Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls besteht darin, ein nichtinvasives und technisch wenig aufwändiges Verfahren zur Induktion einer bakteriellen Pneumonie bei Mäusen sowie die anschließende Quantifizierung der in-vivo-Wirtsabwehrreaktion in der Lunge bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf den Gebieten der Infektionskrankheiten und der Immunologie zu beantworten, insbesondere bezüglich der Gene und molekularen Signalwege, die die Wirtsreaktion auf eine Infektion steuern. Der Hauptvorteil dieses Lungeninfektionsverfahrens liegt in seiner technischen Einfachheit.

Was es sogar Laboren mit geringer Erfahrung in pulmonalen Verfahren ermöglicht, die angeborene Immunantwort der Lunge zu untersuchen. In einer Sicherheitsstufe-2-Grundausstattung einen Glycerinbestand von K.pneumoniae auftauen und ein Milliliter der Bakterien in einen 500-Milliliter-Kulturkolben mit 50 Milliliter Tryptic-Soy-Bouillon überführen. Die Suspensionskultur über Nacht bei 37 Grad Celsius und 200 bis 225 U/min inkubieren.

Am nächsten Morgen verdünnen Sie ein bis fünf Milliliter der Bakterienkultur in einem neuen Kolben, der 50 Milliliter Tryptic-Soja-Brühe enthält, und inkubieren die Kultur im Schüttler bei 37 Grad Celsius für zusätzliche 2,5 Stunden, um die logarithmische Wachstumsphase zu erreichen. Am Ende der zweiten Inkubation überführen Sie ein Milliliter Bakterien aus der zweiten Kultur in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation. Entfernen Sie das Überstandsvolumen, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie die Bakterien vorsichtig in einem Milliliter steriler Kochsalzlösung für drei separate Waschschritte.

Nach der dritten Wäsche die Bakterien in einem weiteren Milliliter steriler Kochsalzlösung resuspendieren und logarithmisch fortlaufende Verdünnungen des Inokulums herstellen. Je ein Milliliter der 1:10- und 1:100-Verdünnung in Einwegküvetten im Duplikat messen, um den OD600 der gewaschenen K.pneumoniae zu bestimmen. Ein OD600 von 1,0 entspricht ungefähr vier- bis siebenmal 10⁸ KBE pro Milliliter.

Nach der Berechnung der Konzentration der Bakterien in jeder Verdünnung das gewünschte Inokulum mit der CFU-Dosis in 50 bis 60 Mikrolitern steriler Kochsalzlösung pro acht- bis zwölfwöchigem Empfängertier resuspendieren. Um die Bakterien den Tieren zuzuführen, das dosierte Inokulum in eine P200-Pipettenspitze aufziehen und die anästhesierte Maus in einer halb liegenden Rückenlage positionieren, indem man sie am Oberkiefer-Schneidezahn an einem zwischen den Stiften einer schrägen Plexiglasplatte gespannten Gummiband aufhängt. Mit einem Paar stumpfer, nicht gerippter Pinzette die Zunge vorsichtig zur Seite ziehen und die Dosis in die Mundhöhle des Tieres geben, wobei darauf geachtet werden muss, eine Verletzung der Zunge oder des oropharyngealen Bereichs zu vermeiden.

Unter Beibehaltung der zurückgezogenen Zunge sanft die Nase mit einem behandschuhten Finger verschließen, bis die Maus zwei bis drei Mal inhaliert. Wenn keine Flüssigkeit in der Mundhöhle sichtbar ist, die Maus in Rückenlage vom Inokulationsbrett in ihren Käfig verbringen, um eine Verlegung der Nasenöffnungen während der Erholungsphase zu verhindern. Führen Sie einen Längsschnitt direkt unterhalb des Brustbeins durch.

Dann heben Sie mit einer Pinzette das Brustbein an, ritzen Sie das Zwerchfell an und lassen Sie die Lunge in die Brusthöhle zurücksinken. Setzen Sie den Schnitt beidseits der Gefäße durch die Brusthöhle und weiter durch den Hals fort. Sobald die Luftröhre sichtbar ist, schneiden Sie vorsichtig mittig durch den Hals und schieben Sie das Gewebe nach beiden Seiten, um die umgebenden Blutgefäße nicht zu beschädigen.

Nun die Luftröhre etwa ein Viertel vom Kopf entfernt einritzen und kaudal eine Kanüle, die mit einer auf einen Milliliter PBS vorbefüllten Ein-Milliliter-Spritze verbunden ist, in die Luftröhre einführen. Das Volumen langsam in die Lungen injizieren, wobei sich alle Lappen vollständig aufblasen sollen. Anschließend das Volumen mit der Spritze wieder zurückziehen und die gesammelten Lavagen in einem 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis sammeln.

Zum geeigneten experimentellen Endpunkt das Blut aus dem linken Ventrikel sammeln und in ein heparinisiertes Röhrchen überführen, um eine Gerinnung zu vermeiden. Anschließend alle Lungenlappen in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern PBS und die Milz in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit zwei Millilitern PBS gewinnen. Danach die Gewebe mithilfe einzelner, steriler Homogenisatoren je Probe auf Eis zerkleinern und anschließend serielle Verdünnungen der Gewebesuspensionen durchführen.

Die Verdünnungen dupliziert auf separaten Seiten einer einzelnen TSA-Platte ausplattieren und die Proben kurz trocknen lassen. Anschließend die Platten umdrehen und die Proben über Nacht in einem statischen Inkubator bei 37 Grad Celsius kultivieren. Am nächsten Morgen die bakteriellen Kolonien von beiden Seiten der Platte und von jeder Verdünnung mitteln. Bei 2000 KBE von K.pneumoniae beginnen Mäuse typischerweise 12 bis 24 Stunden nach der Infektion, klinische Symptome zu zeigen.

Innerhalb von 48 bis 72 Stunden zeigen viele Tiere Krankheitssymptome und Morbidität, die typischerweise von einem durchschnittlichen Gewichtsverlust von 20 Prozent begleitet werden. Eine LD50-Dosis ermöglicht jedoch die Detektion sowohl relativ erhöhten als auch verminderten Überlebens innerhalb der Versuchsgruppe und kann für Langzeitstudien bevorzugt werden. Eine Infektion der unteren Atemwege mit K.pneumoniae zeichnet sich durch einen starken Einwanderung von Leukozyten in die Atemwege innerhalb von sechs Stunden nach der Infektion aus, die nach 24 Stunden ihr Maximum erreicht und hauptsächlich aus Neutrophilen besteht.

Zytokine sind in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit sowohl 24 als auch 48 Stunden nach der Infektion mit K.pneumoniae nachweisbar und liefern Einblicke in das mikrobielle Milieu der Lunge sowie in deren immunologische Selbstrekrutierung als Reaktion auf eine bakterielle Invasion. Die bakterielle Belastung in der Lunge, im Blut und in der Milz nimmt ebenfalls zwischen 24 und 48 Stunden nach der Infektion dramatisch zu. Sobald die Methode der oropharyngealen Aspiration zur Lungeninfektion beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung pro Maus innerhalb von nur einer bis zwei Minuten durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, kein übermäßiges Aspirationsvolumen zu verwenden. Ein Volumen von 50 bis 60 Mikrolitern eignet sich typischerweise gut für eine acht bis zwölf Wochen alte Maus. Nach diesem Verfahren können verschiedene Methoden an der Lunge und den umliegenden Geweben durchgeführt werden, um die Quantifizierung der Immunantwort bei der Eliminierung von Krankheitserregern zu ermöglichen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man experimentelle bakterielle Pneumonie durch oropharyngeale Pathogenapplikation auslöst und die Pathogenlast bei Mäusen bestimmt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mikroben gefährlich sein kann und dass grundsätzlich Vorsichtsmaßnahmen und Verfahrensweisen der Sicherheitsstufe BSL-2 stets eingehalten werden sollten, während dieser Versuch durchgeführt wird.