Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, schnell und multiplexartig nach Autoantikörpern zu suchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Autoimmunität zu identifizieren, z. B. welche Autoantikörper mit verschiedenen Krankheitszuständen korrelieren. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass Autoantikörper parallel gescreent werden können, nur Mikroliter Serum und nur Mikrogramm Antigen benötigt werden.

Um Antigen-Microarrays zu erzeugen, beginnen Sie mit der Verdünnung von Antigenen in PBS auf eine Endkonzentration von 2 Milligramm pro Milliliter. Richten Sie eine Micro-Arrayer-Konfiguration mit neun Pins ein, um bis zu 162 einzigartige Antigene in doppelter Ausführung zu drucken. Nehmen Sie IgG- und IgM-Antigene als Positivkontrollen in die Antigenbibliothek auf.

PBS nur als Negativkontrolle einbeziehen. Geben Sie 20 Mikroliter jedes Antigens in Gruppen auf die 384-Well-Quellplatte, die den Aufbau des Druckkopfs widerspiegeln. Verwenden Sie Folie, um die Quellplatte abzudecken, und frieren Sie die Platte bei minus 80 Grad Celsius ein, bis sie zum Drucken von Arrays bereit ist.

Reinigen Sie die festen Microarray-Pins, indem Sie sie dreimal für jeweils eine Minute in einem Beschallungsbad mit deionisiertem Wasser inkubieren. Legen Sie die Stecknadeln zum Trocknen in ein Rack. Ordnen Sie dann die Pins im Microarray-Druckkopf an.

Verwenden Sie für neun Pins eine Drei-mal-Konfiguration. Programmieren Sie als Nächstes den Microarrayer für den Drucklauf, indem Sie die Anzahl der Pins auf dem Druckkopf, die Anzahl der zu druckenden Objektträger, die Anzahl der Tampons auf jedem Objektträger und die Anzahl der Replikationsspots für jedes Antigen einstellen. Programmieren Sie außerdem den Microarrayer so, dass er die Pins in Wasser zwischen verschiedenen Gruppen von Antigenen beschallt.

Nachdem Sie die Quellplatte aufgetaut haben, zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 100 Mal G.Platzieren Sie die Quellplatte an der dafür vorgesehenen Stelle im Microarrayer und entfernen Sie dann den Folienabschnitt, der die erste Gruppe von Antigenen bedeckt, die gedruckt werden sollen. Ordnen Sie die unbedruckten Objektträger auf der Arrayer-Oberfläche an und führen Sie das Druckprogramm aus. Drucken Sie Objektträger bei Raumtemperatur mit einer Luftfeuchtigkeit von 55 bis 60 % am ArrayerNachdem jede Gruppe von Antigenen auf alle Objektträger gedruckt wurde, halten Sie den Microarrayer an.

Decken Sie die Antigene, die gerade gedruckt wurden, mit Folie ab, um eine Verdunstung zu verhindern, und legen Sie die nächste Gruppe von Antigenen frei, die gedruckt werden sollen. Setzen Sie dann das Druckprogramm fort. Nachdem alle Antigene gedruckt wurden, bedecken Sie die Ausgangsplatte mit einem neuen Stück Folie und frieren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius ein.

Legen Sie die gedruckten Objektträger in eine Objektträgerschachtel und vakuumieren Sie sie. Die Folien können am nächsten Tag oder bis zu einem Monat später verwendet werden. Um Microarrays mit verdünnten Seren in Inkubationskammern zu untersuchen, legen Sie die Objektträger in Rahmen.

Fügen Sie dann 700 Mikroliter Blocking-Puffer zu jeder Array-Oberfläche hinzu. Legen Sie die Klebefolie über den Rahmen und geben Sie sie mit einem Stück feuchtem Tuch in ein verschlossenes Gefäß. Dann brüten Sie die Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Wippe aus.

Verdünnen Sie die Serumproben am nächsten Tag eins bis 100 in Blockierungspuffer. Aspirieren Sie dann die Blockierungslösung aus den Arrays und geben Sie 500 Mikroliter verdünnte Probe auf jede Array-Oberfläche. Decken Sie dann die Arrays mit Klebefolie ab und inkubieren Sie sie bei vier Grad Celsius, wobei Sie eine Stunde lang schaukeln.

Saugen Sie dann die Serumproben aus den Arrays ab und spülen Sie die Array-Oberflächen viermal mit Spülpuffer ab, indem Sie den Puffer auf die Objektträger gießen und ihn schnell abschnippen. Verwenden Sie 700 Mikroliter Blockierungspuffer, um jede Array-Oberfläche zu waschen, und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Schaukeln. Geben Sie dann 500 Mikroliter verdünnten Sekundärantikörper auf jede Objektträgeroberfläche und verwenden Sie eine Klebefolie, um sie abzudecken.

Inkubieren Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius und schaukeln Sie sie 45 Minuten lang. Nach der Inkubation aspirieren Sie das sekundäre Antikörpergemisch aus den Objektträgern und spülen viermal, wie gerade gezeigt. Waschen Sie dann die Objektträger dreimal für jeweils 10 Minuten mit 700 Mikrolitern Blocking-Verdünnungspuffer.

Nehmen Sie die Dias aus den Rahmen, legen Sie sie in ein Metallgestell und tauchen Sie sie in PBS. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur unter Orbitalschütteln für 20 Minuten. Legen Sie einen Objektträger für 15 Sekunden in einen Behälter mit entionisiertem Wasser.

Stellen Sie dann das Gestell in einen neuen Behälter mit Wasser und inkubieren Sie es weitere 15 Sekunden lang. Zum Trocknen der Objektträger legen Sie das Objektträgergestell auf einen ELISA-Plattenadapter in der Zentrifuge und drehen Sie es fünf Minuten lang bei 220-facher G-Temperatur und Raumtemperatur. Legen Sie die Objektträger in eine leichte, dichte Schachtel, bis sie zum Scannen bereit sind.

Um die Objektträger zu scannen, verwenden Sie einen Microarray-Scanner, der die Fluoreszenzsignale SI drei und SI fünf erkennen kann. Bestimmen Sie die optimalen Einstellungen für das Multiplikatorröhrchen (PMT), indem Sie einen vollständigen Objektträger der Antigenbibliothek vorab scannen, der nur mit Sekundärantikörpern untersucht wurde. Stellen Sie die durch Drücken der Hardware-Taste verwendeten PMT-Werte so ein, dass die menschlichen IgG-Merkmale auf dem SI-Dreikanal und die menschlichen IGM-Merkmale auf dem SI-Fünfkanal eine ähnliche mediane Fluoreszenzintensität minus Hintergrund (MFIB) aufweisen, die typischerweise 40.000 beträgt.

Scannen Sie anschließend die experimentellen Objektträger auf den beiden Kanälen, indem Sie die Scan-Taste drücken. Speichern Sie die Diabilder nach jedem Scan in beiden Kanälen. Laden Sie mit der Datei-Schaltfläche den zu analysierenden Objektträger in die Microarray-Software.

Verwenden Sie dann die Schaltfläche Datei, um die Gen-Array-Liste oder GAL-Datei mit dem Layout des Arrays und den Identitäten der Array-Funktionen zu laden. Platzieren Sie die Array-Vorlage über dem gescannten Bild, sodass die Array-Features so genau wie möglich mit der Vorlage übereinstimmen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausrichten, um Features in allen Blöcken an der Vorlage auszurichten.

Die Software berechnet dann für jedes der Antigene einen MFI minus Hintergrund. Verwenden Sie abschließend die Schaltfläche Datei, um die Ergebnisse als Textdatei zu exportieren und die Daten gemäß dem Textprotokoll zu analysieren. In dieser Abbildung, die positive und negative Kontrollpräparate zeigt, wird der negative Objektträger nur mit Sekundärantikörpern untersucht, und der positive Kontrollobjektträger wird mit Serum eines Patienten mit systemischem Lupus erythematodes untersucht.

Wie hier angedeutet, zeigt sich, dass das Positivkontrollserum mit bekannter Reaktivität gegenüber riboP IgM-Antikörper gegen einzelsträngige DNA und IgG-Antikörper gegen riboP enthält. Lineare Reaktionen wurden mit IgM über alle Serumverdünnungen und mit IgG bis zu einem MFI minus Hintergrund von etwa 30.000 beobachtet. In diesem Experiment wird das Array mit humanem Serum eines Patienten mit kryoglobulinämischer Vaskulitis und einem dokumentierten Rheumafaktor, einem IgM-Antikörper gegen IgG, untersucht.

Das IgG-Merkmal ist aufgrund der Bindung von IgM im Serum des Patienten an das immobilisierte IgG auf dem Array gelb-grün. Bei alleiniger Verwendung von Sekundärantikörpern wird keine IgM-Reaktivität gegen IgG beobachtet, das auf dem Array entdeckt wird. Hier gezeigt, werden Maus-IgM und IgG, die auf dem Array entdeckt wurden, nur mit Anti-Maus-Sekundärantikörpern gegen IgM bzw. IgG nachgewiesen.

Diese Abbildung zeigt die Ausrichtung eines Vorlagenrasters auf einem gescannten Array-Bild mit Hilfe einer Microarray-Analysesoftware. Nach dem Ausrichten können die Array-Merkmale analysiert werden, um die mediane Fluoreszenzintensität minus den Hintergrund für jedes Merkmal zu erhalten. Einmal gemeistert, kann die Sondierung von Antigen-Microarrays in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken wie ELISA durchgeführt werden, um die Ergebnisse der Antigen-Microarrays zu validieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Antigen-Microarrays druckt, wie man Antigen-Microarrays mit Serum untersucht und wie man Antigen-Microarrays mit einem Scanner scannt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Serum gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens allgemeine Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.