Name: Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Zwei-Farb-Antigen-Mikroarrays für den parallelen Nachweis von IgG- und IgM-Autoantikörpern in humanem und murinem Serum. Diese Hochdurchsatzmethode ermöglicht quantitative Antikörperanalysen mit minimalen Probenmengen.

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A.C. wurde durch ein Postdoktorandenstipendium der Heart and Stroke Foundation of Canada und das Training Program in Regenerative Medicine (Canadian Institutes of Health Research) unterstützt. F.Y.Y.H. wurde durch das Training Program in Regenerative Medicine unterstützt. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von Astellas Pharma Canada finanziert. Wir möchten uns auch bei Dr. Mark Menenghini (University of Toronto) für den Einsatz seines Axon Microarray-Scanners bedanken.

1. Diluting Antigene und Generierung von Antigen-Mikroarrays <ol><li> Verdünnte Antigene in PBS auf eine Endkonzentration von 0,2 mg / ml. Drucken Sie bis zu 162 einzigartige Antigene in zweifacher Ausfertigung mit einer Microarrayers Konfiguration mit 9 Pins. Umfassen IgG- und IgM-Antigene in den Antigen-Bibliothek als positive Kontrollen. Umfassen PBS nur als negative Kontrolle. </li><li> In 20 ul jedes Antigen an die 384-Well-Source-Platte. In Antigene an der Source - Platte in Gruppen, die den Aufbau des Druckkopf spiegeln (zB ordnen Antigene in Gruppen von 9 , wenn 9 Pins für den Druck verwendet werden). </li><li> Abdeckung Source-Platte mit Folie und Einfrieren bei -80 ° C bis bereit Arrays zu drucken. </li><li> Reinigen Sie feste Microarrayers Stifte, indem sie in einem Ultraschallbad mit VE-Wasser für 3 x 1 min inkubiert. Platz Stifte in Rack zu trocknen und dann Stifte in Microarray-Druckkopf anordnen. Für 9-polig, mit einem 3 x 3-Konfiguration. </li><li> Programm Microarrayers für den Druck laufen nach Anzahl Pins auf Druckkopfeinstellung,Anzahl der Folien auf jeder Folie Anzahl der Kissen und die Anzahl der Wiederholungs spots für jedes Antigen zu drucken. Normalerweise verwenden 9-polig, 70 Rutschen, 2 Pads / Rutsche und zwei Wiederholungsspots für jedes Antigen. Programm Microarrayers zu beschallen pins in Wasser zwischen verschiedenen Gruppen von Antigenen. </li><li> Thaw Source-Platte und dann Zentrifuge Platte für 1 min bei 100 x g. Platzieren Sie Quellenplatte in dafür vorgesehenen Stelle in Microarrayers. Entfernen Sie den Abschnitt der Folie, die die erste Gruppe von Antigenen bedeckt gedruckt werden. </li><li> Vereinbaren ungedruckten gleitet auf Arrayers Oberfläche und Laufdruckprogramm. Drucken von Folien bei RT mit Feuchtigkeit setzen auf der Arrayers bei 55-60% mit dem eingebauten Luftbefeuchter der Array-Maschine. </li><li> Nachdem jede Gruppe von Antigenen auf alle Folien gedruckt wird, unterbrechen Sie die Microarrayers. Decken Sie die Antigene, die wurden nur mit Folie gedruckt (zur Verhinderung von Verdunstung) und entdecken die nächste Gruppe von Antigenen gedruckt werden. Weiter Druckprogramm. </li><li> Nachdem alle Antigene gedruckt wurden, decken Quelle plaß mit neuen Stück Folie und Einfrieren bei -80 ° C. Legen Sie gedruckte Folien in Gleitkastens und Vakuumdichtung. Die Objektträger können am nächsten Tag verwendet werden oder bis zu einen Monat später. </li></ol> 2. Probing Antigen-Mikroarrays mit verdünntem Sera <ol><li> Die Objektträger in Rahmen mit Inkubationskammern. Hinzufügen, 700 &amp; mgr; l Blockierungspuffer (2,5% [vol / vol] fötalem Kälberserum (FCS), 0,1% [v / v] Tween 20 in PBS) zu jeder Array-Oberfläche. </li><li> Platzieren Klebefolie über Rahmen und in einem verschlossenen Behälter mit einem Stück feuchten Tuchs. Inkubieren O / N bei 4 ° C auf einer Wippe. </li><li> Verdünnte Serumproben 1: 100 in Blockierungspuffer. Absaugen Blocking-Lösung von Arrays und 500 ul verdünnte Probe zu jedem Array-Oberfläche hinzuzufügen. </li><li> Mit Klebefolie abdecken und Inkubation für 1 Stunde bei 4 ° C mit Schaukeln. </li><li> Verdünnen Sekundärantikörper in Blocking-Puffer. Für Humanstudien, verdünntem eine Cy3 markiertes Ziegen anti-human IgG-Antikörpers auf 0,33 &amp; mgr; g / ml und einem Cy5 markierten Ziege-anti-human IgM-Antikörper 0,25 ug / ml. Für Maus-Studien, verdünntem a Cy3 Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper auf 0,38 &amp; mgr; g / ml und einem Cy5 markierten Ziege-anti-Maus IgM Antikörper auf 0,7 &amp; mgr; g / ml markiert. </li><li> Aspirat Proben von Arrays und Array spülen Oberflächen 4mal mit Spülpuffer (0,1% Tween 20 in PBS). Gieße auf, um Dias Puffer und schnell wegwedeln. </li><li> In 700 l Blocking-Puffer jedes Array-Oberfläche zu waschen und 10 min bei RT inkubieren mit Schaukeln. Wiederholen Waschschritt zwei weitere Male. </li><li> In 500 ul verdünnt sekundären Antikörper zu jeder Gleitfläche und Abdeckung mit Klebefolie. Inkubiere 45 Minuten bei 4 ° C unter Schütteln. </li><li> Absaugen sekundären Antikörper Mischung aus Dias und 4 mal spülen, wie oben. Wasch gleitet 3-mal mit 700 &amp; mgr; l Blockierungs / Verdünnungspuffer wie oben. </li><li> Die Objektträger aus Rahmen und in Metallschlitten-Rack, das in PBS eingetaucht ist. Inkubieren 20 min bei RT mit orbitalen Schütteln. Der Platz im neuen Container von PBS und Inkubation weitere 20 min unter Schütteln. </li><li> Den Objektträger-Rack in Behälter von entsalztem Wasser 15 sec. Legen Sie Rack in einem neuen Behälter mit Wasser und Inkubation weitere 15 sec. </li><li> Um trockene Rutschen, Platz Dia-Rack auf einem ELISA-Plattenadapter in Zentrifuge und Spin bei 220 × g für 5 min bei RT. </li><li> Die Objektträger in lichtdichten Box bis zum Scannen bereit. </li></ol> 3. Scannen Antigen-Mikroarrays und Exportieren von Daten <ol><li> Scannen von Dias einen Microarray-Scanner verwenden, die Cy3 und Cy5 Fluoreszenzsignale erkennen kann. Um die Fotovervielfacherröhre (PMT) Ebenen des Scanners, Pre-Scan eine Folie einzustellen, die nur mit sekundären Antikörpern sondiert wurde. Hinweis: Diese Folie, um das vollständige Antigen-Bibliothek auf sie einschließlich positiv (IgG und IgM) sowie negative (PBS) Kontrollen gedruckt haben sollte. Die Pre-Scan ist eine niedrige Auflösung scannen, die dem Benutzer ermöglicht, schnell die optimale PMT-Einstellungen zu finden. </li><li> Stellen Sie die PMT-Werte, so dass die menschliche IgG-Features (auf dem Cy3-Kanal) und das Brummenein IgM-Features (auf dem Cy5-Kanal) haben eine ähnliche mittlere Fluoreszenzintensität minus Hintergrund (MFI-B) (typischerweise 40.000). Die PMT Ebenen werden durch Drücken der &quot;Hardware&quot; Taste eingestellt. Einmal eingestellt, halten Sie diese PMT-Einstellungen konstant. </li><li> Scannen Sie die experimentellen Dias auf den beiden Kanälen durch die &quot;Scan&quot; -Taste drücken. Speichern Sie die Dia-Bilder (beide Kanäle) nach jedem Scan. </li><li> Legen Sie die Folie werden in der Microarray-Software analysiert, indem die &quot;Datei&quot; Taste. </li><li> Laden Sie die Gen-Array-Liste (GAL) Datei, indem Sie die &quot;Datei&quot; Taste. Die GAL-Datei hat das Layout des Arrays mit den Identitäten der Array-Funktionen. </li><li> Platzieren des Arrays Schablone über dem gescannten Bild so, dass die Arrays Merkmale der Vorlage möglichst genau übereinstimmen. </li><li> Richten Sie Funktionen in allen Blöcken mit der Vorlage durch die &quot;align&quot; Taste drücken. Das Programm wird im allgemeinen die Kontur der Kreis Merkmale finden aber einige manuelle Anpassungen erforderlich sein können,. Diese Einstellungen können durch Eingabe der Feature-Modus vorgenommen werden. Die Software wird dann eine MFI-B für jedes der Antigene berechnen. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Datei&quot;, um diese Ergebnisse als eine Textdatei zu exportieren. </li></ol> 4. Analysieren Array Daten Bedeutung Analyse von Microarrays (SAM) <ol><li> Legen Sie einzelne Textdateien in Excel und identifizieren Sie die Spalten, die MFI-B für die Cy3 und Cy5-Kanälen. </li><li> Berechnen Sie den Durchschnitt der doppelten Funktionen. </li><li> Für jede negative MFI-B, ersetzen die negative Zahl mit 10 Daten-Transformation von rohen MFI-B durch 100 dividiert und dann durch log Basis 2 berechnet wird. </li><li> Analysieren Sie log transformierten Daten mit Bedeutung Analyse von Microarrays (SAM) , wie zuvor 7 beschrieben. </li><li> Für eine Studie mit zwei Gruppen (zB gesunde Kontrollen vs. Patienten), Etikett einer Gruppe &quot;1&quot; und die Gruppe &quot;2.&quot; Verwenden Sie eine Zwei-Klassen, ungepaarten Analyse in SAM auf Antigene zu identifizieren, die Reaktivitäten significantly unterschiedlich zwischen den beiden Gruppen (q-Wert &lt;0,05). </li><li> Verwenden Sie Clustering und Wärme-Kartenerzeugungs Software machen Bilder für die Präsentation 8. </li></ol>

<ol><li>Naparstek, Y., Plotz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in autoimmune disease.</a> Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).</li>
<li>Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+2015%3A+From+diagnostic+biomarkers+toward+prediction%2C+prognosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention.</a> Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).</li>
<li>Robinson, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+microarrays+for+multiplex+characterization+of+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+medicine%22%5BJournal%5D)">Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses.</a> Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).</li>
<li>Quintana, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarrays+identify+unique+serum+autoantibody+signatures+in+clinical+and+pathologic+subtypes+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).</li>
<li>Hueber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarray+profiling+of+autoantibodies+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarray+analysis+reveals+BAFF-binding+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).</li>
<li>Chruscinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Antigen+Microarrays+to+Screen+for+Autoantibodies+in+Heart+Failure+and+Heart+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation.</a> PloS one. 11, e0151224(2016).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+influenza+vaccine+immunogenicity+using+influenza+antigen+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays.</a> PloS one. 8, e64555(2013).</li>
<li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivity+profiles+of+broadly+neutralizing+anti-HIV-1+antibodies+are+distinct+from+those+of+pathogenic+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies.</a> Aids. 25, 1247-1257 (2011).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+humoral+rejection+of+human+kidney+allografts+associates+with+broad+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses.</a> Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).</li>
<li>Haddon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+epitopes+of+U1-70K+autoantibodies+at+single-amino+acid+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution.</a> Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).</li>
<li>Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of immunoglobulins.</a> J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der Autoantikörper, die das Antigen Microarray-Technik verwendet wird. Antigen-Mikroarrays bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA in für Autoantikörper-Screening. Zunächst einmal eine Vielzahl von Antigenen, einschließlich Nukleinsäuren, Proteine, Peptide und Zelllysate können auf die Nitrocellulose beschichtete Objektträger angeordnet werden, so dass für gemultiplexte Screening von Autoantikörpern ermöglicht. Darüber hinaus sind nur Mikrogram...

Autoantikörper sind in vielen Krankheitszuständen vorhanden und können oft eine direkte pathogene Aktivität haben1. Die Identifizierung von Autoantikörpern ist wichtig für die Diagnose bestimmter Krankheiten, für die Prognose des Krankheitsverlaufs und für die Klassifizierung von Patienten, die von spezifischen Therapien profitieren können2. Autoantikörper werden in der Regel im Patientenserum mit der ELISA-Technik identifiziert; Das Screening auf mehrere Antigene mit dieser Technik ist jedoch mühsam und verbraucht eine große Menge an Patientenproben. Daher sind neue Technologien erforderlich, um Autoantikörper in größerem Maßstab zu profilieren.
Die Antigen-Microarray-Technik ist eine Proteom-Technologie, die es ermöglicht, Autoantikörper in einer Multiplex-Weise zu profilieren3. Im ersten Schritt dieses Prozesses wird eine Antigenbibliothek mit Hilfe eines robotischen Microarrayers auf eine Objektträgeroberfläche aufgeblasen. Die Objektträger werden mit verdünntem Serum untersucht und dann fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper hinzugefügt. Antikörperreaktivitäten werden durch Scannen der Objektträger mit einem Microarray-Scanner visualisiert und durch Fluoreszenzintensitäten quantifiziert. Antigen-Microarrays bieten gegenüber der ELISA-Technik mehrere Vorteile beim Screening auf Autoantikörper: 1) Sie benötigen nur Mikroliter Serum, um Autoantikörper gegen mehrere Antigene gleichzeitig zu profilieren, 2) sie verwenden Antigene sparsam, da nur Nanoliter des Antigens auf die Arrays aufgedeckt werden, 3) sie haben eine erhöhte Sensitivität3 im Vergleich zu ELISA und 4) sie ermöglichen die gleichzeitige, Separater Nachweis von mehr als einem Antikörper-Isotyp. Antigen-Microarrays wurden verwendet, um Autoantikörper bei Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose und systemischem Lupus erythematodes4-6 zu profilieren. Bei allen drei Erkrankungen wurden neue Erkenntnisse über die Pathogenese der Krankheit gewonnen, indem Autoantikörper in großem Maßstab mit den Arrays profiliert wurden. 
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Antigen-Microarrays mit Nitrocellulose-beschichteten Objektträgern. Eine Vielzahl von Antigenen, einschließlich Proteinen, Peptiden und Zelllysaten, können mit dieser Technik auf den Objektträgern angeordnet werden. Die Arrays können leicht angepasst werden, indem Antigene von Interesse in die Quellplatte aufgenommen werden, die die Antigenbibliothek enthält. Darüber hinaus zeigen wir, wie ein Paar von Sekundärantikörpern verwendet werden kann, um IgG- und IgM-Reaktivitäten auf derselben Objektträgeroberfläche zu trennen. Wir haben diese Technik nun optimiert, um Autoantikörper sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen zu messen.

<table><tbody><tr><td>Ribosomales P0</td><td>Diarect</td><td>14100</td><td>verdünnt auf 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>humanem IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-003</td><td>verdünnt auf 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>human IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-012</td><td>verdünnt auf 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Maus IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5381</td><td>verdünnt auf 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Maus IgM</td><td>Biolegend</td><td>401601</td><td>Verdünnung auf 0,2 mg/ml in</td></tr><tr><td>doppelsträngiger PBS-DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>Verdünnung auf 0,2 mg/ml in</td></tr><tr><td>einzelsträngiger PBS-DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8899</td><td>Verdünnung auf 0,2 mg/ml in PBS-Microarrayer</td></tr><tr><td></td><td>Virtek</td><td>VersArray Chipwriter Pro</td><td>Viele Arten von Arrayern eignen sich für</td></tr><tr><td>feste Druckstifte</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SSP015</td><td></td></tr><tr><td>Software für den robotischen Microarrayer</td><td>Virtek</td><td>Chipwriter Pro</td><td></td></tr><tr><td>FAST Objektträger (2 Pads)</td><td>GVS Northa America</td><td>10485317</td><td></td></tr><tr><td>FAST Rahmen</td><td>GVS Northa America</td><td>10486001</td><td></td></tr><tr><td>FAST Inkubationskammern (2 Pads)</td><td>GVS Northa America</td><td>10486242</td><td></td></tr><tr><td>384 Well Platten</td><td>Whatman</td><td>7701-5101</td><td></td></tr><tr><td>Plattenversiegeler</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Folienplattenabdeckungen</td><td>VWR</td><td>60941-124</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Invitrogen</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Ziege anti-human IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-165-096</td><td>verwenden Arbeitsmaterial in 50% Glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 Ziege anti-human IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-175-129</td><td>verwenden Arbeitsmaterial in 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy3 Ziege Anti-Maus IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-165-071</td><td>verwenden Arbeitsmaterial in 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 Ziege Anti-Maus IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-175-075</td><td>verwenden Arbeitsmaterial in 50% glyercol</td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon 4200A</td><td></td></tr><tr><td>Microarray Software</td><td>Molecular Devices</td><td>Genepix 6.1</td><td></td></tr><tr><td>Clustering Software</td><td>eisenlab.org</td><td>Cluster 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Heatmap-Software</td><td>eisenlab.org</td><td>Treeview 1.60</td><td></td></tr><tr><td>Microarray-Statistiksoftware</td><td>Stanford University</td><td>SAM 4.0 (Signifikanzanalyse von Microarrays)</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of two-color antigen-mikroarrays für den gleichzeitigen nachweis von igg und igm-autoantikörper

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Autoantikörper, also Antikörper gegen Selbstantigene, sind in vielen Krankheitszuständen vorhanden und können als Marker für die Krankheitsaktivität dienen. Der Gehalt an Autoantikörpern gegen bestimmte Antigene wird in der Regel mit der ELISA-Technik (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) nachgewiesen. Das Screening auf mehrere Autoantikörper mit ELISA kann jedoch zeitaufwändig sein und erfordert eine große Menge an Patientenproben. Die Antigen-Microarray-Technik ist eine alternative Methode, mit der Multiplex-Verfahren auf Autoantikörper untersucht werden kann. Bei dieser Technik werden Antigene mit einem robotischen Microarrayer auf speziell beschichtete Objektträger aufgebracht. Die Objektträger werden mit Serumproben des Patienten untersucht und anschließend fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper hinzugefügt, um die Bindung von Serum-Autoantikörpern an die Antigene nachzuweisen. Die Autoantikörper-Reaktivitäten werden durch Scannen der Objektträger mit einem Scanner, der Fluoreszenzsignale erkennen kann, aufgedeckt und quantifiziert. Hier beschreiben wir Methoden zur Generierung von benutzerdefinierten Antigen-Microarrays. Unsere aktuellen Arrays werden mit 9 massiven Pins gedruckt und können bis zu 162 Antigene enthalten, die in doppelter Ausführung entdeckt wurden. Die Arrays können leicht angepasst werden, indem die Antigene in der Quellplatte, die vom Microarrayer verwendet wird, geändert werden. Wir haben ein zweifarbiges Sekundärantikörper-Nachweisschema entwickelt, das IgG- und IgM-Reaktivitäten auf derselben Objektträgeroberfläche unterscheiden kann. Das Nachweissystem wurde optimiert, um die Bindung von humanen und murinen Autoantikörpern zu untersuchen.

Antigene werden in einer 384 - Well - Platte und auf Objektträger gedruckt von einem Roboter Microarrayers angeordnet , wie in 1 gezeigt ist , Fig . 2 gleitet in einem Rahmen mit Inkubationskammern und einem abgetasteten Objektträger nach der Verarbeitung plaziert zeigt, Fig . 3 zeigt , positive und negative Kontrollobjektträger. Der negative Schieber nur mit sekundären Antikörpern sondiert, und die posi...

Wir beschreiben hier eine Methode zur Erzeugung anpassbarer Antigen-Microarrays, die für den gleichzeitigen Nachweis von Serum-IgG- und IgM-Autoantikörpern von Menschen und Mäusen verwendet werden können. Diese Arrays ermöglichen den quantitativen Hochdurchsatznachweis von Antikörpern gegen beliebige Antigene oder Epitope von Interesse.

Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, Autoantikörper multiplexartig schnell zu screenen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Autoimmunität zu klären, beispielsweise, welche Autoantikörper mit verschiedenen Krankheitszuständen korrelieren. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass Autoantikörper parallel getestet werden können, nur Mikroliter an Serum benötigt werden und lediglich Mikrogramm-Mengen an Antigen erforderlich sind.Um Antigen-Mikroarrays herzustellen, verdünnen Sie Antigene zunächst in PBS auf eine Endkonzentration von 2 Milligramm pro Milliliter. Richten Sie eine Mikroarrayer-Konfiguration mit neun Pins ein, um bis zu 162 eindeutige Antigene dupliziert aufzutragen. Fügen Sie IgG- und IgM-Antigene in die Antigen-Bibliothek als positive Kontrollen ein.Verwenden Sie PBS nur als negativen Kontrollstamm. Geben Sie 20 Mikroliter jedes Antigens in Gruppen auf die 384-Well-Quellplatte, die der Anordnung des Druckkopfs entsprechen. Decken Sie die Quellplatte mit Folie ab und frieren Sie die Platte bei minus 80 Grad Celsius ein, bis die Arrays gedruckt werden sollen.Reinigen Sie die festen Microarray-Nadeln, indem Sie sie dreimal je eine Minute in eine Ultraschallbad mit entionisiertem Wasser geben. Stellen Sie die Nadeln zum Trocknen in ein Gestell. Bringen Sie anschließend die Nadeln im Microarray-Druckkopf an.Verwenden Sie für neun Pins eine dreimal-drei-Konfiguration. Programmieren Sie anschließend den Mikroarrayer für den Drucklauf, indem Sie die Anzahl der Pins am Druckkopf, die Anzahl der Objektträger, die Anzahl der Felder auf jedem Objektträger und die Anzahl der Wiederholungspunkte für jedes Antigen festlegen. Zusätzlich muss der Mikroarrayer so programmiert werden, dass die Pins zwischen verschiedenen Antigengruppen in Wasser sonifiziert werden.Als Nächstes nach dem Auftauen der Quellplatte die Platte eine Minute lang bei 100 × g zentrifugieren. Die Quellplatte an der vorgesehenen Stelle im Mikroarrayer platzieren und anschließend den Teil der Folie entfernen, der die erste Gruppe der zu druckenden Antigene abdeckt. Die unbedruckten Objektträger auf der Oberfläche des Arrayers anordnen und das Druckprogramm starten. Die Objektträger bei Raumtemperatur drucken, wobei die Luftfeuchtigkeit am Arrayer auf 55 bis 60 % eingestellt sein sollte. Nachdem jede Gruppe von Antigenen auf alle Objektträger aufgebracht wurde, den Mikroarrayer anhalten.Bedecken Sie die gerade aufgetragenen Antigene mit Folie, um Verdunstung zu verhindern, und nehmen Sie die Folie von der nächsten Gruppe der Antigene ab, die aufgetragen werden sollen. Fahren Sie anschließend mit dem Druckprogramm fort. Nachdem alle Antigene aufgetragen wurden, bedecken Sie die Quellplatte mit einem neuen Stück Folie und frieren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius ein.Legen Sie die bedruckten Objektträger in eine Objektträgerbox und vakuumieren Sie diese. Die Objektträger können am nächsten Tag oder bis zu einem Monat später verwendet werden. Um Mikroarrays mit verdünntem Serum unter Verwendung von Inkubationskammern zu analysieren, bringen Sie die Objektträger in die Halterahmen ein.Fügen Sie anschließend 700 Mikroliter Blockpuffer jeder Array-Oberfläche hinzu. Legen Sie die Klebefolie über den Rahmen und überführen Sie ihn in einen verschlossenen Behälter mit einem Stück feuchtem Papiertuch. Inkubieren Sie die Objektträger dann über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler.Am folgenden Tag verdünnen Sie die Serumproben im Verhältnis 1 zu 100 in Blockpuffer. Danach saugen Sie die Blocklösung von den Arrays ab und geben 500 Mikroliter der verdünnten Probe auf jede Array-Oberfläche. Anschließend decken Sie die Arrays mit Klebefolie ab und inkubieren sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius unter Schütteln.Anschließend saugen Sie die Serumproben von den Arrays ab und spülen Sie die Array-Oberflächen viermal mit Spülpuffer, indem Sie den Puffer auf die Objektträger gießen und ihn schnell abflicken. Spülen Sie jede Array-Oberfläche mit 700 µL Blockierpuffer und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln. Geben Sie dann 500 µL verdünnter sekundärer Antikörper auf jede Objektträgeroberfläche und bedecken Sie sie mit Klebefolie.Inkubieren Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius unter Schütteln für 45 Minuten. Nach der Inkubation saugen Sie die sekundäre Antikörperlösung von den Objektträgern ab und spülen diese viermal, wie gerade gezeigt. Anschließend waschen Sie die Objektträger dreimal mit jeweils 700 Mikrolitern Blockverdünnungspuffer, wobei jede Waschung 10 Minuten dauert.Entfernen Sie die Objektträger aus den Halterungen, legen Sie sie in einen metallenen Objektträgerbehälter und tauchen Sie sie in PBS ein. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur unter orbitaler Schüttelung für 20 Minuten. Stellen Sie einen Objektträgerbehälter für 15 Sekunden in einen Behälter mit entionisiertem Wasser.Danach das Gestell in einen neuen Behälter mit Wasser stellen und weitere 15 Sekunden inkubieren. Um die Objektträger zu trocknen, das Objektträgergestell auf einen ELISA-Plattenadapter in der Zentrifuge platzieren und bei 220 × g und Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugieren. Die Objektträger in einer lichtdichten Box aufbewahren, bis sie zum Scannen bereit sind.Verwenden Sie zum Scannen der Objektträger einen Mikroarrayscanner, der die fluoreszierenden Signale von SI drei und SI fünf detektieren kann. Bestimmen Sie die optimalen Einstellungen für die Photomultiplier-Röhre (PMT), indem Sie einen Objektträger mit vollständiger Antigenbibliothek vorab scannen, der nur mit sekundären Antikörpern markiert wurde. Stellen Sie die PMT-Werte ein, indem Sie die Hardware-Taste drücken, sodass die mediane Fluoreszenzintensität abzüglich Hintergrund (MFIB) der humanen IgG-Merkmale im SI-drei-Kanal und der humanen IgM-Merkmale im SI-fünf-Kanal ähnlich ist, was typischerweise 40.000 beträgt.Scannen Sie als Nächstes die experimentellen Objektträger auf den beiden Kanälen, indem Sie den Scan-Button drücken. Speichern Sie die Bilder der Objektträger nach jedem Scan auf beiden Kanälen. Laden Sie mithilfe des Datei-Buttons den zu analysierenden Objektträger in die Microarray-Software.Verwenden Sie dann die Dateischaltfläche, um die Gen-Array-Liste oder GAL-Datei zu laden, die das Layout des Arrays mit den Identitäten der Array-Merkmale enthält. Legen Sie die Array-Vorlage über das gescannte Bild, sodass die Array-Merkmale möglichst genau mit der Vorlage übereinstimmen. Drücken Sie die Schaltfläche „align“, um die Merkmale in allen Blöcken mit der Vorlage auszurichten.Die Software berechnet anschließend für jedes der Antigene einen MFI abzüglich Hintergrund. Schließlich verwenden Sie die Datei-Schaltfläche, um die Ergebnisse als Textdatei zu exportieren, und analysieren die Daten gemäß dem Textprotokoll. In dieser Abbildung, die positive und negative Kontrollpräparate zeigt, wurde das negative Präparat nur mit sekundären Antikörpern behandelt und das positive Kontrollpräparat mit Serum von einem Patienten mit systemischem Lupus erythematodes.Wie hier gezeigt, weist das positive Kontrollserum mit bekannter Reaktivität gegenüber riboP IgM-Antikörper gegen einfachsträngige DNA sowie IgG-Antikörper gegen riboP auf. Bei IgM zeigte sich über alle Serumverdünnungen hinweg eine lineare Antwort, bei IgG bis zu einem MFI abzüglich Hintergrund von etwa 30.000. In diesem Experiment wird das Array mit Humanserum von einem Patienten mit kryoglobulinämischer Vaskulitis untersucht, bei dem ein dokumentierter rheumatoider Faktor vorliegt, der ein IgM-Antikörper gegen IgG ist.Das IgG-Merkmal ist gelbgrün aufgrund der Bindung von IgM im Serum des Patienten an das immobilisierte IgG auf dem Array. Bei Verwendung alleiniger sekundärer Antikörper wird keine IgM-Reaktivität gegenüber dem auf dem Array aufgebrachten IgG beobachtet. Hier gezeigt: Auf das Array aufgebrachte Maus-IgM- und IgG-Antikörper werden jeweils nur mit anti-maus-spezifischen sekundären Antikörpern gegen IgM und IgG nachgewiesen.Diese Abbildung zeigt die Ausrichtung eines Vorlagenrasters auf einem gescannten Array-Bild mithilfe einer Microarray-Analyse-Software. Nach der Ausrichtung können die Array-Merkmale analysiert werden, um die mediane Fluoreszenzintensität abzüglich des Hintergrunds für jedes Merkmal zu erhalten. Wenn man einmal Erfahrung mit der Untersuchung von Antigen-Microarrays gesammelt hat, kann dies innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden, sofern es ordnungsgemäß durchgeführt wird.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Techniken wie ELISA durchgeführt werden, um die Ergebnisse der Antigen-Mikroarrays zu validieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Antigen-Mikroarrays bedruckt, wie man Antigen-Mikroarrays mit Serum probiert und wie man Antigen-Mikroarrays mit einem Scanner scannt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Serum gefährlich sein kann und universelle Vorsichtsmaßnahmen während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

generation-two-color-antigen-microarrays-for-simultaneous-detection

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt eine Immunoassay-Technik, bei der fluoreszierende magnetische Kügelchen oder Mikrosphären in Verbindung mit verschiedenen Antigenen verwendet werden, um gleichzeitig verschiedene Antikörper-Isotypen in einer Serumprobe nachzuweisen. Der Assay ist hilfreich, um die Serokonversion während einer Infektion oder nach der Impfung zu verstehen.

Multianalyt-Immunobead-Assay: eine flussbasierte Immunoassay-Technik zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antikörper-Subtypen in humanen Serumproben

In diesem Video demonstrieren wir den Prozess zum Nachweis von Antikörper-Isotypen in mehreren menschlichen Serumproben anhand eines Microarray-Objektträgers, der mit antigenen Subtypen von Influenzavirusstämmen gedruckt wurde.

Viraler Antigen-Microarray-Assay zum Nachweis von Antikörper-Isotypen im Serum gegen virales Antigen

Dieses Video demonstriert die gedruckte Glykan-Array-Technologie zur Analyse von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern in Mausserum. Die Antikörper im Serum interagieren mit spezifischen Glykanen auf dem Chip, was durch Immunfärbung und anschließende Fluoreszenzuntersuchung bestätigt wird.

Nachweis von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern mit einem gedruckten Glykan-Array

Das Video zeigt die Implementierung der Snap-Chip-Technologie für kreuzreaktivitätsfreie Multiplex-Sandwich-Immunoassays. Die einfache Aktion des Einrastens von zwei Microarray-Objektträgern, die jeweils unterschiedliche Reagenzien enthalten, gewährleistet einen Reagenzientransfer ohne Kreuzkontamination und hilft beim Nachweis mehrerer Proteine mit Hilfe eines Sandwich-Immunoassays.

Eine Snap-Chip-Technologie für einen kreuzreaktivitätsfreien Multiplex-Sandwich-Immunoassay

Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.

Snap Chip für Cross-reactivity frei und Spotter Multiplex Sandwich Immunoassays

Hier präsentierten wir die Methoden, um menschliche Insel-Autoantikörper mit Electrochemiluminescence (ECL) Assays erkennen. Das Protokoll verwendet, um vorherzusagen, Typ 1 Diabetes, kann erweitert werden, um Autoantikörper für andere Autoimmunerkrankungen zu erkennen.

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

Wir präsentieren ein Protokoll zur Verwendung eines Protein-Mikroarrays, das durch den Druck von Influenza-Antigenen auf nitrozellulosebeschichtete Dias konstruiert wurde, um gleichzeitig Serum für mehrere Antikörper-Isotypen gegen über 250 Antigene aus verschiedenen Virusstämmen zu sonden, Messung der Breite von Serumantikörpern über Virussubtypen hinweg.

Verwendung eines Influenza-Antigen-Mikroarrays zur Messung der Breite von Serum-Antikörpern über Virussubtypen hinweg

Wir modellieren einen einfachen Multiplex-ECL-Assay, der 7 Autoantikörper-Assays miteinander kombiniert. Der Test ist in der Lage, gleichzeitig auf T1D und mehrere andere Autoimmunerkrankungen zu untersuchen, einschließlich Zöliakie, Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse und autoimmunes polyglanduläres Syndrom 1.

Ein Hochdurchsatz-Elektrochemilumineszenz-7-Plex-Assay zum gleichzeitigen Screening auf Typ-1-Diabetes und mehrere Autoimmunerkrankungen

Ein Flow-Analysesystem für perlenbasierte Multiplex-Assays, das eine Zwei-Reporter-Ablesung ermöglicht, wurde für die Entwicklung von multiplex-serologischen und Antikörper-Neutralisationsassays verwendet, die gleichzeitig neutralisierende IgG- und IgM-Antikörper für SARS-CoV-2 messen können.

Ein schneller Multiplex-Dual-Reporter-IgG- und IgM-SARS-CoV-2-Neutralisationsassay für ein multiplexed Bead-basiertes Durchflussanalysesystem

Ein Dreikanal-Dual-Reporter-Fluoreszenz-Flussanalysesystem wurde verwendet, um einen Bead-basierten Multiplex-Immunoassay zu entwickeln, der gleichzeitig Serumproben auf IgG und IgM auswertet, die gegen mehrere Antigene verschiedener Borrelienspezies extrahiert wurden, die die Lyme-Borreliose in Europa und Nordamerika verursachen.

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

Erfahren Sie die Herstellung von Zwei-Farb-Antigen-Mikroarrays für den parallelen Nachweis von IgG- und IgM-Autoantikörpern in humanem und murinem Serum. Diese Hochdurchsatzmethode ermöglicht quantitative Antikörperanalysen mit minimalen Probenmengen.

Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

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