Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, zu zeigen, wie die Normalisierung der Zellarchitektur und -position auf spezifischen adhäsiven Mikromustern eine einfache Automatisierung der Bildaufnahme und eine unkomplizierte Bildverarbeitung mit empfindlicher und robuster Quantifizierung von Arzneimittelwirkungen ermöglicht, die auf herkömmlichen Glasdeckglasträgern nicht erreichbar ist. Dies wird erreicht, indem Helizellen auf SI ausgesät werden, zwei Chips, die L-förmige SI-, drei markierte Mikromuster tragen. Die Zellen nehmen die dreieckige Form an und bilden eine große Stressfaser, die sich über die beiden Enden des L erstreckt. Die Musterzellen werden anschließend mit Lebos-Statin inkubiert oder unbehandelt gelassen, dann fixiert und gefärbt, um das Akton-Zytoskelett und die Zellkerne sichtbar zu machen.

Bilder der Mikromusterzellen werden dann mit dem Zellref-Makro aufgenommen und verarbeitet, um einen Stapel von Bildern für die Analyse zu erzeugen, und mit dem Hypotenuse-Makro zur Quantifizierung von Phänotypen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine signifikante Wirkung niedriger Dosen von BLEs-Statin auf Mikromuster-HELOC-Zellen zeigen, die unter Standard-Zellkulturbedingungen nicht nachweisbar ist. Hallo, herzlich willkommen.

Wir sind heute hier, um Sie durch unser experimentelles Protokoll zu führen, in dem wir erklären, wie Sie adhäsive Mikromuster für die Zellanalyse verwenden, sowie um Ihnen experimentelle Daten zu zeigen, die die einfache Quantifizierung sehr niedriger Dosen von Medikamenten auf diesen adhäsiven Mikromustern veranschaulichen. Wenn Sie diese Mikromuster zum ersten Mal sehen, werden Sie sofort verstehen, wie sie Variabilitätsprobleme bei der Bilderfassung während der Zellanalyse lösen können. Denn durch ein echtes Array von Zellen, ähnlich wie bei einem Microarray, können Sie den Mikroskoptisch leicht von Zelle zu Zelle bewegen, um Bilder schrittweise aufnehmen zu können.

Aber das ist natürlich nicht der einzige Vorteil von Micro Patterns, den es bietet. Es bietet viel mehr Verbesserungen, denn in der Tat normalisieren wir bei bestimmten typischen Mikromustern wie dem Crossbo oder dem Y die interne Zellarchitektur, was bedeutet, dass sich Organellen, die mitotische Spindel, das Zytoskelett und verschiedene Proteinnetzwerke von Zelle zu Zelle an den gleichen Stellen oder von Zelle zu Zelle in der gleichen Ausrichtung befinden. Dies macht es viel einfacher, die Auswirkungen von Medikamenten auf diese speziellen Muster vorherzusagen und zu quantifizieren. Nun, dies mag ziemlich kontraintuitiv zu dem erscheinen, was normalerweise in der klassischen Petrischale oder Mikroplatte gemacht wird.

Nun, weil man natürlich oft sieht, dass sich Zellen bewegen und unterschiedliche Morphologien annehmen. Auf den adhäsiven Mikromustern hingegen sehen alle Zellen gleich aus, weil sie auf dieses adhäsive Mikromuster reagieren und ihre Architektur auf die gleiche Weise organisieren. Das mag in der Tat ein wenig künstlich erscheinen, aber wenn man es genau betrachtet, ist die Petrischale nicht noch künstlicher?

Denn in Geweben werden Zellen sowohl durch die Nachbarzellen als auch durch die extrazelluläre Matrix eingeschränkt. Sie erhalten also eine Menge räumlicher Informationen, die die Zellarchitektur ausrichten. Und das vor Ort bis hin zur Anzeige von Mikromustern ist das, was wir tun.

Wir geben den Zellen diese räumlichen Informationen wieder und alle Zellen reagieren darauf und organisieren sich auf die gleiche Weise. Und da nun alle Zellen gleich aussehen, können wir das Konzept der Referenzzelle einführen, was bedeutet, dass wir alle Bilder mitteln und ein einzelnes Bild erhalten können, das wirklich repräsentativ dafür ist, wie die Zelle unter einem bestimmten Zustand aussieht. Dann können Sie ein Medikament hinzufügen und sich diese Referenzzelle erneut ansehen und sehen, wie sie die Morphologie oder die Organisation der Zelle als Reaktion auf dieses Medikament verändert hat.

Platzieren Sie zwei situ two-Chips einzeln in zwei unabhängige Wells einer Sechs-Well-Platte, um sicherzustellen, dass das situ two-Logo lesbar ist. Die für dieses Experiment verwendeten situ-Two-Chips weisen Mikromuster auf, die mit FibroGen SI drei gefärbt sind, und sollten vor der Verwendung im Dunkeln aufbewahrt werden. Sammeln Sie Hela-Zellen, die zu etwa 80 % mit Trypsin konfluiert sind, und überprüfen Sie, ob sie unter einem Mikroskop richtig individualisiert sind, zentrifugieren Sie sie vier Minuten lang bei 300 g und reanimieren Sie die Suspension, suspendieren Sie die Zellen vorsichtig, zählen und verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 15.000 Zellen pro Milliliter.

In unvollständigen D-M-E-M-F 12 Nährmedien werden 60.000 Zellen pro Well dispensiert. Die Platte sollte so wenig wie möglich bewegt werden, um Drehbewegungen im Medium zu vermeiden, die dazu neigen, die Zellen in der Mitte zu konzentrieren. Lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang unter der Haube sedimentieren und bringen Sie sie dann in den Zellinkubator.

Innerhalb von 10 bis 20 Minuten im Zellinkubator beginnen die Zellen nach 10 Minuten zu adhäsieren, überprüfen Sie regelmäßig unter dem Mikroskop, wann sich die Zellen festgesetzt haben. Wechseln Sie das Zellmedium und entfernen Sie den Zellüberschuss, indem Sie das folgende Verfahren viermal wiederholen. Halten Sie die Platte flach und saugen Sie das Medium vorsichtig von der Seite der Vertiefung an.

Achten Sie darauf, genügend Medien zu haben, damit der Chip nicht austrocknet. Fügen Sie vier Milliliter PBS hinzu und aspirieren Sie von der Mitte des Chips aus. Gehen Sie dann zur Seite des Wells, um den größten Teil des PBS wie zuvor abzusaugen, und prüfen Sie unter dem Mikroskop nach schwimmenden Zellen.

Wenn eine große Menge schwimmender Zellen übrig bleibt, wiederholen Sie den Waschvorgang. Wenn nur sehr wenige Zellen vorhanden sind, aspirieren Sie einen Teil des PBS und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter frisches Medium, aspirieren Sie und fügen Sie zweimal vier Milliliter frisches Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang in einem Zellinkubator, damit sich die Zellen vollständig ausbreiten können.

Bei dieser Methode werden zwischen 10 und 30 % der Mikromuster von einer einzelnen Zelle belegt, während andere Muster entweder leer oder von mehreren Zellen besetzt sind. Um die Zellen mit BLEs-Statin zu behandeln, verdünnen Sie die 17 Millimolare Wirkstoff-Stammlösung auf eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren mit 0,1 % DMSO in vier Millilitern Medium. Für die Steuerung wird das Medium mit 0,1 %DMSO nur angesaugt und schnell durch das BLEs-Statin oder die Kontrolllösungen ersetzt, um ein Austrocknen des Chips zu vermeiden.

Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie während dieser Inkubation den Zytoskelettpuffer vor. Fügen Sie ein Gramm Saccharose zu zwei Millilitern cb hinzu.

Dies trägt dazu bei, die inneren Zellstrukturen zu erhalten. Mischen Sie einen Milliliter CB-Saccharose mit vier Millilitern 5%igem PFA. Geben Sie zwei Milliliter PFA in CB-Saccharoselösung.

In zwei Vertiefungen einer frischen Platte mit sechs Vertiefungen. Um die Zellen zu fixieren, verwenden Sie eine Pinzette, um den CY-Chip aufzunehmen und ihn in die Sechs-Well-Platte zu legen, die zwei Milliliter PFA in CB-Saccharoselösung enthält. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, entfernen Sie das PFA und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, dann waschen Sie die Zellen 10 Minuten lang mit zwei Millilitern 100 millimolarem Ammoniumchlorid

Um die verbleibende PFA-Vernetzungsaktivität zu löschen, die Zellen durchlässig zu machen, indem zwei Milliliter PBS mit 0,1 % Tritton X 100 für drei Minuten hinzugefügt werden, zweimal mit PBS-Fleck Aktinfilamente mit zwei Millilitern ZI konjugiertem Fain bei eins bis 2000 in PBS mit 1,5 % BSA inkubiert eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert werden. Waschen Sie dann die Zellen einmal mit zwei Millilitern PBS. Als nächstes erhalten Sie die Zellkerne.

Fügen Sie zwei Milliliter von einem Milligramm pro Milliliter in PBS hinzu und inkubieren Sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Zweimal mit zwei Millilitern PBS waschen. Montieren Sie die beiden seitlichen Chips auf einem Standardschlitten mit 25 bis 30 Mikrolitern Montagelösungen wie al.

Um Bilder in drei Wellenlängen aufzunehmen, verwenden wir die Metamorph-Bildgebungssoftware und ein NIK-Icon-Eclipse-T-Mikroskop. Ausgestattet mit der CCD Hema Matsu Kamera und einer Intens Lite Quecksilberfaserbeleuchtung. Wählen Sie zunächst die 20-fache Vergrößerung.

Öffnen Sie anschließend in der Menüleiste die mehrdimensionale Erfassung. Um die verschiedenen Parameter des Experiments einzurichten. Geben Sie zunächst an, wo Sie Ihre Daten speichern möchten.

Stellen Sie die Anzahl der Wellenlängen auf drei ein, wählen Sie die SI-Wellenlänge drei aus und positionieren Sie den Deckglasträger so, dass 12 Mikromuster im Kamerafeld zentriert sind. Die Anzahl der pro Feld visualisierten Mikromuster variiert je nach Kamera- und Objektivkonfiguration. Stellen Sie die Belichtungszeit für jede Wellenlänge und jeden Autofokus ein.

Erstellen Sie für PS drei ein Journal, in dem die mehrdimensionale Erfassung ausgeführt wird, und speichern Sie es als MDA jnl. Öffnen Sie die Scan-Stage-Funktion, um 24 Bilder mit jeweils 12 Mikromustern aufzunehmen. Geben Sie sechs Spalten und vier Zeilen mit minus 400 Mikron x Schrittweite und 300 Mikron y Schrittweite in set journal to execute ein, laden Sie das Journal MDA jnl hoch drücken Sie Scan, um die automatische Erfassung der 24 Bilder in den drei Wellenlängen zu starten.

In diesem Video werden L-Mikromuster verwendet, um die Bildung einer einzigen Hauptaktin-Stressfaser auszulösen, die den ungebundenen Teil der Zelle aufrechterhält, und vereinfachen die Visualisierung und Messung der Auswirkungen von BLEs-Statins auf Zellen im Vergleich zu Zellen, die auf einfachem Fibronektin sitzen. Für die automatisierte Bildverarbeitung und -analyse skizzieren wir zwei speziell für das Open-Source-Programm image J geschriebene Makros aus einem Stapel von Rohbildern, wobei das erste Makro einzelne Zellen extrahiert und eine Referenzzelle erstellt. Das zweite Makro misst den Kollaps der Zellmembran.

Der erste Schritt ist die Segmentierung einzelner Zellen aus Rohbildern. Die fluoreszenzmarkierten Mikromusterbilder werden verwendet, um Regionen zu löschen, die auf den Mikromustern zentriert sind, die auf Bildern für jede Wellenlänge beschnitten und für jede Wellenlänge wieder zu Stapeln zusammengesetzt werden. Um Mikromuster mit einzelnen Zellen auszuwählen, erkennt das Makro die Anzahl der Kerne pro Bild und eliminiert in allen Stapeln diejenigen, die entweder mehr als einen Kern oder keine Kerne enthalten.

Schließlich wird das Image J Plugin multi-stack reg verwendet, um alle gesammelten Bilder und alle Kanäle basierend auf der Mikromusterposition neu auszurichten. In diesem Schritt wird eine Reihe von Stapeln einzelner Bilder generiert, die nun für die Analyse einzelner Zellen oder zum Erstellen einer Referenzzelle verwendet werden können. In Bild J wird die Referenzzelle konstruiert, indem eine Projektion der gefilterten und ausgerichteten Bilder aus einem Stapel erstellt wird.

Es können mehrere Projektionsmethoden angewendet werden, aber in der Regel wird eine Medianprojektion gewählt, um Ausreißer des Bildstapels zu eliminieren. Die Referenzzelle ist ein einzigartiges und nützliches Werkzeug für die Darstellung und Bildanalyse, das nur mit Mikromusterzellen erhalten wird. Um die Untersuchung zu erleichtern, wird eine Nachschlagetabelle oder LUT angewendet, um das einfarbige Bild in eine codierte Frequenzkarte umzuwandeln.

Um die Statinwirkung der BLEs zu charakterisieren, wurden die Steifigkeit und der Kollaps der Zelle mit Hilfe eines zweiten Bild-J-Makros analysiert. Kurz gesagt, werden Schwellenbilder des L-Mikromusters verwendet, um eine theoretische Hypotenuse der Zelldreiecksform zu definieren. Als nächstes wird eine Schwellenwertbestimmung der Akton-Färbebilder durchgeführt, um die Zellform zu definieren.

Die Flächendifferenz zwischen der theoretischen Hypotenuse und der tatsächlichen konkaven Zellmembran wird dann gemessen, wobei Zellen, die eine Fläche unterhalb der theoretischen Hypotenuse aufweisen, als kollabiert betrachtet werden. Die Wirkung von fünf mikromolaren BLEs-Statinen wurde durch den Vergleich der Anzahl kollabierter Zellen unter behandelten und Kontrollbedingungen charakterisiert. Typische Bilder von L-Mikromusterzellen, die mit BLEs-Statin behandelt oder unbehandelt gelassen wurden, zeigen, dass Zellen fixiert und mit Mikromustern gefärbt wurden.

Aktin und Zellkerne sind in Rot, Grün bzw. Blau dargestellt. Beachten Sie den Einfluss von BLEs-Statinen auf die Zellform im Vergleich zu Kontrollbedingungen. Repräsentative Zellen nach Inkubation mit BLEs-Statin oder Kontrollen auf einfachem Fibronektin sind hier dargestellt.

Die Zellen wurden fixiert und mit Aktin gefärbt und die Zellkerne sind grün bzw. blau. Beachten Sie die Ähnlichkeit zwischen behandelten und kontrollierten Bedingungen. Gezeigt werden typische Bilder von Referenzzellen, die aus Zellen gewonnen wurden, die mit BLEs-Statin behandelt oder unbehandelt geblieben sind.

Beachten Sie das Potenzial dieses Ansatzes für eine einfache Beobachtung des untersuchten Phänotyps. Hier ist ein Beispiel für eine Analyse der Auswirkungen von BLEs-Statin auf Zellen mit Hilfe der Makro-Hypotenuse. Während 25% der Kontrollzellen kollabierten, stieg dies in den fünf mikromolaren BLEs, die mit Statinen behandelt wurden, um das dreifache an, was das geschwächte kontraktile Actinin-Netzwerk widerspiegelt.

Nachdem Sie dies gesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie selbstklebende Mikromuster mehrere Engpässe in der High-Content-Analyse lösen. Erstens machte die Verwendung von selbstklebenden Mikromustern die Analyse der Bilderfassung viel einfacher. Zweitens ermöglichen Mikromuster die Erkennung sehr subtiler Wirkungen von Medikamenten bei sehr niedrigen Dosen, da Sie die Variabilität von Zelle zu Zelle reduzieren, indem Sie ihre Morphologie und ihr Verhalten normalisieren.

Und schließlich benötigen Sie im Vergleich zu den Tausenden von Zellen, die normalerweise notwendig sind, um ein gutes Ergebnis in der Zellanalyse zu erzielen, nur ein paar Dutzend Zellen, um mit unserer Referenzzelle ein robustes und aussagekräftiges Ergebnis zu erhalten.