Entwicklung und Charakterisierung von

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung, die es ermöglicht, endotheliale Zellen unter physiologisch relevantem Scherfluss wachsen zu lassen, und die es erlaubt, agonisteninduzierte Veränderungen in ihrer Kalzium- und Stickstoffmonoxidproduktion zu messen. Diese Methode kann die Zukunft der Mikrogefäßforschung voranbringen, indem sie das in-vitro-Mikrogefäßmodell validiert und die Lücken zwischen in-vivo- und in-vitro-Studien schließt. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen in der vielseitigen Gestaltung der Mikrokanäle, die verschiedene Gefäßstrukturen nachahmen, sowie in der Verbesserung des Zellkulturumfelds, das dem in-vivo-Zustand näher kommt als die herkömmliche statische Kultur der ursprünglichen Kulturen.

Die Verfahren werden Sulei und Xiang, zwei Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstrieren. Vor Beginn sollten mithilfe der Standard-Photolithographie eine Masterform hergestellt und mittels weicher Lithographie die PDMS-Mikrokanalgeräte wie im textlichen Protokoll beschrieben gefertigt werden. Um die Mikrokanalgeräte vorzubereiten, decken Sie zunächst den Einlass und den Auslass mit einem dünnen Stück PDMS ab und stellen das Gerät in eine Petrischale mit einem feuchten Tuch.

Anschließend die Schale mit Parafilm abdecken und das Gerät unter UV-Licht mindestens drei Stunden lang sterilisieren. Der nächste Schritt ist die Applikation von Fibronectin. Zuerst einen Tropfen von 30 bis 50 Mikrolitern PBS am Eingang anbringen.

Erzeugen Sie ein Vakuum am Auslass, um das Gerät zu spülen. Anschließend geben Sie einen Tropfen Fibronectin mit einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter am Eingang auf. Erzeugen Sie ein Vakuum am Auslass, um die Fibronectin-Lösung einzusaugen.

Danach die Einlass- und Auslassöffnungen abdecken. Die Schale erneut mit Parafilm umwickeln und das Gerät über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag das Gerät manuell dreimal mit PBS spülen.

Danach das Gerät mit 30 bis 50 Mikrolitern Zellkulturmedium beladen und mindestens 15 Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius erwärmen. Beginnen Sie damit, HUVECs in HUVEC-Kulturmedium mit acht Prozent Dextran bei zwei bis vier Millionen Zellen pro Milliliter zu mischen. Dextran ist erforderlich, um die Viskosität zu erhöhen und dadurch die Zellansaat zu verbessern.

Als Nächstes 10 bis 20 Mikroliter Zellen auf den Eingang geben und sie durch Schwerkraft oder durch Kapillarwirkung mit einer Glas-Pasteur-Pipette am Ausgang einführen. Danach das Gerät 15 bis 20 Minuten lang inkubieren. Anschließend den Besiedlungsstatus unter dem Mikroskop überprüfen.

Falls erforderlich, laden Sie weitere Zellen, um eine gewünschte Zelldichte zu erreichen. Sobald genügend Zellen geladen sind, spülen Sie das Gerät vorsichtig mit normalem, warmem Zellkulturmedium aus, um das Dextran zu entfernen. Kultivieren Sie anschließend das Gerät sechs Stunden lang ohne Mediumperfusion.

Als Nächstes richten Sie die Schlauchverbindungen für die Langzeitperfusion ein. Befestigen Sie das Gerät mit Klebeband an einer Petrischale und verbinden Sie anschließend den Zulaufschlauch mit einer Spritze, die eine Nadel enthält. Führen Sie Schläuche sowohl in den Zulauf als auch in den Ablauf des Geräts ein.

Verbinden Sie das Auslassrohr mit einem Abfallbehälter. Stellen Sie nun die Schale und den Abfallbehälter in einen Inkubator. Verbinden Sie die Spritze mit einem langen Zulaufrohr mit einer externen Perfusionspumpe, die durch die Inkubatortür verläuft.

Dann stellen Sie die Perfusionsrate gemäß dem experimentellen Design ein. Bei einer gut kontrollierten Perfusion kann die Kultur im Mikrogefäßenetzwerk bis zu zwei Wochen lang aufrechterhalten werden. Daher kann sie auf Langzeitstudien ausgedehnt werden, die das zelluläre und hämodynamische Umfeld unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen nachahmen.

Um die Immunfärbung, beispielsweise die Markierung von VE-Cadherin, zu beginnen, fixieren Sie die Zellen zunächst durch Perfundieren mit zwei Prozent Paraformaldehyd für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach einer Reihe von Perfusionsvorgängen zum Blockieren, Permeabilisieren und Färben mit Antikörpern lagern Sie das Gerät bei vier Grad Celsius, bis die Zellen abgebildet werden. Um die Kalziumkonzentration in den Zellen abzubilden, perfundieren Sie das Gerät 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 10 Milligramm pro Milliliter Albumin in Ringer-Lösung.

Als Nächstes das Gerät mit fünf Mikromolar Fluo-4 AM für 40 Minuten bei 37 Grad Celsius perfundieren. Anschließend das im Lumen gebundene Fluo-4 AM für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius mit Albumin-Ringerlösung ausspülen. Danach das konfokale System zur Abbildung der intrazellulären Calciumkonzentration mit Fluo-4 AM in Betrieb nehmen. Aufnahmen der mit Fluo-4 beladenen Mikrogefäße anfertigen.

Sammeln Sie die Basislinienbilder 10 Minuten lang. Anschließend perfundieren Sie das Gerät kontinuierlich mit 10 Mikromolar ATP und zeichnen Sie die Änderungen der Fluoreszenzintensität 20 Minuten lang auf. Um die Produktion von Stickstoffmonoxid in den Zellen abzubilden, perfundieren Sie das Gerät 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Albumin-Ringer-Lösung.

Anschließend die Zellen etwa 35 bis 40 Minuten lang mit 5 Mikromolar DAF-2 DA bei 37 Grad Celsius perfundieren. Danach das Fluoreszenzbildgebungssystem einrichten, um die ATP-induzierte Stickstoffmonoxidproduktion zu messen. Die Grundlinie fünf Minuten lang aufzeichnen, dann das Gerät mit 10 Mikromolar ATP perfundieren und die Bilder 30 Minuten lang in einminütigen Abständen sammeln.

Bei der Messung des Stickstoffmonoxids in Zellen ist es wichtig zu verstehen, dass der Abstand der Intensitätsprofile eine kumulative Produktion von Stickstoffmonoxid über die Zeit darstellt und keine Stickstoffmonoxidkonzentration. Wählen Sie manuell die interessierenden Bereiche aus den aufgenommenen Bildern auf Ebene einzelner Zellen aus. Jeder interessierende Bereich (ROI) umfasst den Bereich einer einzelnen Zelle, der durch die Fluoreszenzkontur angegeben werden kann.

Quantifizieren Sie die ATP-induzierten Veränderungen im endothelialen Kalzium- und Stickstoffmonoxid-Spiegel. Berechnen Sie die Veränderungen in der Fluoreszenzintensität von Fluo-4 unter Abzug des Gewebe-Hintergrunds. Quantifizieren Sie die Stickstoffmonoxid-Produktionsrate durch die erste differentielle Umwandlung der Fluoreszenzintensität von DAF-2 über die Zeit.

Das Mikrokanalmuster in der Vorrichtung weist ein verzweigtes Netzwerk mit drei Ebenen auf. Eine dreidimensionale numerische Simulation wurde durchgeführt, um die Scherspannungsverteilungen bei einer Durchflussrate von 0,35 Mikrolitern pro Minute zu ermitteln. Endothelzellen wurden wie beschrieben in das Netzwerk eingesät.

Anschließend wurden F-Aktin und Kerne markiert. Ebenso wurde VE-Cadherin angefärbt. Die Ergebnisse ähnelten der VE-Cadherin-Expression in einer intakten Venule.

Anschließend wurden die durch ATP hervorgerufenen Anstiege der intrazellulären Kalziumkonzentration und der Produktion von Stickstoffmonoxid untersucht. Die Kalziumspiegel wurden unter Verwendung von Fluo-4 AM wie im Protokollabschnitt beschrieben analysiert. Die Produktion von Stickstoffmonoxid wurde mit DAF-2 DA überwacht, wie im Protokollabschnitt beschrieben.

Die Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die an einzeln perfundierten intakten Venulen gewonnen wurden. Der Fortschritt war einfach und eng kontrolliert unter biologischen Bedingungen und dynamischen Flüssigkeitsumgebungen, was mit herkömmlichen Mikrofertigkeiten-Techniken nicht möglich gewesen wäre. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Vorrichtung herstellt und Kalzium- sowie Stickstoffmonoxid-Messungen durchführt.

Nachdem diese Technik den Forschern den Weg geebnet hat, nicht nur zugrunde liegende, durch Agonisten induzierte Mechanismen zu untersuchen, sondern auch breitere Anwendungen für die biomedizinische Forschung zu erschließen.