Entwicklung und Charakterisierung von In Vitro Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca ²⁺] _i Und die Produktion von Stickoxid

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung eines mikrofluidischen Geräts, das es Endothelzellen ermöglicht, unter physiologisch relevanter Scherströmung zu wachsen und die durch Agonisten induzierten Veränderungen in ihrer Kalzium- und Stickoxidproduktion zu messen. Diese Botschaft kann dazu beitragen, die Zukunft der Mikrogefäßforschung voranzutreiben, indem sie das In-vitro-Mikrogefäßmodell validiert und die Lücken zwischen In-vivo- und In-vitro-Studien schließt. Die Hauptvorteile dieser Technik sind das vielseitige Design der Mikrokanäle, um verschiedene Gefäße nachzuahmen, und sie verbessern die Zellkulturumgebung, die näher an in vivo ist als die bedingte Statik dieser ursprünglichen Kulturen.

Die Prozeduren werden von Sulei und Xiang, den beiden aus meinem Labor, vorgeführt. Bevor Sie beginnen, verwenden Sie die Standard-Fotolithographie, um eine Masterform zu erstellen, und die weiche Lithographie, um die PDMS-Mikrokanal-Geräte herzustellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Microchannel-Geräte vorzubereiten, decken Sie zunächst den Ein- und Auslass mit einem dünnen Stück PDMS ab und legen Sie das Gerät mit einem feuchten Tuch in eine Petrischale.

Wickeln Sie dann die Schale mit Parafilm ein und sterilisieren Sie das Gerät mindestens drei Stunden lang unter UV-Licht. Der nächste Schritt ist das Auftragen des Fibronektins. Geben Sie zunächst einen Tropfen von 30 bis 50 Mikrolitern PBS an den Einlass.

Erstellen Sie einen Staubsauger am Auslass, um das Gerät zu spülen. Geben Sie anschließend einen Tropfen von 100 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektin auf den Einlass. Am Auslass ein Vakuum erzeugen, um die Fibronektinlösung zu laden.

Decken Sie als Nächstes den Einlass und Auslass ab. Wickeln Sie die Schale erneut mit Parafilm ein und inkubieren Sie das Gerät über Nacht bei vier Grad Celsius. Spülen Sie das Gerät am nächsten Tag dreimal manuell mit PBS aus.

Beladen Sie es dann mit 30 bis 50 Mikrolitern Zellkulturmedien und erwärmen Sie das Gerät in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für mindestens 15 Minuten. Beginnen Sie mit dem Mischen von HUVECs in HUVEC-Nährmedien mit acht Prozent Dextran bei zwei bis vier Millionen Zellen pro Milliliter. Das Dextran wird benötigt, um die Viskosität zu erhöhen und damit die Zellaussaat zu verbessern.

Legen Sie dann 10 bis 20 Mikroliter Zellen über den Einlass und führen Sie sie mit Hilfe der Schwerkraft oder durch Kapillarwirkung mit einer Glaspasteurpipette am Auslass ein. Inkubieren Sie das Gerät anschließend 15 bis 20 Minuten lang. Überprüfen Sie dann den Aussaatstatus unter einem Mikroskop.

Laden Sie bei Bedarf weitere Zellen, um eine gewünschte Zelldichte zu erreichen. Sobald genügend Zellen geladen sind, spülen Sie das Gerät vorsichtig mit normalem, warmem Zellkulturmedium aus, um das Dextran zu entfernen. Kultivieren Sie das Gerät dann sechs Stunden lang ohne Medienperfusion

Richten Sie als Nächstes die Schlauchverbindungen für die Langzeitperfusion ein. Kleben Sie das Gerät auf eine Petrischale und verbinden Sie dann den Einlassschlauch mit einer Nadel mit einer Spritze. Führen Sie den Schlauch sowohl in den Einlass als auch in den Auslass des Geräts ein.

Schließen Sie den Auslassschlauch an einen Abfallsammler an. Stellen Sie nun die Schale und den Abfallbehälter in einen Inkubator. Verbinden Sie die Spritze mit einem langen Einlassschlauch mit einer externen Perfusionspumpe, die durch die Inkubatortür geleitet wird.

Stellen Sie dann die Perfusionsrate gemäß dem Versuchsplan ein. Bei einer gut kontrollierten Perfusion kann die Kultur im Mikrogefäßnetzwerk bis zu zwei Wochen aufrechterhalten werden. Daher kann es auf längerfristige Studien ausgeweitet werden, die die zelluläre und hämodynamische Umgebung auf die verschiedenen physiologischen und pathologischen Zustände nachahmen.

Um mit der Immunfärbung zu beginnen, wie z. B. der VE-Cadherin-Markierung, fixieren Sie die Zellen zunächst, indem Sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit zwei Prozent Paraformaldehyd perfusionieren. Halten Sie das Gerät nach einer Reihe von Perfusionen zum Blockieren, Permeabilisieren und Färben mit Antikörpern bei vier Grad Celsius, bis die Zellen abgebildet sind. Um die Kalziumkonzentration in den Zellen abzubilden, perfundieren Sie das Gerät 15 Minuten lang mit 10 Milligramm pro Milliliter Albumin in Ringer-Lösung bei 37 Grad Celsius.

Als nächstes perfundieren Sie das Gerät 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit fünf mikromolaren Fluo-4 AM. Waschen Sie dann das lumengebundene Fluo-4 AM 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Albumin-Ringern aus. Starten Sie als Nächstes das konfokale System für die interzelluläre Bildgebung auf Kalziumebene mit Fluo-4 AM. Nehmen Sie Bilder der mit Fluo-4 beladenen Mikrogefäße auf.

Erfassen Sie die Baseline-Bilder 10 Minuten lang. Perfundieren Sie das Gerät dann kontinuierlich mit 10 mikromolaren ATP und zeichnen Sie die Änderungen der Fluoreszenzintensität 20 Minuten lang auf. Um die Stickoxidproduktion in den Zellen abzubilden, perfundieren Sie das Gerät 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Albumin-Ringern.

Dann perfusionieren Sie die Zellen mit 5 mikromolaren DAF-2 DA für etwa 35 bis 40 Minuten bei 37 Grad Celsius. Richten Sie als Nächstes das Fluoreszenzbildgebungssystem ein, um die ATP-induzierte Stickstoffmonoxidproduktion zu messen. Nehmen Sie die Grundlinie 5 Minuten lang auf, perfundieren Sie dann das Gerät mit 10 mikromolaren ATP und sammeln Sie die Bilder 30 Minuten lang im Abstand von einer Minute.

Für die Messung von Stickstoffmonoxid in der Zelle ist es wichtig zu verstehen, dass der abnehmbare Adapter für das Intensitätsprofil eine kumulative Stickstoffmonoxidproduktion mit der Zeit und keine Stickoxidkonzentration darstellt. Wählen Sie manuell den Interessenbereich aus den gesammelten Bildern auf der Ebene der einzelnen Zellen aus. Jeder ROI deckt den Bereich der Zelle einer Person ab, der durch den floresense-Umriss angezeigt werden kann.

Quantifizieren Sie die ATP-induzierten Veränderungen von endothelialem Calcium und Stickstoffmonoxid. Durch die Berechnung der Veränderungen der Floresense-Intensität von Fluo-4 abzüglich des Gewebehintergrunds. Quantifizieren Sie die Distickstoffmonoxid-Produktionsrate, indem Sie die erste differentielle Umwandlung der Floresense-Intensität von DAF-2 über die Zeit durchführen.

Das Mikrokanalmuster im Gerät verfügt über ein dreistufiges Verzweigungsnetzwerk. Eine numerische 3D-Simulation wurde durchgeführt, um die Schubspannungsverteilungen unter der Durchflussrate von 0,35 Mikrolitern pro Minute abzuschätzen. Endothelzellen setzten sich wie beschrieben in das Netzwerk ein.

Dann wurden F-Aktin und Zellkerne markiert. In ähnlicher Weise wurde auch VE-Cadherin gefärbt. Die Ergebnisse waren ähnlich wie bei der VE-Cadherin-Expression in einem intakten Venole.

Als nächstes wurde die ATP-induzierte Steigerung der intrazellulären Calcium- und Stickoxidproduktion untersucht. Die Kalziumspiegel wurden mit Fluo-4 AM untersucht, wie im Protokollabschnitt beschrieben. Die Stickoxidproduktion wurde mit DAF-2 DA überwacht, wie im Protokollabschnitt beschrieben.

Die Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die mit einzeln perfundierten intakten Venolen erzielt wurden. Das Fortgeschrittene war unter biologischen Bedingungen und in den dynamischen Flüssigkeitsumgebungen leicht und streng zu kontrollieren, was mit herkömmlichen Mikroskill-Techniken nicht möglich gewesen wäre. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Gerät herstellen und Kalzium- und Stickstoffmonoxidmessungen durchführen.

Nachdem diese Technik den Forschern den Weg geebnet hatte, nicht nur die zugrunde liegenden Agonisten-induzierten zu untersuchen, sondern auch breitere Anwendungen für die biomedizinische Forschung zu eröffnen.