sterilen, mit 70 % Isopropylethanol getränkten Wattestäbchen ab, gefolgt von einem chirurgischen Betadin-Peeling. Decken Sie als Nächstes die gesamte Maus mit einem sterilen Tuch ab. Verwenden Sie dann eine sterile Skalpellklinge aus Kohlenstoffstahl Nummer 10 und einen Griff Nummer drei, um einen ein bis 1,2 Zentimeter großen Hautschnitt zwischen der vierten und fünften Brustwarze im rechten Unterbauch zu machen.
Und bringen Sie das Tier unter ein Standard-Dissektionsmikroskop. Beim 4X-Objektiv führen Sie eine stumpfe Trennzange in den Schnitt zwischen Fettgewebe und Bauchfell ein und schieben Sie das Gewebe auf beiden Seiten nach außen, um die Beckengefäße und Nerven freizulegen. Als nächstes durchbrechen Sie mit einer geraden, feinen Pinzette das Bindegewebe zwischen den Gefäßen und dem Nerv, der den Gefäßen am nächsten liegt.
Schieben Sie dann eine abgewinkelte Pinzette durch das Bindegewebe und unter die Beckengefäße, während Sie die gerade Pinzette in das Bindegewebe auf der anderen Seite der Gefäße einführen, um die abgewinkelte Pinzette durch das Gewebe zu führen. Wir empfehlen, für diesen Schritt den Beckenrand und die Arterie als Bündel zu trennen und anzuheben. Obwohl die Tumorzellen nur in die Arterie injiziert werden, spart es Zeit und Mühe, beide Gefäße zusammen zu isolieren.
Sobald die abgewinkelte Pinzette an Ort und Stelle ist, trennen Sie die Beckenvene und die Arterie weiter vom umgebenden Gewebe und halten Sie die Gefäße während der Dissektion auf der abgewinkelten Pinzette. Wenn die Gefäße frei sind, führen Sie mit der geraden Pinzette die Spitze einer 4-0-Seidennaht an die abgewinkelte Pinzette ab und ziehen Sie die Naht langsam und sanft unter die Gefäße. Sowohl die Vena iliaca communis als auch die Arteriengefäße sollten dann durch die Naht gehalten werden.
Wenn die Gefäße fertig sind, pipettieren Sie die Tumorzellen mehrmals auf und ab, um sie wieder in eine Einzelzelllösung zu suspendieren und eventuelle Klumpen aufzubrechen. Aspirieren Sie dann 100 Mikroliter Zellen pro Maus in eine 31-Gauge-Insulinspritze. Schieben Sie nun die abgewinkelte Pinzette mit der Naht als Führung wieder unter die Gefäße und öffnen Sie die Pinzette, so dass die Gefäße sanft auf den Spitzen aufliegen.
Führen Sie mit der anderen Hand die Nadelspitze mit der schrägen Seite nach oben in das Lumen des Arterienabschnitts zwischen den Pinzettenspitzen ein. Drücken Sie den Kolben langsam nieder, um die Zellen zu injizieren. Die Zellsuspension spült das Blut durch das Gefäß.
Wenn alle Zellen abgegeben wurden, entfernen Sie vorsichtig die Nadel und halten Sie die Gefäße auf der Pinzette angehoben, um Blutungen zu vermeiden. Ziehe dann die Naht weg. Entfernen Sie zum Schluss schnell die Pinzette und drücken Sie ein Wattestäbchen fünf bis 10 Minuten lang auf den Schnitt, um die Blutung zu stoppen.
Hier ist ein repräsentatives Ganztier-Biolumineszenzbild nach intra-iliakaler Arterieninjektion von fünfmal 10 bis fünften GFP-Luciferin-markierten MCF-7-Brustkrebszellen gezeigt, gefolgt von d-Luciferin-Verabreichung durch retroorbitale Sinusinjektion. Am Tag 14 nach der Injektion wurde ein starkes Biolumineszenzsignal aus dem intrailiakal injizierten Hinterknochen erhalten, nicht jedoch aus dem kontralateralen Kontrollknochen, was die spezifische Lokalisation der injizierten Zellen bestätigte. Die Schnitte einer H&E-Färbung der tumortragenden Knochen zeigten auch eine kompakte, kopfsteinpflasterartige Zellpopulation mit großen Kernen, die auf mikroskopisch kleine metastasierende MCF-7-Läsionen im Knochengewebe 14 Tage nach der Injektion der intrailiakalen Arterie hinweisen.
Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenzfärbung der Knochenschnitte auch eine Vermischung der MCF-7-Zellen mit Osteoblasten und Präosteoblasten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zehn bis fünfzehn Minuten abgeschlossen werden. Wenn Sie diese Verfahren befolgen, können Sie andere Methoden verwenden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.
Zum Beispiel können wir RNA-Seq verwenden, um die Zellen der Mikroumgebung in der Metastasennische zu profilieren und sie mit normalen Zellen zu vergleichen. Diese Technik bietet Brustkrebsforschern und Prostatakrebsforschern eine Möglichkeit, Knochenmikrometastasen bei Tieren zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Brustkrebs-Knochenmetastasenmodell durch Injektion der intrailiakalen Arterie etablieren können.
Bitte treffen Sie entsprechende Vorsichtsmaßnahmen, da die Arbeit mit Ketamin und Xylazin äußerst gefährlich sein kann.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Manuskript beschreibt die intra-iliacale Arterie (IIA) Injektionstechnik zur Verabreichung von Krebszellen an Gewebe des Hinterbeins, einschließlich Knochen, um experimentelle Knochenmetastasen zu etablieren. Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung der Interaktionen von Brustkrebszellen mit der Knochenmikroumgebung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Experimentelle Techniken
Hintergrund
- Knochenmetastasen sind eine häufige Komplikation bei Krebspatienten.
- Das Verständnis der Mechanismen der Krebszellkolonisierung im Knochen ist entscheidend für die Entwicklung von Therapien.
- Die intra-iliacale Arterie Injektionsmethode ermöglicht eine gezielte Verabreichung von Krebszellen.
- Diese Technik minimiert lokale Gewebeschäden im Vergleich zu anderen Methoden.
Zweck der Studie
- Ein Modell zur Untersuchung von Knochenmetastasen zu etablieren.
- Die Interaktionen zwischen Brustkrebszellen und Knochenmikroumgebungszellen zu untersuchen.
- Die Genauigkeit und Erfolgsrate der Injektionstechnik zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Intra-iliacale Arterie Injektion von Krebszellen.
- Verwendung eines fünf bis sechs Wochen alten Mausmodells.
- Überwachung der Sedierungsniveaus durch Zehenkniffen.
- Üben von Injektionstechniken, um hohe Erfolgsraten zu erreichen.
Hauptergebnisse
- Die Technik ermöglicht eine effiziente Etablierung von Knochenmetastasenmodellen.
- Hohe Erfolgsraten können mit Übung erreicht werden.
- Minimale lokale Gewebeschäden werden mit dieser Methode beobachtet.
- Einblicke in die frühen Phasen der Brustkrebszellkolonisierung werden gewonnen.
Schlussfolgerungen
- Die intra-iliacale Arterie Injektion ist ein wertvolles Werkzeug für die Krebsforschung.
- Diese Methode kann für verschiedene Krebsarten jenseits von Brustkrebs angepasst werden.
- Weitere Studien können das Verständnis der Krebs-Knochen-Interaktionen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Establishing reliable models of early-stage bone metastasis remains a critical challenge in oncology drug discovery, particularly for evaluating therapeutic interventions targeting micrometastatic colonization. The intra-iliac artery injection technique enables spatiotemporally synchronized dissemination of cancer cells to hind-limb bones, supporting robust quantification of disseminated tumor cells and reducing confounding inflammatory responses from procedural tissue damage. This approach enhances predictive confidence in preclinical studies by allowing continuous monitoring of indolent bone lesions without systemic organ metastasis, thereby improving the translational relevance of bone metastasis models for target validation and lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling early cancer cell interactions with bone microenvironment components such as osteoblasts and preosteoblasts.
- Operational Value: Provides a selective and efficient route for delivering cancer cells to hind-limb bones, facilitating consistent model generation across experimental cohorts.
- Strategic Value: Supports mechanistic de-risking of bone metastasis pathways by allowing visualization of micrometastatic progression from single cells to multicellular lesions via bioluminescent and histological readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable outputs such as bioluminescent signal intensity and histological lesion density, enabling standardized assessment of metastatic burden.
- Operational Value: Avoids local tissue damage and associated wound-healing confounders, improving assay reproducibility and reducing variability in downstream analyses.
- Strategic Value: Produces disease-relevant systems with minimal off-target organ metastasis, allowing prolonged observation windows for dose-response and timing studies in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by capturing the progression from disseminated tumor cells to micrometastases in bone, a key clinical bottleneck.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting longitudinal imaging and endpoint analyses such as H&E and immunofluorescence staining.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing early efficacy signals on compounds that disrupt cancer-stromal co-mingling or niche formation in the bone microenvironment.
Pipeline & Workflow Integration
The intra-iliac artery injection method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for bone-directed therapeutics where early metastasis modeling informs mechanistic understanding and therapeutic windows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cancer cell-bone microenvironment interactions by enabling controlled delivery of tumor cells to skeletal sites.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with quantitative bioluminescent and histopathological readouts suitable for high-content screening platforms.
- Analytics: Generates measurable dependent variables including photon flux from bioluminescence, lesion area in histological sections, and co-localization indices of tumor and stromal cells.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling the avascular micrometastatic phase, which precedes osteolytic or osteoblastic progression in clinical bone metastasis.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized surgical technique adaptable across cancer types and laboratories, promoting cross-project consistency in bone metastasis model generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from procedural inflammation and enabling clear attribution of phenotypic changes to drug mechanisms.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined anatomical landmarks and suture-guided vessel isolation, minimizing operator-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early, organ-specific metastasis readouts that reduce late-stage failure due to unanticipated bone tropism.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of bone-targeted candidates by enabling direct comparison of metastatic burden across treatment arms in syngeneic or xenograft models.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microsurgical techniques including vessel isolation and suture ligation under dissection microscopy.
- Dependent on access to sterile dissection microscopes, fine forceps, insulin syringes, and isotonic cell suspension preparation equipment.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia protocols (e.g., ketamine/xylazine) and post-operative monitoring to ensure animal welfare and model consistency.
- Adaptation considerations include adjusting injection volume and cell concentration based on cancer cell line aggressiveness and murine strain variability.
- Practical limitations include a learning curve for achieving >90% injection success rate and the need for aseptic technique to prevent peritoneal contamination during groin incision.
