Intra-Beckenarterie Injection für effiziente und selektive Modellierung von Mikroskopische Knochenmetastasen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, experimentelle Knochenmetastasen zu etablieren, indem Krebszellen durch intra-iliakale Arterieninjektion direkt in das Gewebe der Hintergliedmaßen, einschließlich der Knochen, abgegeben werden. Diese Methode kann uns also helfen, die Schlüsselfragen zur Knochenbesiedlung von Brustkrebs zu beantworten, insbesondere in der frühen Phase dieses Prozesses, wie Brustkrebszellen mit Zellen der Mikroumgebung im Knochen interagieren. Wir haben heute eine Injektion in die Beckenarterie durchgeführt.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie effizient und selektiv ein experimentelles mikroskopisches Knochenmetastasenmodell für verschiedene Krebsarten etablieren kann, ohne lokale Gewebeschäden zu verursachen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es Übung sein kann, eine Injektion zu finden, die eine genaue Injektionsposition für die Beckenarterie am Mikroskop aufweist, um eine Erfolgsquote von mehr als neunzig Prozent zu erreichen. Beginnen Sie damit, den angemessenen Grad der Sedierung durch Kneifen der Zehen einer fünf bis sechs Wochen alten zwanzig Gramm schweren Maus zu bestätigen.

Wischen Sie nach dem Auftragen der Augensalbe die rasierte rechte Leistengegend mehrmals mit nacheinander mit sterilen, mit 70 % Isopropylethanol getränkten Wattestäbchen ab, gefolgt von einem chirurgischen Betadin-Peeling. Decken Sie als Nächstes die gesamte Maus mit einem sterilen Tuch ab. Verwenden Sie dann eine sterile Skalpellklinge aus Kohlenstoffstahl Nummer 10 und einen Griff Nummer drei, um einen ein bis 1,2 Zentimeter großen Hautschnitt zwischen der vierten und fünften Brustwarze im rechten Unterbauch zu machen.

Und bringen Sie das Tier unter ein Standard-Dissektionsmikroskop. Beim 4X-Objektiv führen Sie eine stumpfe Trennzange in den Schnitt zwischen Fettgewebe und Bauchfell ein und schieben Sie das Gewebe auf beiden Seiten nach außen, um die Beckengefäße und Nerven freizulegen. Als nächstes durchbrechen Sie mit einer geraden, feinen Pinzette das Bindegewebe zwischen den Gefäßen und dem Nerv, der den Gefäßen am nächsten liegt.

Schieben Sie dann eine abgewinkelte Pinzette durch das Bindegewebe und unter die Beckengefäße, während Sie die gerade Pinzette in das Bindegewebe auf der anderen Seite der Gefäße einführen, um die abgewinkelte Pinzette durch das Gewebe zu führen. Wir empfehlen, für diesen Schritt den Beckenrand und die Arterie als Bündel zu trennen und anzuheben. Obwohl die Tumorzellen nur in die Arterie injiziert werden, spart es Zeit und Mühe, beide Gefäße zusammen zu isolieren.

Sobald die abgewinkelte Pinzette an Ort und Stelle ist, trennen Sie die Beckenvene und die Arterie weiter vom umgebenden Gewebe und halten Sie die Gefäße während der Dissektion auf der abgewinkelten Pinzette. Wenn die Gefäße frei sind, führen Sie mit der geraden Pinzette die Spitze einer 4-0-Seidennaht an die abgewinkelte Pinzette ab und ziehen Sie die Naht langsam und sanft unter die Gefäße. Sowohl die Vena iliaca communis als auch die Arteriengefäße sollten dann durch die Naht gehalten werden.

Wenn die Gefäße fertig sind, pipettieren Sie die Tumorzellen mehrmals auf und ab, um sie wieder in eine Einzelzelllösung zu suspendieren und eventuelle Klumpen aufzubrechen. Aspirieren Sie dann 100 Mikroliter Zellen pro Maus in eine 31-Gauge-Insulinspritze. Schieben Sie nun die abgewinkelte Pinzette mit der Naht als Führung wieder unter die Gefäße und öffnen Sie die Pinzette, so dass die Gefäße sanft auf den Spitzen aufliegen.

Führen Sie mit der anderen Hand die Nadelspitze mit der schrägen Seite nach oben in das Lumen des Arterienabschnitts zwischen den Pinzettenspitzen ein. Drücken Sie den Kolben langsam nieder, um die Zellen zu injizieren. Die Zellsuspension spült das Blut durch das Gefäß.

Wenn alle Zellen abgegeben wurden, entfernen Sie vorsichtig die Nadel und halten Sie die Gefäße auf der Pinzette angehoben, um Blutungen zu vermeiden. Ziehe dann die Naht weg. Entfernen Sie zum Schluss schnell die Pinzette und drücken Sie ein Wattestäbchen fünf bis 10 Minuten lang auf den Schnitt, um die Blutung zu stoppen.

Hier ist ein repräsentatives Ganztier-Biolumineszenzbild nach intra-iliakaler Arterieninjektion von fünfmal 10 bis fünften GFP-Luciferin-markierten MCF-7-Brustkrebszellen gezeigt, gefolgt von d-Luciferin-Verabreichung durch retroorbitale Sinusinjektion. Am Tag 14 nach der Injektion wurde ein starkes Biolumineszenzsignal aus dem intrailiakal injizierten Hinterknochen erhalten, nicht jedoch aus dem kontralateralen Kontrollknochen, was die spezifische Lokalisation der injizierten Zellen bestätigte. Die Schnitte einer H&E-Färbung der tumortragenden Knochen zeigten auch eine kompakte, kopfsteinpflasterartige Zellpopulation mit großen Kernen, die auf mikroskopisch kleine metastasierende MCF-7-Läsionen im Knochengewebe 14 Tage nach der Injektion der intrailiakalen Arterie hinweisen.

Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenzfärbung der Knochenschnitte auch eine Vermischung der MCF-7-Zellen mit Osteoblasten und Präosteoblasten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zehn bis fünfzehn Minuten abgeschlossen werden. Wenn Sie diese Verfahren befolgen, können Sie andere Methoden verwenden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Zum Beispiel können wir RNA-Seq verwenden, um die Zellen der Mikroumgebung in der Metastasennische zu profilieren und sie mit normalen Zellen zu vergleichen. Diese Technik bietet Brustkrebsforschern und Prostatakrebsforschern eine Möglichkeit, Knochenmikrometastasen bei Tieren zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Brustkrebs-Knochenmetastasenmodell durch Injektion der intrailiakalen Arterie etablieren können.

Bitte treffen Sie entsprechende Vorsichtsmaßnahmen, da die Arbeit mit Ketamin und Xylazin äußerst gefährlich sein kann.