Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, ein nicht-invasives und technisch nicht intensives Verfahren zur Induktion einer bakteriellen Lungenentzündung bei Mäusen und die anschließende Quantifizierung der in vivo Wirtsabwehrreaktion in der Lunge bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Infektionskrankheiten und Immunologie zu beantworten, über die Gene und molekularen Signalwege, die die Reaktion des Wirts auf eine Infektion steuern. Der Hauptvorteil dieser Lungeninfektionsmethode ist ihre technische Einfachheit.

Dies ermöglicht es auch Laboren mit wenig Erfahrung in pulmonalen Verfahren, die angeborene Immunantwort der Lunge zu untersuchen. In einer Anlage der Biosicherheitsstufe zwei wird ein Glycerinvorrat von K.pneumoniae aufgetaut und ein Milliliter der Bakterien in einen 500-Milliliter-Kulturkolben mit 50 Millilitern tryptischer Sojabrühe überführt. Inkubieren Sie die Suspensionskultur über Nacht bei 37 Grad Celsius und 200 bis 225 U/min.

Am nächsten Morgen werden ein bis fünf Milliliter der Bakterienkultur in einem neuen Kolben mit 50 Millilitern tryptischer Sojabrühe verdünnt und die Kultur im Shaker bei 37 Grad Celsius für weitere 2,5 Stunden inkubiert, um die logarithmische Phase zu erreichen. Am Ende der zweiten Inkubation wird ein Milliliter Bakterien aus der zweiten Kultur zur Zentrifugation in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Entfernen Sie den Überstand, ohne die Palette zu stören, und resuspendieren Sie die Bakterien vorsichtig in einem Milliliter steriler Kochsalzlösung für drei separate Wäschen.

Nach dem dritten Waschen resuspendieren Sie die Bakterien in einem weiteren Milliliter steriler Kochsalzlösung und richten Sie logarithmisch serielle Verdünnungen des Inokulums ein. Messen Sie einen Milliliter der Verdünnungen von eins bis 10 und eins bis 100 in Einwegküvetten, in zweifacher Ausfertigung, um die OD600 der gewaschenen K.pneumoniae zu bestimmen. Ein OD600 von 1,0 entspricht in etwa vier- bis siebenmal 10 bis acht KBE pro Milliliter.

Nach Berechnung der Konzentration der Bakterien in jeder Verdünnung wird die gewünschte Inokulum-KBE-Dosis in 50 bis 60 Mikrolitern steriler Kochsalzlösung pro acht bis 12 Wochen altem Empfängertier resuspendiert. Um die Bakterien an die Tiere zu verabreichen, ziehen Sie das Dosierinokulum in eine P200-Pipettenspitze und bringen Sie die betäubte Maus in eine halbliegende Rückenlage, die an den Schneidezähnen des Oberkiefers an einem Gummiband aufgehängt ist, das zwischen den Stiften einer schrägen Plexiglasplatte gespannt ist. Ziehen Sie mit einer stumpfen, nicht geriffelten Pinzette die Zunge vorsichtig zur Seite und geben Sie die Dosis in die Mundhöhle des Tieres, wobei Sie darauf achten, dass die Zunge oder der Mundrachen nicht traumatisiert wird.

Halten Sie die Zunge zurückgezogen und verschließen Sie die Nase vorsichtig mit einem behandschuhten Finger, bis das Haus zwei- bis dreimal einatmet. Wenn keine Flüssigkeit in der Mundhöhle sichtbar ist, bringen Sie die Maus in Rückenlage vom Impfbrett in ihren Käfig, um eine Verstopfung der Nasenlöcher zu verhindern, während sich die Maus erholt. Machen Sie einen Längsschnitt direkt unter dem Brustbein.

Dann heben Sie das Brustbein mit einer Zange an und schneiden das Zwerchfell ein, so dass die Lunge in die Brusthöhle zurückfallen kann. Setzen Sie den Schnitt durch die Brusthöhle auf beiden Seiten des Gefäßsystems nach oben und durch den Hals fort. Wenn die Luftröhre sichtbar ist, schneiden Sie vorsichtig durch die Mitte des Halses und schieben Sie das Gewebe zur Seite, um die umgebende Gefäßstruktur nicht zu beschädigen.

Schneiden Sie nun die Luftröhre etwa ein Viertel des Weges vom Kopf nach unten ein und führen Sie eine Kanüle, die an einer mit einem Milliliter PBS vorgeladenen Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, kaudal in die Luftröhre ein. Schieben Sie das Volumen langsam in die Lunge, so dass sich alle Lappen aufblähen können. Ziehen Sie dann das Volumen mit der Spritze wieder heraus und sammeln Sie die gesammelten Waschungen in einer 15-Milliliter-Tube auf Eis.

Entnehmen Sie an einem geeigneten experimentellen Endpunkt das Blut aus dem linken Ventrikel und überführen Sie es in ein heparinisiertes Röhrchen, um eine Gerinnung zu vermeiden. Ernten Sie dann alle Lungenlappen in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern PBS und die Milz in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit zwei Millilitern PBS. Als nächstes werden einzelne Einweg-Homogenisatoren pro Probe verwendet, um das Gewebe auf Eis zu mazerieren, gefolgt von einer seriellen Verdünnung der Gewebeschlämme.

Plattieren Sie die Verdünnungen in zweifacher Ausführung auf separaten Seiten einer einzelnen TSA-Platte und lassen Sie die Proben kurz trocknen. Dann drehen Sie die Platten um und kultivieren Sie die Proben über Nacht in einem statischen 37-Grad-Inkubator, wobei Sie die Bakterienkolonien von beiden Seiten der Platte und von jeder Verdünnung am nächsten Morgen mitteln. Bei einer KBE von 2000 von K. pneumoniae beginnen Mäuse in der Regel 12 bis 24 Stunden nach der Infektion, klinische Symptome zu zeigen.

Innerhalb von 48 bis 72 Stunden zeigen viele der Tiere Krankheits- und Morbiditätssymptome, denen typischerweise ein durchschnittlicher Gewichtsverlust von 20 Prozent vorausgeht. Eine LD50-Dosis ermöglicht jedoch den Nachweis sowohl des relativ erhöhten als auch des verringerten Überlebens innerhalb der Versuchsgruppe und kann für längerfristige Studien bevorzugt werden. Die Infektion der unteren Atemwege mit K.pneumoniae ist gekennzeichnet durch einen robusten Einstrom von Leukozyten in die Atemwege innerhalb von sechs Stunden nach der Infektion, der nach 24 Stunden seinen Höhepunkt erreicht und hauptsächlich durch Neutrophile repräsentiert wird.

Zytokine sind sowohl 24 als auch 48 Stunden nach der Infektion mit K. pneumoniae in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit nachweisbar und geben Einblick in die Mikroumgebung der Lunge und ihre Immunselbstrekrutierung als Reaktion auf bakterielle Invasion. Auch die bakterielle Belastung in Lunge, Blut und Milz steigt zwischen 24 und 48 Stunden nach der Infektion dramatisch an. Einmal gemeistert, kann die Methode der oropharyngealen Aspiration der Lungeninfektion in nur ein bis zwei Minuten pro Maus durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, kein übermäßiges Aspirationsvolumen zu verwenden. Ein Volumen von 50 bis 60 Mikrolitern eignet sich in der Regel gut für eine acht bis 12 Wochen alte Maus. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Vielzahl von Methoden an der Lunge und peripheren Geweben durchgeführt werden, um die Quantifizierung der Immunantwort bei der Erregerbeseitigung zu ermöglichen.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine experimentelle bakterielle Lungenentzündung über oropharyngeale Erregereinbringung induziert und die Erregerlast bei Mäusen bestimmt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mikroben gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer grundlegende BSL-2-Vorsichtsmaßnahmen und -Praktiken getroffen werden sollten.