Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, mithilfe digitaler Analysewerkzeuge schnell genaue Zählungen von Zellen in einer Suspension oder bei einer Migration in einer Invasions-Assay-Membran vorzunehmen. Dieses Protokoll kann Forschern helfen, die Zellzahl zu quantifizieren, die für gängige Techniken und In-vitro-Zellmotilitätstests erforderlich ist. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie schnelle und genaue Zellzählungen ermöglicht und gleichzeitig mehrere Filter und Analysewerkzeuge enthält.

Stellen Sie zunächst die Mikroskopbeleuchtung auf Maximum ein. Wechseln Sie auf das 4x Objektiv und stellen Sie sicher, dass die Phasenkontrastfilter verwendet werden. Stellen Sie dann in der Mikroskopsoftware die Bildaufnahmeeinstellungen auf die Standardwerte ein.

Platzieren Sie nun ein Standard-Hämozytometer auf dem Mikroskoptisch und nehmen Sie ein Bild für den Schritt der Bildvolumenkalibrierung auf. Passen Sie die Belichtungszeit nach Bedarf an. Öffnen Sie in ImageJ unter dem Zellkonzentrationsrechner das Bild und klicken Sie auf die Schaltfläche Bildgröße abrufen.

Mit dieser Aktion werden die Textfelder für die Bildbreite und -höhe mit der Bildauflösung in Pixel ausgefüllt. Wählen Sie als Nächstes das Geradlinenwerkzeug aus und zeichnen Sie eine gerade Linie über die gesamte Länge des primären p-Quadrats des Hämozytometers, indem Sie mit dem Cursor klicken und ihn ziehen. Drücken Sie dann die M-Taste, um das Ergebnisfenster anzuzeigen.

Geben Sie nun den Wert aus der Längenspalte in das Textfeld für die p-Quadrat-Länge im Zellenkonzentrationsrechner ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Bildvolumen berechnen, um das Bildvolumen in das Textfeld Bildvolumen auszugeben. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Speichern, um die Kalibrierung des Plugins abzuschließen.

Für die Probenanalyse laden Sie 10 Mikroliter Zellen in beide Kammern eines Hämozytometer-Objektträgers und stellen Sie den Fokus so ein, dass das Innere der Zellen dunkler als die Zellmembran ist, um den Fokus innerhalb des zentralen Querschnitts der Zelle und nicht an den Polen zu gewährleisten. Passen Sie dann die Belichtung weiter an, damit die Zellen nicht überbelichtet werden. Leicht sichtbare Hämozytometerlinien sind akzeptabel.

Nehmen Sie nun fünf bis zehn nicht überlappende Bilder des zentralen Bereichs des Hämozytometers auf. Die Auflösung und Vergrößerung jedes Bildes muss mit der des Volumenkalibrierungsbildes identisch sein. Klicken Sie anschließend im Zellkonzentrationsrechner auf Zellen zählen und wählen Sie im Popup-Fenster einen Ordner aus, der gezählt werden soll.

Geben Sie anschließend im Eingabefeld für die Probennummer die Anzahl der pro Kammer aufgenommenen Bilder ein und klicken Sie auf OK. Das Plugin sammelt nun die Daten. Weitere Informationen finden Sie im Text. Setzen Sie zunächst in der Mikroskopsoftware die Bildaufnahmeeinstellungen auf die Standardwerte.

Verwenden Sie für die Stufe des Präparierzielfernrohrs einen einfarbigen weißen Hintergrund und verwenden Sie eine Lichtquelle über der Bühne, vorzugsweise zwei flexible LED-Leuchten. Legen Sie nun einen fertigen Objektträger der Migrationsassay-Membran auf den Tisch. Betrachten Sie das von der Software angezeigte Echtzeitbild und passen Sie die Vergrößerung manuell so an, dass sich die Ränder einer einzelnen Membran gerade im Sichtfeld der Kamera befinden.

Passen Sie dann die Positionen der Lichtquelle und die Belichtungszeiten an, um das ideale Bild so genau wie möglich zu reproduzieren. Diese hat eine minimale Hintergrundfarbe und eine gleichmäßig beleuchtete Membran. Die Genauigkeit der Zellzählung hängt von einer qualitativ hochwertigen Bildaufnahme ab.

Es ist daher wichtig, das beste Bild aufzunehmen, das von der Kamera des Benutzers erreicht werden kann, um die Plugins so effizient wie möglich zu nutzen. Entfernen Sie nun den Objektträger und gleichen Sie das Bild in der Mikroskopsoftware ab, um die Kalibrierung abzuschließen. Unmittelbar vor der Bildgebung glätten Sie jede Membran, indem Sie Druck auf den Deckglas ausüben, um so viele eingeschlossene Blasen wie möglich zu entfernen.

Legen Sie nun in der Software den Speicherort des Aufnahmeordners fest. Nehmen Sie dann ein Bild pro Membran auf und speichern Sie die Bilddateien als TIFs unter Verwendung der Namenskonvention von Beispiel 001, wobei die Anzahl für jedes Bild schrittweise erhöht wird. Diese Namenskonvention ist erforderlich, damit das Plugin die Dateien finden kann.

Wenn eine Flatfield-Korrektur gewünscht ist, suchen Sie für jede Folie einen leeren Bereich und nehmen Sie ein leeres Bild auf. Speichern Sie die Datei als leerer Beispielname. Öffnen Sie als Nächstes in ImageJ das TC-Plugin.

Klicken Sie in TC auf die Schaltfläche Flatfield und wählen Sie im Dialogfeld Verzeichnis auswählen den Ordner aus, in dem die Membranbilder gespeichert wurden. Öffnen Sie nun ein Migrations-Assay-Membranbild und wählen Sie Farbschwellenwert aus. Legen Sie im Fenster die Methode auf Shanbhag fest.

Legen Sie die Schwellenwertfarbe auf Weiß fest. Stellen Sie den Farbraum auf RGB ein und deaktivieren Sie die Option für den dunklen Hintergrund. Stellen Sie als Nächstes die oberen Schieberegler auf Null und die unteren Schieberegler auf 255 ein, um das Bild vollständig weiß zu machen.

Sobald sie weiß sind, passen Sie die grünen und roten Schieberegler an, bis nur noch die Kerne sichtbar sind. Kopieren Sie im TC-Plugin die Werte der RGB-Schieberegler in die zugehörigen Textfelder für den RGB-Schwellenwert der Konfigurationseinstellungen. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Hinzufügen/Ändern und überschreiben Sie die Konfiguration.

Klicken Sie im Bereich für die Konfigurationseinstellungen auf Speichern, um die Einstellungen auf die Festplatte zu schreiben. Um nun die Bilder mit dem TC-Plugin zu zählen, klicken Sie auf Count Folder und wählen Sie den Ordner aus, der gezählt werden soll. Das Programm verarbeitet dann die Bilder und fügt die Daten automatisch zur Haupttabelle hinzu.

In der Haupttabelle befindet sich nun ein Häkchen bei Kalibrieren? Die Spalte im Bild ist für die Kalibrierung gekennzeichnet, basierend auf ihrer Ähnlichkeit mit den idealen Metriken. Wählen Sie alle Proben aus, die für die Kalibrierung markiert sind.

Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Neu zählen und Vorgeschlagene Größe aus. Dadurch werden die Bilder mit der vorgeschlagenen minimalen Partikelfläche neu gezählt. Klicken Sie dann erneut mit der rechten Maustaste und wählen Sie Plot anzeigen.

Ein Idealbild hat einen Graphen, der einer langen Normalverteilung mit rechtem Ende ähnelt. Passen Sie bei Bedarf den unteren Größenbereich oder den RGB-Schwellenwert an, indem Sie das Beispiel auswählen, mit der rechten Maustaste klicken und dann Neu zählen und manuelle Einstellungen auswählen. Geben Sie dann die gewünschten Einstellungen ein und klicken Sie auf Zählen, um das Bild neu zu erzählen.

Um die Zählungen manuell anzupassen, wählen Sie die Beispiele aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Tabelle, und wählen Sie Bild mit Anzahl öffnen aus. Das Originalbild wird mit roten Markierungen geöffnet, die jedes vom Plugin gezählte Partikel darstellen. Darüber hinaus kann die Option Gezähltes Binärbild anzeigen verwendet werden, um zu überprüfen, wie gut einzelne Zellen durch den Farbschwellenwert aufgelöst werden.

Um eine Zählung manuell hinzuzufügen, halten Sie die Strg-Taste gedrückt, und klicken Sie mit der linken Maustaste. Dadurch wird an der Cursorposition eine Markierung hinzugefügt, die zur Gesamtanzahl addiert wird. Um eine Markierung manuell zu entfernen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und das Plugin entfernt die Markierung, die dem Cursor am nächsten liegt.

Um eine Gruppe von Markern zu entfernen, wählen Sie einen Interessenbereich aus und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Bereich, während Sie die Strg-Taste gedrückt halten. Der Prozess des Zellkonzentrationsrechners hängt vom p-Quadrat-Kalibrierbild und der Berechnung der p-Quadrat-Länge und der Pixel ab. Das p-Quadrat eines Hämozytometers hat ein Volumen von 100 Nanolitern, und bei dieser Konstante kann das gesamte Bildvolumen nach der Umrechnung von Pixeln in Millimeter berechnet werden.

Ein Vergleich von manuellen und automatisierten Zählungen über 57 Bilder aus verschiedenen Experimenten und Zelltypen zeigt, dass es eine sehr enge Korrelation zwischen beiden Methoden gibt. Konzentrationen zwischen fünf Millionen und 2.000 Zellen pro Milliliter wurden mit dem automatisierten Verfahren genau gezählt. Die Metrik Q stellt die Gesamtschärfe des Bildes dar, die auf der Verteilung der unterschiedlichen Partikelgrößen basiert.

Ein adäquater Q ist größer als 0,5. Wendet man diese Qualifikatoren auf eine Auswahl von bescheidenen bis exzellenten Bildern in Bezug auf Helligkeit und Hintergrundrauschen an, so lagen die kalibrierten Bildzählungen deutlich näher an manuellen Zählungen als bei unkalibrierten Bildern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Zellen in Suspension und aus Zellmotilitätsassays mit den Plugins CCC und TC ImageJ genau und effizient zählen können.

Sobald das TC-Plugin beherrscht ist, können die Erfassung, Quantifizierung und Anpassung der Zellzahl in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Beide Plugins basieren auf der Partikelzählfunktion von ImageJ und können durch Bearbeiten der von ImageJ verwendeten Makros geändert werden. Dies bietet dem Benutzer eine größere Flexibilität, um den Anwendungsbereich der Plugins auf andere Partikel auszuweiten.