Name: Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Erfahren Sie ein nicht-invasives Verfahren zur Induktion bakterieller Pneumonie bei Mäusen durch oropharyngeale Aspiration von K. pneumoniae. Diese technisch einfache Methode ermöglicht die Quantifizierung der pulmonalen angeborenen Immunantwort.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch das Intramural Research Program der National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005) unterstützt.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und der US Public Health Service Politik auf Humane Pflege und Verwendung von Labortieren nach Prüfung durch den Animal Care und Use Committee des NIEHS ausgeführt. 1. Herstellung von K. pneumoniae Kultur Achtung: Führen Sie alle Schritte in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) Haube oder andere BSL2 bezeichneten Bereich und entsorgen Abfall pro Institut BSL2-Richtlinien. <ol><li> Für Suspensionswachstum von K. pneumoniae, tauen ein Glycerolstammlösung von Bakterien und eine Arbeitskultur durch die Übertragung von 1 ml K. impfen pneumoniae Lager zu 50 ml tryptische Sojabrühe (TSB) in einem 500 ml oder größere Kolben. </li><li> Machen Glycerin Aktien durch Zugabe von 900 ul kultivierter log-Phase K. pneumoniae zu 100 ul sterilem Glycerin und Einfrieren bei -20 ° C oder -80 ° C. Für die Langzeitlagerung wird -80 ° C empfohlen. </li><li> Kultur Bakterien aus step 1.1 durch Schütteln über Nacht Kolben (14 bis 18 Stunden) bei 37 ° C bei 200-225 rpm.In um log-Phase das Wachstum zu fördern, verdünnte 1-5 ml dieser Kultur über Nacht in einen Kolben mit 50 ml TSB am Morgen und unter Schütteln ~ 2,5 h bei 37 ° C zurück. </li><li> 1 ml der K. pneumoniae Kultur aus dem letzten Schritt in ein 1,5 - ml - Röhrchen und Schleudern bei 7.500 × g für 2 min. Ein weißes Pellet sollte sichtbar sein. Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören, leicht resuspendieren Bakterien mit Pipette in 1 ml steriler Kochsalzlösung, und Spin wieder bei 7.500 × g für 2 min. <ol><li> Führen Sie diesen Waschschritt 2x, das letzte, gewaschene Pellet in 1 ml steriler Kochsalzlösung gebracht werden. </li></ol></li><li> Führen Sie log-weise serielle Verdünnungen von diesem ordentlichen Inokulum. Fügen Sie zum Beispiel 400 &amp; mgr; l des Inokulums in 3,6 ml steriler Kochsalzlösung in Serie eine 10 -1 -10 -9 Verdünnungsreihe zu machen. </li><li> Bestimmen Sie die OD 600 von gewaschen K. pneumoniae , indem 1 ml der1:10 und 1: 100 Verdünnungen in Einweg - Küvetten und Messen der OD 600 zuerst mit steriler Kochsalzlösung Austastung. Messen Duplikaten Genauigkeit sicherzustellen. Eine OD 600 von 1,0 entspricht etwa 4-7 x 10 8 CFU / ml. Man beachte, dass die Beziehung zwischen OD und CFU / ml nicht linear sein kann. <ol><li> Verwenden Sie die OD 600 aus den Verdünnungen Konzentration von K. zu berechnen pneumoniae, Auftragen der OD: KBE / ml Umwandlung oben und Factoring in der Verdünnung. </li></ol></li><li> Verwenden Sie die K. pneumoniae Konzentration des gewünschten Inokulum CFU Dosis in einem &lt;100 &amp; mgr; l Volumen für die Lieferung an Mäuse (siehe unten) vorzubereiten. </li><li> Platte auch 100 &amp; mgr; l von 10 -6 bis 10 -9 - Verdünnungen und 100 &amp; mgr; l steriler Kochsalzlösung auf einzelne tryptischen Soja - Agar (TSA) Platten bei RT. über Nacht bei 37 ° C inkubieren und Bakterienkolonien, um aufzuzählen, um genaue Konzentration berechnen, die in Experiment verwendet wurde, und für die Kontamination zu kontrollieren. HINWEIS: Die tatsächliche Bakterienkonzentration von endgültige Inokulum kann ± 500 KBE / ml, die durch Absorption vorhergesagt. Experimentatoren sollte idealerweise die OD 600 bestätigen: KBE / ml Beziehung in Pilotstudien vor in vivo bei Mäusen zu verwenden, empirisch die 600 OD Nachstellen: KBE / ml Umsatz bezogen auf ihre persönlichen Erfahrungen. </li></ol> 2. Murine Intratracheale (es) Aspiration von K. pneumoniae aus Oropharynx <ol><li> Stellen Sie sicher, dass Mäuse sind eindeutig durch Schwanz Zeichen, Tätowierung oder einem anderen zugelassenen Kennung identifiziert. </li><li> Zeichnen Sie up Dosierung Inokulum von Bakterien P200 Pipette vor der Mäuse von Isofluran, um das Entfernen Verfahren zu beschleunigen. Für die besten Ergebnisse mit ihr Bestreben, mit einem Volumen von &lt;100 &amp; mgr; l Überlauf zu verhindern. Hierbei verwenden 2000 CFU / 50 &amp; mgr; l von K. pneumoniae. </li><li> Anesthetize Mäuse in einer klaren Kammer mit Isofluran - Gas (zB 2% Isofluran bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 l / min) oder per institutional Richtlinien. Die Anzahl der Mäuse, zusammen zu anästhesieren durch Komfortniveau des Experimentators bestimmt, typischerweise 1-2 zu einem Zeitpunkt. Beachten Sie die Atmung und bestätigen Niveau der Anästhesie einmal tief Luft sichtbar und 2-3 Sekunden kann zwischen den Atemzügen gezählt werden. HINWEIS: Wenn es Bedenken über mögliche verwirrende Effekte flüchtiger (inhalativen) Anästhetika, kann Anästhesie statt mit intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin erreicht werden. Mit dem oben beschriebenen Verfahren, tiefe Narkose dauert nur wenige Minuten. Wenn mehr verlängerte Anästhesie induziert wird, Augensalbe sollte Augen Austrocknung zu verhindern, verwendet werden. </li><li> Sobald die Maus betäubt, positionieren Sie es in einer semirecumbent Rückenlage, durch die oberen Schneidezähne aus einem Gummiband aufgehängt gestreckt zwischen Zapfen auf einer schrägen Plexiglasplatte (Abbildung 1). </li><li> Ziehen Sie vorsichtig mit der Maus Zunge an der Seite mit einem Paar von stumpfen nicht geriffelten Pinzette und Ablagerung Dosis in die Mundhöhle mit einem P200 pipette. Seien Sie vorsichtig zu vermeiden Trauma induzieren entweder auf die Zunge oder Mund-Rachenraum. </li><li> Während die Zunge zurückgezogen zu halten, sanft die Nase mit einem behandschuhten Finger verschließen, bis die Maus inhaliert. Weiterhin die Nase zu bedecken, bis die Maus genommen hat zwei oder mehrere Inhalationen, und keine Flüssigkeit in die Mundhöhle sichtbar. die Nase Abdeckung hilft sicherzustellen, dass die Maus, um die Bakterien in die Lunge inhaliert wird, als Mäuse Nasenatmer sind. </li><li> Entfernen Sie die Maus aus der Inokulation Platte und zurück in seinen Käfig, platzieren Sie die Maus auf dem Rücken Betten oder Schmutz zu verhindern, dass die nares blockiert, während die Maus aus der Narkose erholt. </li><li> Sobald alle Mäuse wurden dosiert und wurden aus der Narkose aufgewacht, Hausmäuse in einer Kabine / Zimmer nur Mäuse enthalten , die mit K. dosiert wurden pneumoniae. Überwachen Mäuse täglich, Körpergewicht , einschließlich , wenn über 48 Stunden nach der Infektion gehen. </li><li> Verwenden Sie täglich Maische und / oder zusätzliche Wärme, wenn die Mäuse so dass über 48 zu gehen,h. </li></ol> 3. bronchoalveolären Lavage (BALF) Sammlung und Analyse <ol><li> Euthanize Mäuse pro institutionellen Richtlinien. Hier verwenden , um eine tödliche Injektion von 150 mg / kg Natriumpentobarbital oder äquivalente Dosis von kommerziellen Euthanasielösung durch Ausbluten gefolgt, da dies vermeidet mögliche Komplikationen zu den Lungen , die mit CO 2 -Inhalation und zervikale Dislokation. </li><li> Position der Maus auf dem Rücken und zu sterilisieren Maus durch Fell mit 70% Ethanol besonders über die Brust und Nackenbereich Spritzen. </li><li> Machen Sie einen Längsschnitt knapp unterhalb des Brustbeins, dann hält das Brustbein mit einer Pinzette, nick die Membran, so dass die Lunge in die Brusthöhle zu fallen zurück. Schnitt durch den Brustraum auf jeder Seite des Gefßsystems und dann nach oben durch den Hals, Belichten der Trachea. </li><li> Da die Luftröhre durch Längsmuskeln auf beiden Seiten umgeben ist, vorsichtig durch die Mitte durchgeschnitten und das Gewebe an den Seiten schieben, wie esDies vermeidet die umgebende Gefäß Schneiden, das Blut in die Trachea einführen könnte. Wenn das Gefäßsystem eingekerbt ist, reinigen Sie die Umgebung mit Gaze, bevor die Tracheallumen zu zugreifen. </li><li> Verwenden chirurgische Scheren oder eine Nadel nick die Trachea über ¼ der Weg nach unten aus dem Kopf und legen Sie eine Kanüle in eine 1-ml-Spritze mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung vorinstalliert angebracht (PBS) kaudal in die Luftröhre. Bei der Verwendung von Mäusen Alter von 8 Wochen oder Frauen &lt;, reduzieren Sie die lavaging Volumen auf 600-800 ul. </li><li> Schieben Sie das Volumen in die Lunge langsam, so dass alle Lappen aufzublasen und dann das Volumen wieder aus mit der Spritze ziehen, Wiederholung 3x. Wenn PBS wird aus den Nüstern kommt hat die Kanüle nicht weit genug in die Trachea oder Inflation auftritt zu schnell gedrückt worden. Alternativ kann, wenn die Lunge nicht gut aufzublasen, hat sich die Kanüle in zu weit getrieben worden, so leicht zurückziehen. </li><li> Sammeln Sie gepoolten Waschungen in einem 15-ml-Röhrchen auf Eis. </li><li> Drehender Luftraum Lavage bei 1.200 × g für 5 min Überstand in ein 1,5-ml-Röhrchen gesammelt und bei -80 ° C einfrieren. Anschließend verwenden Sie den Überstand (dh BALF) zur Messung von Protein, Zytokine und für verschiedene andere biochemische Assays. Das Pellet repräsentiert Zellen aus der bronchoalveolären Raum. </li><li> Wenn rote Blutkörperchen (RBCs) in dem Zellpellet Grundlage von Farb evident sind, lysieren mit 1 ml Puffer ACK Lyse für 1 min durch Zugabe von 5 ml 1x PBS folgte der Lyse Reaktion zu stoppen, und der Puffer verdünnen. Alle Proben identisch, entweder behandelt oder nicht mit ACK-Lysepuffer. </li><li> Spin-Zellen bei 1200 × g für 5 min, dekantieren Sie den Überstand und die Zellen in 1 ml 1x PBS bringen. </li><li> Vortex und Zählen von Zellen auf einem Hämozytometer zur Zählung der gesamten Luftraum Zellen. </li><li> Basierend auf Dichte der Zellen hinzufügen etwa 80-150 &amp; mgr; l (~ 80 &amp; mgr; l für eine infizierte Maus und ~ 150 für eine naive Maus) zu einer Folie Kammer auf einer Cytospin-Zentrifuge. Spin-Zelles auf Objektträger für die nachfolgende Färbung Zelldifferentialpopulationen zu bestimmen. </li><li> Lassen Sie Zellen über Nacht Dias zum Trocknen auf. Stain Zellen mit Tri-Färbung (zB Hema 3 [siehe Tabelle]) durch die Schlitten 7 mal in Fixativ getaucht, 9 - mal bei der Flecken 1 und 7 Mal bei der Flecken 2 (keine Spülungen zwischen Flecken) und trocknen lassen. Nach Fleck getrocknet ist, Deck Dias und zählen manuell Differentiale durch Mikroskop. Im Allgemeinen sind Neutrophile und Monozyten / Makrophagen leicht durch ihre Größe und Kernmorphologie aus. </li></ol> 4. Bestimmung bakterielle Belastung in Lunge und peripheren Geweben <ol><li> Vor Beginn: Verdünnungsröhrchen mit 900 ul 1x PBS für Lunge und Milz und 90 ul 1x PBS für Blut vorzubereiten. Kennzeichenschilder für Bakterien und stellen bei Raumtemperatur Kultivierung; Daher wird, sobald Gewebe wurde, wird gesammelt Zeit zwischen Homogenisierung und Überzug für das Bakterienwachstum minimiert werden. Hinweis: Aufgrund der heterogenen Deposition von Bakterien in den Lungen, die mit Aspiration auftreten können, wird empfohlen, dass einzelne Mäuse für die Analyse von entweder insgesamt Atemweg Zellularität oder total (bilateral) Lungen bakterielle Belastung verwendet werden. </li><li> Euthanize die Maus gemäß Schritt 3.1 und anschließend Sammeln von Blut aus dem linken Ventrikel in einen heparinisierten Röhre platzieren Gerinnung zu vermeiden. Entfernen Sie alle Lungenlappen und in einem 15 ml-Röhrchen mit 5 ml 1x PBS, gefolgt von der Entfernung der Milz und Platzierung in 2 ml 1x PBS. Die Röhrchen auf Eis. Achten Sie darauf, Instrumente zu reinigen mit Ethanol zwischen einzelnen Gewebe / Maus. </li><li> Homogenisieren des Gewebes auf Eis, vorzugsweise mit Einweg-Homogenisatoren, die zwischen jeder Probe verändert werden kann. Einweg-Homogenisator Tipps können zur Wiederverwendung zwischen den Experimenten autoklaviert werden. </li><li> Sobald Gewebe homogenisiert wurde, führen Reihenverdünnungen und Platte. Plattenproben eines gegebenen Gewebe / Verdünnung in zweifacher Ausfertigung auf einer einzigen Platte TSA durch eine Trennlinie auf der Kunststoff Zeichnung. Plating und dilution Vorschläge finden Sie weiter unten (in allen Fällen wurden 10 ul Probe wird auf Platte verteilt) und werden auf einer 24 Stunden nach der Infektion der Obduktion basiert. Wenn 48-72 hr Analyse von Proben, eine größere Anzahl von Verdünnungen durch erhöhte Bakterienbelastung zu späteren Zeitpunkten kann es erforderlich sein plattiert. <ol><li> For Blood - 1:10 verdünnen um 10 &amp; mgr; l Blut in 90 ul sterilem 1x PBS hinzufügen. Platte ordentlich und 1:10 verdünnten Proben in zweifacher Ausfertigung. Sobald Blut überzogen wurde, spinnen Restblut bei 9.300 × g für 10 min Plasma zur Messung von Zytokinen und Chemokinen zu extrahieren. </li><li> Für Lung - 1:10 verdünnen - 1: 100 durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l der homogenisierten Lunge in 900 ul sterilem 1x PBS seriell. Platte ordentlich Homogenat und alle Verdünnungen in zweifacher Ausfertigung. </li><li> Für Spleen - verdünnen 1: 10-1: 100 durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l der homogenisierten Milz in 900 ul sterilem 1x PBS seriell. Platte ordentlich Homogenat und beide Verdünnungen in zweifacher Ausfertigung. </li></ol></li><li> Lassen Brotaufstrichproben kurz trocknen lassen. </li&gt; <li> Invert TSA-Platten und in einen statischen 37 ° C-Inkubator über Nacht. </li><li> Bestimmen die Anzahl der kolonisierenden Bakterien durch die Bakterienkolonien von beiden Seiten der Platte gemittelt und von jeder Verdünnung. Faktor in den Anfangs Verdünnungen von 5 ml für Lunge und 2 ml für Milz Gesamtgewebe CFUs zu bestimmen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Murine Modelle von bakteriellen Lungenentzündung, die in Partnerschaft mit Gen - Targeting und in - vivo - biologischen und pharmakologischen Interventionen, zur Verfügung gestellt haben kritische Einblicke in die Lungenabwehrreaktion. Große Fortschritte wurden insbesondere in unserem Verständnis der Chemokine und Adhäsionsmoleküle gemacht worden , die 10,11 Rekrutierung von Neutrophilen auf den infizierten Luftraum beherrschen. In - vivo - Modellen an einer Lungenentzündun...

Die ambulant erworbene Pneumonie bleibt die häufigste Todesursache von Infektion in den USA, mit insgesamt nur wenig Veränderung der Sterberaten in den letzten 40 Jahren trotz Verbesserungen bei der Impfung und Antibiotika - Strategien 1,2. Trotz des Mangels an spürbaren Fortschritte bei der öffentlichen Gesundheit Ebene, in den letzten Jahren dramatisch Fortschritte wurden in unserem Verständnis der molekularen und zellulären Pathogenese der Lungenentzündung, mit vielen dieser Schritte nach vorn gemacht möglich durch die Verwendung von Maus-Modellen der Lungeninfektion gemacht. Die genetische Lenkbarkeit der Maus, die Ähnlichkeit des murinen und humanen Immunsystem und die breite Palette von Maus-bezogenen immunologischer Reagenzien, die kommerziell verfügbar sind, haben zusammen rasche Fortschritte des Feldes erleichtert. Mausmodelle von bakterieller Pneumonie in der Literatur beschrieben wurden im allgemeinen auf eine von vier technischen Wege zur Pathogen Inokulation verlassen: i) Aerosolisierung; ii) intranasal Lieferung; iii) peroralen Abgabe; und iv) chirurgische intratracheale Injektion (dh Tracheotomie) 3. Alle Routen der Infektion haben Vor- und Nachteile 3. Insbesondere bezüglich Exposition der oberen Atemwege, Potenzial für eine Beimischung von oronasal Flora, Anforderungen für die allgemeine Anästhesie, Variabilität der an das distale Lunge zuge Inokulum, lobar Verteilung der gelieferten Erregern, technisches Know-how-Anforderungen und Verfahrens Morbidität variieren stark über diese Ansätze. Häufig verwendete peroralen Infektion Techniken umfassen über Kanülierung endotracheal (translaryngeale) entweder einen Ansatz &quot;blind&quot; (nicht sichtbar), oder unter direkter Larynx - Visualisierung 3-5. Beide Methoden, während robust, erfordern erhebliche Ausbildung und auch tragen Risiko von Trauma an der oberen Atemwege. Im vorliegenden Bericht beschreiben wir eine technisch nicht intensiv, nicht-invasive, kostengünstige und schnelle Methode der peroralen Infektion, whiermit Bakterien (Klebsiella pneumoniae in dem gegebenen Beispiel) pipettiert Oropharynx eines betäubten Maus in die Lunge über aspiration geliefert (dh inhalation). Wir und andere haben die Aspirationspneumonie Technik erfolgreich 6-9 verwendet. Dieses vielseitige und leicht Lungen-Delivery - Methode gelernt kann in die Lunge auf die Lieferung von vielen zusätzlichen nicht-ätzende Mittel erweitert werden, einschließlich Zytokine und andere Proteine, pathogen-assoziierte Moleküle (zB Lipopolysaccharide), Zellen (dh adoptiven Transfer), und Toxine (zB Bleomycin). Zusätzlich wichtigen technischen Überlegungen Erörterung beschreiben wir auch ein integriertes, quantitative Ansatz für die nachfolgende Wirtsantwort auf Pneumonie Beurteilung, einschließlich stromabwärts Messung von bakteriellen Clearance (dh koloniebildende Einheit [CFU] Quantifizierung in der Lunge und peripheren Organen) und Leukozyt Akkumulation im Luftraum.

<table><tbody><tr><td>Klebsiella pneumoniae, Serotyp 2</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Tryptische Sojabrühe</td><td>Becton Dickenson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Excel Safelet IV Katheter, 18 G x 1 1/4"</td> <td>Claflin Medical Equipment</td><td>MEDC-031122</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Lösung 1</td><td>Fisher</td><td>23-122-937</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Lösung 2</td><td>Fisher</td><td>23-122-952</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Fixiermittel</td><td>Fisher</td><td>23-122-929</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; Messgerät Tuberkulinspritzen</td><td>Fisher</td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>Lithium-Heparin-Plasmakollektoren</td><td>Fisher</td><td>2675187</td><td></td></tr><tr><td>L-förmige Einweg-Spreader</td><td>Lab Scientific</td><td>DSC</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7,4</td><td>im Haus hergestellt</td><td>n/a</td><td>Destilliertes Wasser (5 l), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5,75 g), KH2PO4 (1 g)&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>ACK Lysepuffer</td><td>im eigenen Haus hergestellt</td><td>n/a</td><td>NH4Cl (4,145 g), KHCO3 (0,5 g), EDTA (18,6 mg), bis zu 500 ml mit destilliertem Wasser und pH-Wert bis 7,4</td></tr></tbody></table>

ein nicht-invasive und in technischer hinsicht nicht intensive verfahren zur induktion und phänotypisierung für experimentelle bakterielle pneumonie bei mäusen

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Obwohl ambulant erworbener Pneumonie ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit bleibt, haben murine Modelle von bakteriellen Pneumonie kürzlich signifikante präklinische Fortschritte in unserem Verständnis der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Pathogenese erleichtert. In - vivo - Maus - Modellen der integrierten Physiologie und Widerstandsfähigkeit des Wirtsabwehrreaktion erfassen in eine Weise , die nicht durch alternative, vereinfachte ex - vivo - Ansätze offenbart. Verschiedene Verfahren wurden in der Literatur für intrapulmonale Inokulation von Bakterien in Mäusen, einschließlich Aerosolisierung, intranasale Verabreichung, perorale endotracheal Kanülierung unter &quot;blind&quot; und visualisiert Bedingungen und transkutane endotracheal Kanülierung beschrieben. Alle Methoden haben relativen Vorteile und Einschränkungen. Hier beschreiben wir im Detail eine nicht-invasive, technisch nicht-intensiven, kostengünstige und schnelle Methode zur intratrachealen Lieferung von Bakterien , die Aspiration (dh Inhalation) von der Maus umfassteines infektiösen Inokulum in den Mund-Rachenraum während unter Vollnarkose pipettiert. Dieses Verfahren kann für die pulmonale Abgabe einer großen Vielzahl von nicht-ätzenden biologischen und chemischen Mitteln verwendet werden, und ist relativ leicht zu erlernen, auch für Labors mit minimaler Erfahrung mit pulmonaler Verfahren. Neben der Aspirationspneumonie Methode beschreiben wir auch die nachfolgende zum Testen in vivo pulmonalen angeborenen Immunantwort der Maus, insbesondere Verfahren zur Quantifizierung von bakteriellen Clearance und die zelluläre Immunantwort des infizierten Atemwegs Schritt- für -Schritt - Verfahren bereitzustellen. Dieses integrierte und einfache Ansatz zu einer Lungenentzündung Beurteilung ermöglicht eine schnelle und robuste Bewertung der Wirkung von genetischen und Umwelt Manipulationen auf Lungen angeborenen Immunität.

C57BL / 6 - Mäuse wurden mit 2000 CFU K. infiziert pneumoniae 43816 (Serotyp 2) über Mund - Rachen - Aufnahme in der Lunge. Bei dieser Dosis Mäuse beginnen in der Regel klinische Symptome 12-24 Stunden nach der Infektion einschließlich Lethargie, gekräuselte Fell und Gewichtsverlust von 5-10% (2A) zu zeigen. Innerhalb von 48-72 Stunden nach der Infektion, viele der Mäuse zeigen Symptome der Krankheit und Morbidität, die typischerweise um durchschnittlic...

Verschiedene Verfahren wurden für die Modellierung von bakterieller Pneumonie bei Mäusen in der Literatur beschrieben. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive, kostengünstige, schnelle Methode zur Lungenentzündung durch Aspiration induzierenden (dh Inhalation) eines bakteriellen Inokulums in den Oropharynx pipettiert. Downstream Methoden zur Beurteilung der Lungen angeborenen Immunantwort sind auch detailliert.

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls besteht darin, ein nichtinvasives und technisch wenig aufwändiges Verfahren zur Induktion einer bakteriellen Pneumonie bei Mäusen sowie die anschließende Quantifizierung der in-vivo-Wirtsabwehrreaktion in der Lunge bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf den Gebieten der Infektionskrankheiten und der Immunologie zu beantworten, insbesondere bezüglich der Gene und molekularen Signalwege, die die Wirtsreaktion auf eine Infektion steuern. Der Hauptvorteil dieses Lungeninfektionsverfahrens liegt in seiner technischen Einfachheit.Was es sogar Laboren mit geringer Erfahrung in pulmonalen Verfahren ermöglicht, die angeborene Immunantwort der Lunge zu untersuchen. In einer Sicherheitsstufe-2-Grundausstattung einen Glycerinbestand von K.pneumoniae auftauen und ein Milliliter der Bakterien in einen 500-Milliliter-Kulturkolben mit 50 Milliliter Tryptic-Soy-Bouillon überführen. Die Suspensionskultur über Nacht bei 37 Grad Celsius und 200 bis 225 U/min inkubieren.Am nächsten Morgen verdünnen Sie ein bis fünf Milliliter der Bakterienkultur in einem neuen Kolben, der 50 Milliliter Tryptic-Soja-Brühe enthält, und inkubieren die Kultur im Schüttler bei 37 Grad Celsius für zusätzliche 2,5 Stunden, um die logarithmische Wachstumsphase zu erreichen. Am Ende der zweiten Inkubation überführen Sie ein Milliliter Bakterien aus der zweiten Kultur in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation. Entfernen Sie das Überstandsvolumen, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie die Bakterien vorsichtig in einem Milliliter steriler Kochsalzlösung für drei separate Waschschritte.Nach der dritten Wäsche die Bakterien in einem weiteren Milliliter steriler Kochsalzlösung resuspendieren und logarithmisch fortlaufende Verdünnungen des Inokulums herstellen. Je ein Milliliter der 1:10- und 1:100-Verdünnung in Einwegküvetten im Duplikat messen, um den OD600 der gewaschenen K.pneumoniae zu bestimmen. Ein OD600 von 1,0 entspricht ungefähr vier- bis siebenmal 10⁸ KBE pro Milliliter.Nach der Berechnung der Konzentration der Bakterien in jeder Verdünnung das gewünschte Inokulum mit der CFU-Dosis in 50 bis 60 Mikrolitern steriler Kochsalzlösung pro acht- bis zwölfwöchigem Empfängertier resuspendieren. Um die Bakterien den Tieren zuzuführen, das dosierte Inokulum in eine P200-Pipettenspitze aufziehen und die anästhesierte Maus in einer halb liegenden Rückenlage positionieren, indem man sie am Oberkiefer-Schneidezahn an einem zwischen den Stiften einer schrägen Plexiglasplatte gespannten Gummiband aufhängt. Mit einem Paar stumpfer, nicht gerippter Pinzette die Zunge vorsichtig zur Seite ziehen und die Dosis in die Mundhöhle des Tieres geben, wobei darauf geachtet werden muss, eine Verletzung der Zunge oder des oropharyngealen Bereichs zu vermeiden.Unter Beibehaltung der zurückgezogenen Zunge sanft die Nase mit einem behandschuhten Finger verschließen, bis die Maus zwei bis drei Mal inhaliert. Wenn keine Flüssigkeit in der Mundhöhle sichtbar ist, die Maus in Rückenlage vom Inokulationsbrett in ihren Käfig verbringen, um eine Verlegung der Nasenöffnungen während der Erholungsphase zu verhindern. Führen Sie einen Längsschnitt direkt unterhalb des Brustbeins durch.Dann heben Sie mit einer Pinzette das Brustbein an, ritzen Sie das Zwerchfell an und lassen Sie die Lunge in die Brusthöhle zurücksinken. Setzen Sie den Schnitt beidseits der Gefäße durch die Brusthöhle und weiter durch den Hals fort. Sobald die Luftröhre sichtbar ist, schneiden Sie vorsichtig mittig durch den Hals und schieben Sie das Gewebe nach beiden Seiten, um die umgebenden Blutgefäße nicht zu beschädigen.Nun die Luftröhre etwa ein Viertel vom Kopf entfernt einritzen und kaudal eine Kanüle, die mit einer auf einen Milliliter PBS vorbefüllten Ein-Milliliter-Spritze verbunden ist, in die Luftröhre einführen. Das Volumen langsam in die Lungen injizieren, wobei sich alle Lappen vollständig aufblasen sollen. Anschließend das Volumen mit der Spritze wieder zurückziehen und die gesammelten Lavagen in einem 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis sammeln.Zum geeigneten experimentellen Endpunkt das Blut aus dem linken Ventrikel sammeln und in ein heparinisiertes Röhrchen überführen, um eine Gerinnung zu vermeiden. Anschließend alle Lungenlappen in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern PBS und die Milz in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit zwei Millilitern PBS gewinnen. Danach die Gewebe mithilfe einzelner, steriler Homogenisatoren je Probe auf Eis zerkleinern und anschließend serielle Verdünnungen der Gewebesuspensionen durchführen.Die Verdünnungen dupliziert auf separaten Seiten einer einzelnen TSA-Platte ausplattieren und die Proben kurz trocknen lassen. Anschließend die Platten umdrehen und die Proben über Nacht in einem statischen Inkubator bei 37 Grad Celsius kultivieren. Am nächsten Morgen die bakteriellen Kolonien von beiden Seiten der Platte und von jeder Verdünnung mitteln. Bei 2000 KBE von K.pneumoniae beginnen Mäuse typischerweise 12 bis 24 Stunden nach der Infektion, klinische Symptome zu zeigen.Innerhalb von 48 bis 72 Stunden zeigen viele Tiere Krankheitssymptome und Morbidität, die typischerweise von einem durchschnittlichen Gewichtsverlust von 20 Prozent begleitet werden. Eine LD50-Dosis ermöglicht jedoch die Detektion sowohl relativ erhöhten als auch verminderten Überlebens innerhalb der Versuchsgruppe und kann für Langzeitstudien bevorzugt werden. Eine Infektion der unteren Atemwege mit K.pneumoniae zeichnet sich durch einen starken Einwanderung von Leukozyten in die Atemwege innerhalb von sechs Stunden nach der Infektion aus, die nach 24 Stunden ihr Maximum erreicht und hauptsächlich aus Neutrophilen besteht.Zytokine sind in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit sowohl 24 als auch 48 Stunden nach der Infektion mit K.pneumoniae nachweisbar und liefern Einblicke in das mikrobielle Milieu der Lunge sowie in deren immunologische Selbstrekrutierung als Reaktion auf eine bakterielle Invasion. Die bakterielle Belastung in der Lunge, im Blut und in der Milz nimmt ebenfalls zwischen 24 und 48 Stunden nach der Infektion dramatisch zu. Sobald die Methode der oropharyngealen Aspiration zur Lungeninfektion beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung pro Maus innerhalb von nur einer bis zwei Minuten durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, kein übermäßiges Aspirationsvolumen zu verwenden. Ein Volumen von 50 bis 60 Mikrolitern eignet sich typischerweise gut für eine acht bis zwölf Wochen alte Maus. Nach diesem Verfahren können verschiedene Methoden an der Lunge und den umliegenden Geweben durchgeführt werden, um die Quantifizierung der Immunantwort bei der Eliminierung von Krankheitserregern zu ermöglichen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man experimentelle bakterielle Pneumonie durch oropharyngeale Pathogenapplikation auslöst und die Pathogenlast bei Mäusen bestimmt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mikroben gefährlich sein kann und dass grundsätzlich Vorsichtsmaßnahmen und Verfahrensweisen der Sicherheitsstufe BSL-2 stets eingehalten werden sollten, während dieser Versuch durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine gleichzeitige Infektion mit Influenza A-Virus ist einer der Faktoren bei der Induktion von invasiven Pneumokokken-Erkrankung bei asymptomatischen...

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

Quelle: Madenspacher, J. H. und Fessler, M. B. Eine nicht-invasive und technisch unintensive Methode zur Induktion und Phänotypisierung experimenteller bakterieller Pneumonie bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert den Prozess zur Quantifizierung der Bakterienlast in der Milz einer infizierten Maus, um die Schwere der Infektion zu beurteilen. Die homogenisierte Milz wird seriell verdünnt und plattiert, um die gesamte bakterielle Belastung zu bestimmen. Die daraus resultierenden...

Bewertung der bakteriellen Belastung in der Mausmilz für Infektionsstudien

Dieses Video zeigt die Etablierung einer Lungeninfektion in einem immunkompetenten Nagetiermodell durch Intubation und Installation von bakteriellen Suspensionen in Lungenlappen. Dieses Modell ermöglicht antibakterielle Wirksamkeitsstudien an immunkompetenten Tieren.

Intrabronchiale Instillation von Streptococcus pneumoniae in immunkompetenten Nagetiermodellen

Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger schwerer ambulant erworbener Pneumonie und für mehr als 2 Millionen Todesfälle weltweit verantwortlich. Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren in Fitness-oder Virulenz beteiligt können in Echtzeit in einer akuten Lungenentzündung oder Bakteriämie Maus-Modell mit Biolumineszenz-Bakterien beobachtet werden.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Die Immunantwort des Wirts auf Pathogen-Infektion ist eine streng reguliert Prozess. Mit Hilfe eines Lipopolysaccharid Lungenexpositionsmodell in Mäusen, ist es möglich, hochauflösende Auswertungen der komplexen Mechanismen der Krankheitsentstehung verbunden durch.

Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

Wir demonstrieren das Verfahren zur intratrachealen Inokulation von Haemophilus influenzae in die unteren Atemwege von Mäusen. Dies ist ein sehr nützliches Werkzeug, um Signalwege zu untersuchen, die die Entzündung der Atemwege in Mausmodellen regulieren.

Intratracheale Verabreichung von<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In Mausmodelle zur Untersuchung Atemwegsentzündung

Eine Methode zur Feststellung von Lungeninfektionen bei immunkompetenten Nagetieren wird beschrieben. Mit Kompetenz kann diese Methode schnell und einfach durchgeführt werden, um eine stabile Infektion mit vielen Isolaten von S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae und A. baumannii zu induzieren.

A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; oder<em&gt; A. baumannii</em

Infektiöse Lungenentzündung gehört zu den häufigsten Infektionen beim Menschen. Eine geeignete in-Vivo -Modell ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der Krankheit und Prüfung der Wirksamkeit neuer Therapeutika. Mit diesem Modell murine oropharyngealen Aspiration Pneumonie kann man die Pathogenese und neue Therapien gegen diese tödliche Infektionen untersuchen.

Murine oropharyngealen Aspiration Modell der Ventilator-assoziierten und nosokomiale Bakterielle Pneumonie

Hier präsentieren wir eine elegante Protokoll für in Vivo Evaluierung der Impfstoff Wirksamkeit und Host Immunantworten. Dieses Protokoll kann für Impfstoff-Modelle, die studieren, virale, bakterielle oder parasitäre Erreger angepasst werden.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Hier stellen wir Methoden zur Verbesserung der sekundären bakteriellen Lungenentzündungsstudien vor, indem wir einen nicht-invasiven Weg der Instillation in die unteren Atemwege bereitstellen, gefolgt von der Genesung von Krankheitserregern und der Transkriptanalyse. Diese Verfahren sind reproduzierbar und können ohne spezielle Ausrüstung wie Kanülen, Führungsdrähte oder Glasfaserkabel durchgeführt werden.

Ein präzises Pathogen-Liefer- und Wiederherstellungssystem für murine Modelle der sekundären bakteriellen Pneumonie

Dieses Manuskript beschreibt die Etablierung eines infektiösen Modells der Lungenentzündung bei Mäusen und die entsprechende Charakterisierung der Verletzungsauflösung sowie Methoden zur Züchtung von Bakterien und zur intratrachealen Instillation. Ein neuartiger Ansatz mit Hilfe der hochdimensionalen Durchflusszytometrie zur Bewertung der Immunlandschaft wird ebenfalls beschrieben.

Experimentelles Modell zur Evaluierung des Abklingens von Lungenentzündungen

Erfahren Sie ein nicht-invasives Verfahren zur Induktion bakterieller Pneumonie bei Mäusen durch oropharyngeale Aspiration von K. pneumoniae. Diese technisch einfache Methode ermöglicht die Quantifizierung der pulmonalen angeborenen Immunantwort.

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen (Video) | JoVE Journal

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

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