Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, digitale Analysewerkzeuge zu verwenden, um schnell genaue Zellzählungen in einer Suspension oder auf einer Migration in einer Invasionstest-Membran durchzuführen. Dieses Protokoll kann Forschern helfen, die für gängige Techniken und In-vitro-Zellmotilitätstests erforderliche Zellanzahl zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie schnelle und präzise Zellzählungen ermöglicht und dabei mehrere Filter sowie Analysewerkzeuge einbezieht.

Stellen Sie zunächst die Mikroskobbeleuchtung auf das Maximum ein. Wechseln Sie zum 4x-Objektiv und stellen Sie sicher, dass die Phasenkontrastfilter verwendet werden. Legen Sie anschließend in der Mikroskopsoftware die Einstellungen für die Bildaufnahme auf die Standardeinstellungen fest.

Platzieren Sie nun ein Standard-Hämocytometer auf dem Mikroskopobjekttisch und nehmen Sie ein Bild für den Schritt der Bildvolumen-Kalibrierung auf. Passen Sie die Belichtungszeit nach Bedarf an. In ImageJ öffnen Sie unter dem Zellkonzentrationsrechner das Bild und klicken Sie auf die Schaltfläche „Get Image Dimension“.

Diese Aktion füllt die Textfelder für Bildbreite und -höhe mit der Bildauflösung in Pixeln. Wählen Sie anschließend das Linien-Werkzeug aus und ziehen Sie eine gerade Linie über die gesamte Länge des primären p-Quadrats des Hämozytometers, indem Sie den Cursor anklicken und ziehen. Drücken Sie danach die Taste M, um das Ergebnisfenster anzuzeigen.

Geben Sie nun den Wert aus der Längenspalte in das Textfeld „p-Quadrat-Länge“ im Zellkonzentrationsrechner ein. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche „Bildvolumen berechnen“, um das Bildvolumen in das entsprechende Textfeld auszugeben. Schließen Sie schließlich die Kalibrierung des Plugins ab, indem Sie auf die Schaltfläche „Speichern“ klicken.

Für die Probenanalyse 10 Mikroliter Zellen in beide Kammern eines Hämozytometer-Objektträgers geben und den Fokus so einstellen, dass das Innere der Zellen dunkler erscheint als die Zellmembran, um die Fokussierung auf den zentralen Querschnitt der Zelle und nicht auf die Pole zu gewährleisten. Anschließend die Belichtung weiter anpassen, sodass die Zellen nicht überbelichtet werden. Leicht sichtbare Linien des Hämozytometers sind akzeptabel.

Erstellen Sie nun fünf bis zehn sich nicht überlappende Aufnahmen des zentralen Bereichs des Hämozytometers. Die Auflösung und Vergrößerung jedes Bildes muss identisch mit derjenigen des Volumenkalibrierungsbildes sein. Klicken Sie danach im Zellkonzentrationsrechner auf „Zellen zählen“ und wählen Sie im Popup-Fenster einen zu zählenden Ordner aus.

Als Nächstes geben Sie in das Eingabefeld für die Probenanzahl die Anzahl der pro Kammer aufgenommenen Bilder ein und klicken Sie auf „OK“. Das Plugin sammelt nun die Daten. Weitere Einzelheiten finden Sie im Text. Um zu beginnen, stellen Sie in der Mikroskop-Software die Bildeinstellungen auf die Standardwerte zurück.

Verwenden Sie für den Tisch des Präparationsmikroskops einen einfarbig weißen Hintergrund und eine Lichtquelle oberhalb des Tisches, vorzugsweise zwei flexible LED-Leuchten. Platzieren Sie nun einen fertigen Membranschlitten aus dem Migrationsassay auf dem Tisch. Passen Sie unter Betrachtung des von der Software in Echtzeit angezeigten Bildes die Vergrößerung manuell so an, dass die Ränder einer einzelnen Membran gerade noch im Sichtfeld der Kamera liegen.

Danach passen Sie die Positionen der Lichtquellen und die Belichtungszeiten an, um das ideale Bild so genau wie möglich zu reproduzieren, das einen minimalen Hintergrundfarbton und eine gleichmäßig ausgeleuchtete Membran aufweist. Die Genauigkeit der Zellzählung hängt von einer hochwertigen Bildaufnahme ab.

Daher ist es wichtig, das bestmögliche Bild aufzunehmen, das mit der Kamera des Benutzers erreichbar ist, um die Plugins möglichst effizient nutzen zu können. Entfernen Sie nun den Objektträger und führen Sie im Mikroskop-Software die Weißabgleichung des Bildes durch, um die Kalibrierung abzuschließen. Unmittelbar vor der Aufnahme glätten Sie jede Membran, indem Sie Druck auf das Deckglas ausüben, um so viele eingeschlossene Blasen wie möglich zu entfernen.

Legen Sie nun innerhalb der Software den Speicherordner für die Aufnahme fest. Erfassen Sie anschließend ein Bild pro Membran und speichern Sie die Bilddateien im TIFF-Format ab, wobei die Benennungskonvention „Probe 001“ mit schrittweiser Erhöhung der Zahl für jedes Bild verwendet werden muss. Diese Benennungskonvention ist erforderlich, damit das Plugin die Dateien auffinden kann.

Falls eine Flatfield-Korrektur gewünscht ist, für jede Probe einen leeren Bereich finden und ein Leerbild aufnehmen. Die Datei unter dem Namen Probename Leerbild speichern. Als Nächstes in ImageJ das TC-Plugin öffnen.

Klicken Sie in TC auf die Schaltfläche Flatfield und wählen Sie im Dialogfeld „Choose Directory“ den Ordner aus, in dem die Membranbilder gespeichert wurden. Öffnen Sie nun ein Membranbild eines Migrationsassays und wählen Sie „Color Threshold“. Legen Sie im Fenster die Methode auf Shanbhag fest.

Stellen Sie die Schwellenfarbe auf Weiß ein. Stellen Sie den Farbraum auf RGB und deaktivieren Sie die Option für dunklen Hintergrund. Passen Sie als Nächstes die oberen Schieberegler auf null und die unteren Schieberegler auf 255 an, um das Bild vollständig weiß zu machen.

Sobald Weiß erreicht ist, stellen Sie die grünen und roten Regler so ein, bis nur noch die Kerne sichtbar sind. Kopieren Sie im TC-Plugin die Werte der RGB-Regler in die entsprechenden Konfigurationseinstellungen der RGB-Schwellenwerte. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Hinzufügen/Bearbeiten und überschreiben Sie die Konfiguration.

Klicken Sie im Konfigurationsfenster auf „Speichern“, um die Einstellungen auf die Festplatte zu schreiben. Gehen Sie nun zur Bildzählung mit dem TC-Plugin auf „Ordner zählen“ und wählen Sie den zu zählenden Ordner aus. Das Programm verarbeitet daraufhin die Bilder und fügt die Daten automatisch in die Haupttabelle ein.

Jetzt wird in der Haupttabelle ein Häkchen in der Spalte „Kalibrieren?“ erscheinen, wenn das Bild zur Kalibrierung markiert wurde, basierend auf seiner Ähnlichkeit zu den idealen Metriken. Wählen Sie alle Proben aus, die zur Kalibrierung markiert wurden.

Dann mit der rechten Maustaste klicken und „Recount and Suggested Size“ auswählen. Dadurch werden die Bilder mit der vorgeschlagenen minimalen Partikelgröße erneut gezählt. Danach erneut mit der rechten Maustaste klicken und „Show Plot“ auswählen.

Ein ideales Bild zeigt einen Graphen, der einer normalen Verteilung mit langem rechten Schwanz ähnelt. Falls erforderlich, passen Sie den unteren Größenbereich oder die RGB-Schwellenwerte an, indem Sie die Probe auswählen, mit der rechten Maustaste klicken und „Neu zählen und manuelle Einstellungen“ wählen. Geben Sie anschließend die gewünschten Einstellungen ein und klicken Sie auf „Zählen“, um das Bild erneut auszuwerten.

Um die Zählungen manuell anzupassen, wählen Sie die Proben aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Tabelle und wählen Sie „Bild mit Zählungen öffnen“. Das ursprüngliche Bild öffnet sich mit roten Markierungen, die jedes vom Plugin gezählte Partikel darstellen. Zusätzlich kann die Option „Binärbild der gezählten Objekte anzeigen“ verwendet werden, um zu überprüfen, wie gut einzelne Zellen durch die Farbschwellenwertmethode getrennt werden.

Um manuell eine Zählung hinzuzufügen, halten Sie die Steuertaste gedrückt und klicken Sie mit der linken Maustaste. Dadurch wird am Cursorstandort ein Marker gesetzt, der zur Gesamtanzahl hinzugezählt wird. Um einen Marker manuell zu entfernen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild, und das Plugin entfernt den Marker, der dem Cursor am nächsten liegt.

Um eine Gruppe von Markierungen zu entfernen, wählen Sie einen interessierenden Bereich aus und klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Bereich, während Sie die Steuerungstaste gedrückt halten. Der Vorgang des Zellkonzentrationsrechners hängt von dem p-Quadrat-Kalibrierungsbild und der Berechnung von p-Quadrat-Länge und Pixeln ab. Das p-Quadrat eines Hämozytometers hat ein Volumen von 100 Nanolitern, und ausgehend von dieser Konstante kann das Gesamtbildvolumen berechnet werden, nachdem Pixel in Millimeter umgerechnet wurden.

Ein Vergleich manueller und automatisierter Zählungen anhand von 57 Bildern aus verschiedenen Experimenten und Zelltypen zeigt eine sehr enge Korrelation zwischen beiden Methoden. Konzentrationen zwischen fünf Millionen und 2.000 Zellen pro Milliliter wurden mithilfe des automatisierten Verfahrens genau erfasst. Die Metrik Q repräsentiert die Gesamtschärfe der Bilder, basierend auf der Verteilung unterschiedlicher Partikelgrößen.

Ein angemessener Q-Wert ist größer als 0,5. Bei Anwendung dieser Kriterien auf eine Auswahl von mäßigen bis hervorragenden Bildern hinsichtlich Helligkeit und Hintergrundrauschen lagen die kalibrierten Bildzahlen deutlich näher bei den manuellen Zählungen als die nicht kalibrierten Bildzahlen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen in Suspension und aus Zellmotilitätsassays mithilfe der CCC- und TC-ImageJ-Plugins genau und effizient zählt.

Wenn das TC-Plugin beherrscht ist, können innerhalb einer Stunde Akquisition, Quantifizierung und Anpassung der Zellzahlen durchgeführt werden. Beide Plugins nutzen die Partikelzähl-Funktion von ImageJ und können durch Bearbeitung der von ImageJ verwendeten Makros angepasst werden. Dies bietet dem Anwender eine größere Flexibilität, den Anwendungsbereich der Plugins auf andere Partikel auszudehnen.