Name: Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Lernen Sie die automatische Zellzählung mit ImageJ-Plugins für Hämozytometer und Migrationstests. Diese Methode ermöglicht schnelle, präzise Quantifizierung für Zellbiologie und Neurowissenschaften.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde vom Canadian Institute of Health Research für CP (OR 142730 und OR 89931) unterstützt. Wir danken Jelena Brkic für ihre ursprüngliche Idee zur binären Teilchenanalyse in ImageJ.

<ol><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e752(2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2016).</li>
<li>Graham, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coulter+principle%3A+foundation+of+an+industry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The coulter principle: foundation of an industry.</a> J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).</li>
<li>Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrmerod%2C+MG+%22Animal+Cell+Culture%22">Animal Cell Culture</a>. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Imaging+Software+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Imaging Software Tools.</a> Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLouis%2C+KS+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).</li>
<li>Scott, W. N. Invasion and motility assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScott%2C+WN+%22Cancer+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Cell Culture: Methods and Protocols</a>. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-378a-5p+promotes+trophoblast+cell+survival%2C+migration+and+invasion+by+targeting+Nodal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal.</a> J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).</li>
<li>Adorno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mutant-p53%2FSmad+Complex+Opposes+p63+to+Empower+TGFbeta-Induced+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis.</a> Cell. 137, 87-98 (2009).</li>
<li>Chung, T. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+microRNA-204+mediates+migration+and+invasion+of+endometrial+cancer+by+regulating+FOXC1%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1.</a> Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%2FRev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">et al. In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+cell-counting+algorithm+for+fluorescently-stained+cells+in+migration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays.</a> Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Intern%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Grishagin, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+cell+counting+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Automatic cell counting with ImageJ.</a> Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).</li>
<li>Thomas, C. R., Paul, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+image+analysis+in+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Applications of image analysis in cell technology.</a> Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appreciating+data%3A+warts%2C+wrinkles+and+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Appreciating data: warts, wrinkles and all.</a> Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count+objects+in+an+image+in+Adobe+Photoshop%5BTitle%5D)+AND+%22Helpx.adobe.com%22%5BJournal%5D)">Count objects in an image in Adobe Photoshop.</a> Helpx.adobe.com. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html">https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html</a> (2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Kritische Schritte, Fehlerbehebung und Einschränkungen Das Wesen der automatisierten Rechenverfahren, insbesondere die der Partikelanalyse erfordert die mathematische Fähigkeit, diese Partikel zu definieren. Folglich ist die Genauigkeit der beiden Zellkonzentrationsrechner und Migrationsassay Zähler majorly abhängig von Bildwiedergabetreue, das heißt, wie genau das übernommene Bild das Membranzellprobe oder Migrationstest ähnelt. Es ist daher von größter Bedeutung Mikroskop und zugehörige Softw...

In - vitro - Zellzählung ist eine wichtige Grundtechnik in einem weiten Bereich von Gewebekulturexperimenten. Exakt die Anzahl der Zellen in einer Kultur , die Bestimmung ist von wesentlicher Bedeutung für die experimentelle Reproduzierbarkeit und Standardisierung 1,2. Zellzählung kann ein Hämozytometer manuell über als auch unter Verwendung einer Vielzahl von automatisierten Verfahren, jede mit ihren eigenen Vorteilen und Nachteilen 3,4,5 ausgeführt werden. Die meisten der automatisierten Verfahren zur Zellzählung gehören zu einer von zwei Klassen, diejenigen, die das Coulter-Prinzip verwenden oder Durchflusszytometrie. Coulter Zähler nutzen Sie Zellen elektrische Widerstand der Zellzahl und Größe zu bestimmen. Sie sind schnell, präzise und kostengünstiger als Durchflusszytometer. Jedoch werden sie selten für nur Zellzählung aufgrund ihrer beträchtlichen Kosten im Vergleich zu manuellen Zählung 3 verwendet. Durchflusszytometer, auf der anderen Seite, sind teuer, aber sie haben viele Anwendungen, wie beispielsweise Zellzählung, Analyse der Zellen Form, structure und Mess interne Zellmarker 4,5. Maschinen, die eine dieser beiden Prinzipien verwenden, sind von vielen Herstellern erhältlich. Manuelle Zählen ist erschwinglich , aber zeitaufwendig und unterliegt Bias , während die automatisierten Verfahren mit einem Bruchteil der Zeit kommen für die manuelle Zählung erforderlich , aber mit teuren Maschinen 6. Andere häufige Zellkulturverfahren sind in - vitro - Zellbeweglichkeit Assays, nämlich die Zellmigration und Invasion 7. Migration und Invasion Assays werden üblicherweise zur Untersuchung der Zellbeweglichkeit und Invasivität in Antwort auf eine chemotaktische Reaktion verwendet. Darüber hinaus sind sie häufig zu studieren Embryonalentwicklung, Differenzierung, Entzündungsreaktion, und die Metastasierung von mehreren Zelltypen 7-11 verwendet. Zellen, die durch die poröse Membran aus einem Migrationstest migriert oder eingedrungen kann auf zwei verschiedene Weisen quantifiziert werden. Erstens, indem die Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff Anfärben Dissoziation from die Membran und Quantifizierung eines Fluoreszenzleser 12. Eine Einschränkung dieser Methode der Quantifizierung ist , dass keine Aufzeichnung der Membranen zurückgehalten werden kann , und es besteht keine Möglichkeit zur weiteren Analyse 13. Die zweite Quantifizierungsverfahren wird für Zellen migrierten / eingedrungen mit Fluoreszenzfarbstoff oder häufiger fixiert und gefärbt werden, wobei zytologischen Farbstoffe wie Kristallviolett, Toluidinblau oder Hämatoxylin-Farbstoff; dann werden die Zellen manuell mit invertierten Mikroskopbilder dieser Membranen quantifiziert , die eine sehr zeitraubende Aufgabe ist 12,13. Um die Nachteile der manuellen Zellzählung, zwei zuverlässigen und genauen automatischen Zellzähler für Zellkonzentration und für den Migrationstest überwunden wurden entwickelt. Diese automatisierten Zellzähler Algorithmen wurden für ImageJ als Plugin unter Verwendung von Oracle Java-Computer entwickelt. ImageJ ist ein öffentlicher und weit verbreiteten Bildbearbeitungswerkzeug durch das National Institute of Hea entwickeltlth (NIH) 14,15; Somit erleichtert diese Plugins für ImageJ Schreiben eine einfache Integration in die biologische Gemeinschaft. Automatisierung der Zellzählung sorgt für einen hohen Durchsatz und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu manuellen Zählung. Obwohl andere verfügbare Software und Plugins verwendet werden kann , die Zellkonzentration durch Bildanalyse 5,16,17, Zellkonzentration Calculator Plugin ist schnell und kann auch behandeln Verdünnungen von Zellen und Behandlungen zu berechnen. Darüber hinaus können alle Ergebnisse und Berechnungen aus diesen beiden Zähler gespeichert und exportiert werden. Die beiden Plugins in diesem Dokument beschrieben sind, für die Verwendung eines Phasenkontrastmikroskop für Live Cell Imaging und großes Sichtfeld (gesamte Membran capture) Bildgebung für Migration Assay-Membranen durch die Verwendung eines Binokular optimiert. Die Plugins sind frei zum Download zur Verfügung mit Installationsanweisungen aus: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table><tbody><tr><td>HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - mit L-Glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>Zellkultivierungsmedien&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Bovianserum (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>Medienergänzung</td></tr><tr><td>HTR8/SVneo Trophoblast-Zelllinie</td><td>Die Zellen wurden von Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Kanada)</td><td></td><td>Die Software ist so konzipiert, dass sie mit jeder Zelllinie funktioniert.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>Hergestellt als 0,20% (w/v) in 10 & Mikro; M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Zellkulturplatten</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>Alle mit Gewebekulturen behandelten Platten sind geeignet</td></tr><tr><td>Transwell Polyester Membraneinsätze - 8,0&nbsp; &Mikro; m Porengröße</td><td>Costar 3422 bestellt bei Fisher Scientific</td><td>7200150</td><td>Für 24-Well-Platten; Porengröße: 8,0 & Mikro; m; 6,5 mm Durchmesser; 0,33 cm2 Wachstumsbereich</td></tr><tr><td>HARLECO Hämatologie-Färbungen und -Reagenzien, EMD Millipore - Soluntionen 1, 2 & 3</td><td>EMD Millipore und bestellt bei VWR</td><td>65044A, B, & C</td><td>Das Hemacolor-Fleckenset besteht aus drei 500 ml (16,9 oz.) Polyflaschen und enthält ein Methanol-Fixiermittel (Lösung 1), einen Eosin- oder Säurefleck (Lösung 2) und einen Methylenblau- oder basischen Fleck (Lösung 3)</td></tr><tr><td>Applikator mit Baumwollspitze</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Einschneidige Industrierasierklingen</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>Dicke: 0,30 mm (0,012")</td></tr><tr><td>Objektträger - Vorgereinigt/Glatt</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550A3</td><td>Maße: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand Deckgläser - Rechtecke Nr. 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Dicke: 0,13 bis 0,17 mm; Größe: 50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fisher Chemical Permount Eindeckmedium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereo Präpariermikroskop</td><td>Leica Microsystems Das Mikromikroskop</td><td></td><td>ist ausgestattet mit der Leica Mikroskopkamera Modell MC170 HD & Kamerasoftware ist Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Mikroskop-Teile:&nbsp; LED3000 Spotlichtbeleuchtung Modell: MEB126, Leica M80 Optischer Träger Modell M80, Objektiv achromat 1,0X, WD=90&nbsp; mm Modell: MOB306 & Objektiv Achromat 0,32X, WD=303&nbsp; mm Modell: MOB315, Video Objektiv 0,5X Modell: MTU-293</td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Assistent Deutschland &nbsp;</td><td></td><td>0,100 mm Tiefe - 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>Olympus Inverslichtmikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41SF</td><td>Das Mikrosope ist ausgestattet mit Lumenera Infinity 1-2 2,0 Megapixel CMOS Color Kamera & Kamerasoftware ist Infinity analyze Version 6.5.2</td></tr><tr><td>Laminar Flow Cabinet 1300 Serie A2</td><td>Thermo Scientific &</td><td>Modell: 1375</td><td>Jeder Laminar-Flow-Schrank für die Zellkulturarbeit ist geeignet&nbsp;</td></tr><tr><td>Inkubator für Zellkulturen</td><td>Thermo Scientific</td><td>Modell: 370</td><td>Jeder Zellkultur-Inkubator ist geeignet - Die Zellen wurden in befeuchteter Umgebung kultiviert, 5% CO2, 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>NIH Version 1.50e</td><td>Erforderliche Mindestversion</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td>Oracle</td><td>Version 1.8.0_66</td><td>Erforderliche Mindestversion</td></tr></tbody></table>

automatische quantifizierung und analyse von zellzählung schritte bei der verwendung imagej plugins

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Das National Institute of Health ImageJ ist ein leistungsfähiges, frei verfügbaren Bildverarbeitungs-Software-Suite. ImageJ hat umfassende Partikelanalyse-Algorithmen, die effektiv genutzt werden kann, verschiedene biologische Partikel zu zählen. Wenn eine große Anzahl von Zellproben zu zählen, stellt der Zählkammer einen Engpass in Bezug auf die Zeit. Ebenso Membranen von Migration / Invasion Assays mit dem ImageJ Plug-Zellzähler, obwohl eine genaue Zählung, ist außerordentlich arbeitsintensiv, subjektiv und berüchtigt für verursachen Schmerzen am Handgelenk. Um diesem Bedarf zu begegnen, haben wir zwei Plugins innerhalb ImageJ für die einzige Aufgabe der automatisierten Hämozytometer (oder bekannten Volumen) und Migration / invasion Zellzählung. Beide Plugins verlassen sich auf die Fähigkeit, qualitativ hochwertige Mikroaufnahmen mit minimalen Hintergrund zu erfassen. Sie sind einfach für den schnellen Zählen und Analyse großer Probengrößen mit integrierten Analysetools zu verwenden und optimierte Kalibrierung von Zählungen zu helfen. Durch die Kombination der Kernprinzips von Zellzähler mit einem automatisierten Zählalgorithmus und post-counting Analyse Dies erhöht die Leichtigkeit, mit der Migrationsassays kann ohne Verlust an Genauigkeit bearbeitet werden.

Zellkonzentration Rechner Abbildung 1 zeigt den Gesamtprozess der CCC - Kalibrierung und zählbar Bildaufnahme. 1A und 1B zeigen die P-Quadrat Kalibrierungsbild und Berechnung von P-Quadrat Länge in Pixeln. CCC bestimmt Zellkonzentration in einem bestimmten Volumen nach der Formel: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq1.jpg" />...

Dieser Artikel beschreibt die Quantifizierung von Hämozytometer- und Migrations-/Invasionsmikroskopaufnahmen durch zwei neue Open-Source-ImageJ-Plugins: Cell Concentration Calculator und Migration Assay Counter. Darüber hinaus werden Bildaufnahme- und Kalibrierungsprotokolle beschrieben und die Eingabeanforderungen der Plugins ausführlich diskutiert.

Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, digitale Analysewerkzeuge zu verwenden, um schnell genaue Zellzählungen in einer Suspension oder auf einer Migration in einer Invasionstest-Membran durchzuführen. Dieses Protokoll kann Forschern helfen, die für gängige Techniken und In-vitro-Zellmotilitätstests erforderliche Zellanzahl zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie schnelle und präzise Zellzählungen ermöglicht und dabei mehrere Filter sowie Analysewerkzeuge einbezieht.Stellen Sie zunächst die Mikroskobbeleuchtung auf das Maximum ein. Wechseln Sie zum 4x-Objektiv und stellen Sie sicher, dass die Phasenkontrastfilter verwendet werden. Legen Sie anschließend in der Mikroskopsoftware die Einstellungen für die Bildaufnahme auf die Standardeinstellungen fest.Platzieren Sie nun ein Standard-H&auml;mocytometer auf dem Mikroskopobjekttisch und nehmen Sie ein Bild f&uuml;r den Schritt der Bildvolumen-Kalibrierung auf. Passen Sie die Belichtungszeit nach Bedarf an. In ImageJ &ouml;ffnen Sie unter dem Zellkonzentrationsrechner das Bild und klicken Sie auf die Schaltfl&auml;che „Get Image Dimension“.Diese Aktion füllt die Textfelder für Bildbreite und -höhe mit der Bildauflösung in Pixeln. Wählen Sie anschließend das Linien-Werkzeug aus und ziehen Sie eine gerade Linie über die gesamte Länge des primären p-Quadrats des Hämozytometers, indem Sie den Cursor anklicken und ziehen. Drücken Sie danach die Taste M, um das Ergebnisfenster anzuzeigen.Geben Sie nun den Wert aus der Längenspalte in das Textfeld „p-Quadrat-Länge“ im Zellkonzentrationsrechner ein. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche „Bildvolumen berechnen“, um das Bildvolumen in das entsprechende Textfeld auszugeben. Schließen Sie schließlich die Kalibrierung des Plugins ab, indem Sie auf die Schaltfläche „Speichern“ klicken.Für die Probenanalyse 10 Mikroliter Zellen in beide Kammern eines Hämozytometer-Objektträgers geben und den Fokus so einstellen, dass das Innere der Zellen dunkler erscheint als die Zellmembran, um die Fokussierung auf den zentralen Querschnitt der Zelle und nicht auf die Pole zu gewährleisten. Anschließend die Belichtung weiter anpassen, sodass die Zellen nicht überbelichtet werden. Leicht sichtbare Linien des Hämozytometers sind akzeptabel.Erstellen Sie nun fünf bis zehn sich nicht überlappende Aufnahmen des zentralen Bereichs des Hämozytometers. Die Auflösung und Vergrößerung jedes Bildes muss identisch mit derjenigen des Volumenkalibrierungsbildes sein. Klicken Sie danach im Zellkonzentrationsrechner auf „Zellen zählen“ und wählen Sie im Popup-Fenster einen zu zählenden Ordner aus.Als Nächstes geben Sie in das Eingabefeld für die Probenanzahl die Anzahl der pro Kammer aufgenommenen Bilder ein und klicken Sie auf „OK“. Das Plugin sammelt nun die Daten. Weitere Einzelheiten finden Sie im Text. Um zu beginnen, stellen Sie in der Mikroskop-Software die Bildeinstellungen auf die Standardwerte zurück.Verwenden Sie für den Tisch des Präparationsmikroskops einen einfarbig weißen Hintergrund und eine Lichtquelle oberhalb des Tisches, vorzugsweise zwei flexible LED-Leuchten. Platzieren Sie nun einen fertigen Membranschlitten aus dem Migrationsassay auf dem Tisch. Passen Sie unter Betrachtung des von der Software in Echtzeit angezeigten Bildes die Vergrößerung manuell so an, dass die Ränder einer einzelnen Membran gerade noch im Sichtfeld der Kamera liegen.Danach passen Sie die Positionen der Lichtquellen und die Belichtungszeiten an, um das ideale Bild so genau wie möglich zu reproduzieren, das einen minimalen Hintergrundfarbton und eine gleichmäßig ausgeleuchtete Membran aufweist. Die Genauigkeit der Zellzählung hängt von einer hochwertigen Bildaufnahme ab.Daher ist es wichtig, das bestmögliche Bild aufzunehmen, das mit der Kamera des Benutzers erreichbar ist, um die Plugins möglichst effizient nutzen zu können. Entfernen Sie nun den Objektträger und führen Sie im Mikroskop-Software die Weißabgleichung des Bildes durch, um die Kalibrierung abzuschließen. Unmittelbar vor der Aufnahme glätten Sie jede Membran, indem Sie Druck auf das Deckglas ausüben, um so viele eingeschlossene Blasen wie möglich zu entfernen.Legen Sie nun innerhalb der Software den Speicherordner für die Aufnahme fest. Erfassen Sie anschließend ein Bild pro Membran und speichern Sie die Bilddateien im TIFF-Format ab, wobei die Benennungskonvention „Probe 001“ mit schrittweiser Erhöhung der Zahl für jedes Bild verwendet werden muss. Diese Benennungskonvention ist erforderlich, damit das Plugin die Dateien auffinden kann.Falls eine Flatfield-Korrektur gewünscht ist, für jede Probe einen leeren Bereich finden und ein Leerbild aufnehmen. Die Datei unter dem Namen Probename Leerbild speichern. Als Nächstes in ImageJ das TC-Plugin öffnen.Klicken Sie in TC auf die Schaltfläche Flatfield und wählen Sie im Dialogfeld „Choose Directory“ den Ordner aus, in dem die Membranbilder gespeichert wurden. Öffnen Sie nun ein Membranbild eines Migrationsassays und wählen Sie „Color Threshold“. Legen Sie im Fenster die Methode auf Shanbhag fest.Stellen Sie die Schwellenfarbe auf Weiß ein. Stellen Sie den Farbraum auf RGB und deaktivieren Sie die Option für dunklen Hintergrund. Passen Sie als Nächstes die oberen Schieberegler auf null und die unteren Schieberegler auf 255 an, um das Bild vollständig weiß zu machen.Sobald Weiß erreicht ist, stellen Sie die grünen und roten Regler so ein, bis nur noch die Kerne sichtbar sind. Kopieren Sie im TC-Plugin die Werte der RGB-Regler in die entsprechenden Konfigurationseinstellungen der RGB-Schwellenwerte. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Hinzufügen/Bearbeiten und überschreiben Sie die Konfiguration.Klicken Sie im Konfigurationsfenster auf „Speichern“, um die Einstellungen auf die Festplatte zu schreiben. Gehen Sie nun zur Bildzählung mit dem TC-Plugin auf „Ordner zählen“ und wählen Sie den zu zählenden Ordner aus. Das Programm verarbeitet daraufhin die Bilder und fügt die Daten automatisch in die Haupttabelle ein.Jetzt wird in der Haupttabelle ein Häkchen in der Spalte „Kalibrieren?“ erscheinen, wenn das Bild zur Kalibrierung markiert wurde, basierend auf seiner Ähnlichkeit zu den idealen Metriken. Wählen Sie alle Proben aus, die zur Kalibrierung markiert wurden.Dann mit der rechten Maustaste klicken und „Recount and Suggested Size“ auswählen. Dadurch werden die Bilder mit der vorgeschlagenen minimalen Partikelgröße erneut gezählt. Danach erneut mit der rechten Maustaste klicken und „Show Plot“ auswählen.Ein ideales Bild zeigt einen Graphen, der einer normalen Verteilung mit langem rechten Schwanz ähnelt. Falls erforderlich, passen Sie den unteren Größenbereich oder die RGB-Schwellenwerte an, indem Sie die Probe auswählen, mit der rechten Maustaste klicken und „Neu zählen und manuelle Einstellungen“ wählen. Geben Sie anschließend die gewünschten Einstellungen ein und klicken Sie auf „Zählen“, um das Bild erneut auszuwerten.Um die Zählungen manuell anzupassen, wählen Sie die Proben aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Tabelle und wählen Sie „Bild mit Zählungen öffnen“. Das ursprüngliche Bild öffnet sich mit roten Markierungen, die jedes vom Plugin gezählte Partikel darstellen. Zusätzlich kann die Option „Binärbild der gezählten Objekte anzeigen“ verwendet werden, um zu überprüfen, wie gut einzelne Zellen durch die Farbschwellenwertmethode getrennt werden.Um manuell eine Zählung hinzuzufügen, halten Sie die Steuertaste gedrückt und klicken Sie mit der linken Maustaste. Dadurch wird am Cursorstandort ein Marker gesetzt, der zur Gesamtanzahl hinzugezählt wird. Um einen Marker manuell zu entfernen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild, und das Plugin entfernt den Marker, der dem Cursor am nächsten liegt.Um eine Gruppe von Markierungen zu entfernen, wählen Sie einen interessierenden Bereich aus und klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Bereich, während Sie die Steuerungstaste gedrückt halten. Der Vorgang des Zellkonzentrationsrechners hängt von dem p-Quadrat-Kalibrierungsbild und der Berechnung von p-Quadrat-Länge und Pixeln ab. Das p-Quadrat eines Hämozytometers hat ein Volumen von 100 Nanolitern, und ausgehend von dieser Konstante kann das Gesamtbildvolumen berechnet werden, nachdem Pixel in Millimeter umgerechnet wurden.Ein Vergleich manueller und automatisierter Zählungen anhand von 57 Bildern aus verschiedenen Experimenten und Zelltypen zeigt eine sehr enge Korrelation zwischen beiden Methoden. Konzentrationen zwischen fünf Millionen und 2.000 Zellen pro Milliliter wurden mithilfe des automatisierten Verfahrens genau erfasst. Die Metrik Q repräsentiert die Gesamtschärfe der Bilder, basierend auf der Verteilung unterschiedlicher Partikelgrößen.Ein angemessener Q-Wert ist größer als 0,5. Bei Anwendung dieser Kriterien auf eine Auswahl von mäßigen bis hervorragenden Bildern hinsichtlich Helligkeit und Hintergrundrauschen lagen die kalibrierten Bildzahlen deutlich näher bei den manuellen Zählungen als die nicht kalibrierten Bildzahlen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen in Suspension und aus Zellmotilitätsassays mithilfe der CCC- und TC-ImageJ-Plugins genau und effizient zählt.Wenn das TC-Plugin beherrscht ist, können innerhalb einer Stunde Akquisition, Quantifizierung und Anpassung der Zellzahlen durchgeführt werden. Beide Plugins nutzen die Partikelzähl-Funktion von ImageJ und können durch Bearbeitung der von ImageJ verwendeten Makros angepasst werden. Dies bietet dem Anwender eine größere Flexibilität, den Anwendungsbereich der Plugins auf andere Partikel auszudehnen.

automated-quantification-analysis-cell-counting-procedures-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Adhesive Mikrostrukturen, dass zelluläre Architektur normalisieren kann die Empfindlichkeit in der Detektion von Arzneimittelwirkungen, die Verbesserung der Reproduzierbarkeit und vereinfachen automatisierte Bildaufnahme und-analyse werden. Eine solche Technologie profitieren Arzneimittel / siRNA Screening-Assays, auf konventionellen Zellkultur unterstützt durchgeführt und somit leidet übermäßige Zelle zu Zelle Variabilität.

Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

Wir beschreiben die prototypische Verfahren zur Herstellung Mikroskop Deckgläser mit fluoreszierenden Gelatine zur Visualisierung invadopodia-vermittelte Matrixabbau beschichtet. Rechenverfahren Verwendung verfügbarer Software für die Quantifizierung der resultierenden Ebenen der Matrix Proteolyse durch einzelne Zellen innerhalb einer Mischpopulation und für Gruppen, die vielzelligen gesamte mikroskopische Felder dargestellt.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Quelle: Dodge, R., et al. Schnelle Zählung von koloniebildenden Einheiten im 96-Well-Plattenformat, angewendet auf das Drosophila-Mikrobiom . J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt die Quantifizierung von koloniebildenden Einheiten (KBEs) von darmassoziierten Bakterien in Drosophila-Fliegen unter Verwendung eines seriellen Verdünnungs- und Plattierungsansatzes. Homogenisierte Fliegenproben, die Darmbakterien enthalten, werden seriell verdünnt, auf Agar plattiert und inkubiert, um das Wachstum...

Quantifizierung koloniebildender Einheiten darmassoziierter Bakterien in Drosophila-Fliegen

Dieses Protokoll beschreibt die anpassbare Oberflächenfunktionalisierung des Desthiobiotin-, Streptavidin- und APTES-Systems, um bestimmte Zelltypen von Interesse zu isolieren. Darüber hinaus behandelt dieses Manuskript die Anwendungen, die Optimierung und die Verifizierung dieses Prozesses.

Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum wurde kürzlich als System zur Untersuchung von Proteinfehlfaltung und Proteostase etabliert. Hier beschreiben wir eine neue bildgebende Methodik, um die temperaturinduzierte Proteinaggregation und die zelluläre Stressantwort in D. discoideum zu untersuchen.

Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der<em&gt; D. discoideum</em&gt; Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Der Artikel beschreibt die Quantifizierung von 1) der Größe und Anzahl der fokalen Verklebungen und 2) Zellformindex und seine Verteilung von konfokalen Bildern der konfluenten Monolayer von MCF7-Zellen.

Quantifizierung von Zell-Substrat-Adhäsionsflächen und Zellformverteilungen in MCF7-Zell-Monolayern

Wir stellen eine Methode vor, die einen generalisierbaren flächenbasierten Bildanalyseansatz verwendet, um Zellzahlen zu identifizieren. Die Analyse verschiedener Zellpopulationen nutzte die signifikanten Zellhöhen- und Strukturunterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines adaptiven Algorithmus.

Area-based Image Analysis Algorithm zur Quantifizierung von Makrophagen-Fibroblasten-Kokulturen

Hier wird eine Methode zur Analyse der Proteinaggregationskinetik im Fadenwurm Caenorhabditis elegans vorgestellt. Tiere aus einer alterssynchronisierten Population werden zu verschiedenen Zeitpunkten abgebildet, gefolgt von einer halbautomatischen Inklusionszählung in CellProfiler und Anpassung an ein mathematisches Modell in AmyloFit.

Überwachung der Proteinaggregationskinetik in vivo mittels automatisierter Einschlusszählung bei Caenorhabditis elegans

Diese Methode quantifiziert die mikrobielle Häufigkeit unter Verwendung eines 96-Well-Plattenformats für Plattenkoloniebildungseinheiten (CFUs) und wird auf das Drosophila-Mikrobiom in ganzen Fliegenhomogenatproben angewendet. CFUs werden mit einer hier bereitgestellten automatisierten Bildanalysesoftware gezählt.

Schnelle Koloniebildung im 96-Well-Plattenformat aufgebracht auf das Drosophila-Mikrobiom

In diesem Artikel werden Schritt-für-Schritt-Methoden zur Automatisierung der bildbasierten Zellkernquantifizierung mithilfe eines ausführbaren Open-Source-Programms beschrieben, das über eine Reihe von Zelldichten validiert wurde. Dieses Programm bietet eine Alternative, die Barrieren in Bezug auf Kosten, Zugänglichkeit für Benutzer mit begrenzten technologischen Fähigkeiten und anwendungsspezifische Validierung beseitigt, die den Nutzen bestehender Technologien einschränken können.

Verwendung von Computer-Vision-Bibliotheken zur Optimierung der Zellkernquantifizierung

Lernen Sie die automatische Zellzählung mit ImageJ-Plugins für Hämozytometer und Migrationstests. Diese Methode ermöglicht schnelle, präzise Quantifizierung für Zellbiologie und Neurowissenschaften.

Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins

Weitere Videos entdecken