Name: Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Erfahren Sie, wie adhesive Mikropatterns die Zellarchitektur normalisieren und die automatisierte Bildaufnahme sowie die quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen bei HeLa-Zellen verbessern.

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1. Cell Preparation und Seeding auf Mikrostrukturen <ol><li> Platz 2 CYTOOchips in 2 unabhängige Vertiefungen einer 6-Well Platte sicherzustellen, dass Sie "CYTOO" in der unteren rechten Ecke des CYTOOchip lesen. Mikrostrukturen können fluoreszierend mit Cy3 oder Cy5 Farbstoffen markiert werden. CYTOOChips für dieses Experiment verwendet haben Cy3 Fluoreszenz Mikrostrukturen bezeichnet. ACHTUNG: Halten Sie Chips in der Dunkelheit. </li><li> Sammeln HeLa-Zellen (~ 80% konfluent) durch Trypsinierung. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass die Zellen richtig durch die Trypsin-Behandlung verteilt. Sammeln und Zentrifuge Zellen bei 300g für 4 min, dann vorsichtig Zellpellet. Zählen von Zellen und verdünnt auf eine Konzentration von 15.000 Zellen / ml in abgeschlossenen DMEM/F12 Kulturmedien. </li><li> Dispense 4 mL (60.000 Zellen) in jedes Well mit einer CYTOOchip. ACHTUNG: Die Platte sollte so wenig wie möglich bewegt werden, um zu vermeiden Induktion einer rotierenden Bewegungen in das Medium als dies dazu, um Zellen in der Mitte zu konzentrieren. </li><li> Lassen Sie die Zellen Sediment für 10 min unter der Haube dann verschieben Sie sie in die Zelle Inkubator. Nach 10-20 min werden die Zellen beginnen, um die Mikrostrukturen haften. Nach 10 min, regelmäßig zu überprüfen, unter dem Mikroskop. </li><li> Sobald Zellen angebracht, ändern Sie die Zell-Medium und vorsichtig spülen Deckglas Oberfläche mit dem folgenden Verfahren: </li><li> Keeping die Platte flach, leicht absaugen das Medium mit einer Pipette von der Seite des Brunnens. ACHTUNG: Lassen Sie niemals den Chip austrocknen, bedeutet dies nicht absaugen alle Flüssigkeit, aber lassen genug, um die CYTOOchip jederzeit zu decken. </li><li> 4 mL PBS und saugen zunächst wieder ab der Mitte des Chips gehen dann zu der Seite des Brunnens. Absaugen der PBS als ohne den Chip an der Luft beschrieben. Wiederholen Sie 3-4 mal. </li><li> Überprüfen Sie unter dem Mikroskop für schwimmende Zellen: <ul><li> Wenn eine große Anzahl von schwimmenden Zellen bleiben, wiederholen Sie den Waschvorgang. </li><li> Wenn Sie sehr wenige Zellen zu sehen, absaugen Teil der PBS und ersetzen Sie es mit 2 mL frisches Medium. Absaugen und 4 ml frisches Medium zweimal. </li></ul></li><li> Die Platte wird in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für ein Minimum von 3 Stunden zu erlauben Zellen in voller Ausbreitung zu erreichen. HINWEIS: Mit dieser Methode zwischen 10-30% (2000 bis 6500) Mikrostrukturen durch eine einzelne oder mehrere Zellen belegt werden. ACHTUNG: Die benötigte Zeit für die Zellen vor dem Waschschritt und die Zeit für die vollständige Ausbreitung von Zellen auf Mikrostrukturen werden spezifisch für jede Zelllinie benötigt einhalten. </li></ol> 2. Blebbistatin Behandlung <ol><li> Lösen Sie die blebbistatin in 100% DMSO zu einer Stammlösung von 17 mM zu erhalten. Stammlösung weiter auf 5 mM mit 100% DMSO. Machen Sie eine Endverdünnung in Kulturmedium in einer Endkonzentration von 5 uM blebbistatin in 0,1% DMSO erhalten. </li><li> Zur Kontrolle Bedingungen vorzubereiten 4 ml Medium mit 0,1% DMSO nur. </li><li> Saugen Sie das Medium, auf Zellen und ersetzen sie durch die 4 ml Medium für Behandlungs-und Kontrollgruppe Bedingungen hergestellt. </li><li> Inkubieren Zellen für 1 Stunde bei 37 ° C. </li></ol> 3. Zell-Fixierung und Färbung von Actin <ol><li> Zubereitung der Lösung für die Zell-Fixierung Bitte beachten Sie Reagenz Abschnitt für die Herstellung von Zytoskelett-Puffer (CB) und PFA 5%. CB ist besonders für Fluoreszenz-Markierung von Aktin-Filamenten und Mikrotubuli empfohlen. <ul><li> Bereiten 1xCB-Saccharose: add 1 g Saccharose zu 2 ml CB. Aufnahme von Saccharose schont internen Zellstrukturen. </li><li> Bereiten Sie 4% PFA-CB-Saccharose: 1 mL 1xCB-Saccharose zu 4 ml warmes PFA 5%. ACHTUNG: Diese Lösung kann bei 4 ° C aufbewahrt werden für ein paar Tage nur. </li></ul></li><li> PFA Fixierung <ul><li> Verwenden einer Pinzette abholen CYTOOchip auf der CYTOO Logo und platziere sie (ohne Waschen) in eine Vertiefung einer 6-well-Platte mit 2 ml 4% PFA-CB-Saccharose-Lösung </li><li> Inkubieren 10 min bei RT </li><li> Entfernen PFA-CB-Saccharose und waschen einmal mit PBS </li><li> Haben ein zweites Waschen mit 2 ml 100 mM NH 4 Cl für 10 min, um restliche PFA Vernetzung Aktivität löschen HINWEIS: PFA fixiert Dias können in PBS für mehrere Tage bei 4 ° C vor Organelle Färbung für Fluoreszenz-Imaging gespeichert werden. </li></ul></li><li> Permeabilisierung der Zellmembran mit Triton X-100 Permeabilisierung der Zellen mit Waschmittel können Antikörper oder andere Sonden, die Zellmembran zu durchdringen und beseitigt einige der cytosolischen Pool von Cytoskelett-Proteinen, die sonst zu reduzieren kann der Kontrast des Zytoskeletts Polymeren macht es schwierig, ihre Lokalisation zu analysieren. <ul><li> Entfernen NH 4 Cl und 2 mL / well von 0,1% Triton X-100-CB 3 min bei RT </li><li> Zweimal waschen mit 2 mL PBS </li></ul></li><li> Aktinfärbung Fluorescent-Phalloidin, dieh bindet an nativen Aktin nur verwendet werden, um Aktinfilamente Fleck. <ul><li> 2 ml des FITC-konjugierten Phalloidin verdünnt 1:2000 in PBS mit 1,5% BSA </li><li> Inkubieren 1 h bei RT </li><li> Wash einmal mit 2 mL PBS </li></ul></li><li> Kerne Färbung <ul><li> Geben Sie 2 ml Hoechst (Fleck mit 1 g / mL in PBS) </li><li> Inkubieren 3 min bei RT </li><li> Wash 2 mal mit 2 ml PBS </li></ul></li><li> Montage der Folie <ul><li> Nehmen Sie den CYTOOchips auf der CYTOO Logo und montieren CYTOOchip auf einem Standard-Mikroskop-Objektträger mit 25-30 ul von Mowiol oder sonstige Montage-Lösung. </li></ul></li></ol> 4. Mikroskop-Setup und Automated Image Acquisition Zahlreiche Imaging-Software-Pakete gibt, die Steuerung des Mikroskops für eine schnelle automatisierte Bildaufnahme und Anzeige. In diesem Beispiel wird Metamorph Imaging-Software und automatische Übernahmen sind auf einem Nikon Eclipse Ti-Mikroskop mit einer CCD-Kamera und einem Hamamatsu Intensilight Quecksilber-Faser-Hilfslicht ausgestattet war. Bilder werden mit 20-facher Vergrößerung in drei Wellenlängen entsprechenden DAPI (Kernen), Cy-3 (Mikrostrukturen) und FITC-Phalloidin (Aktin) erworben. Die Zahl der Mikrostrukturen visualisiert pro Feld ist abhängig von der Kamera und Ziel-Setups. CYTOO Mikrostrukturen werden in festgelegten Intervallen von einander (100 oder 130 um) auf dem Chip erheblich erleichtern Akquisition positioniert. <ol><li> Wählen Sie 20-facher Vergrößerung </li><li> Öffnen Mehrdimensionale Bildaufnahme (in der Menüleiste: Apps / Mehrdimensionale Bildaufnahme) und richten Sie die verschiedenen Parameter des Experiments: <ul><li> Anzahl der Wellenlängen: 3 </li><li> Wavelength-Typen: DAPI, FITC, Cy3 </li><li> Set Belichtungszeit für jede Wellenlänge, indem Sie zunächst mit Schwerpunkt auf einem Feld von Zellen </li><li> Autofokus kann auf jeder Wellenlänge durchgeführt werden </li><li> Wählen Sie, wo die Daten zu speichern </li></ul></li><li> Wählen Cy3 Wellenlänge und Position der Kamera so, dass 12 Mikrostrukturen visualisiert und zentriert in der Kamera Feld (4 Spalten und 3 Reihen von Mustern) sind. </li><li> Erstellen Sie eine Zeitschrift läuft Mehrdimensionale Bildaufnahme. Das Verfahren zum Erstellen einer Zeitschrift ist in Abbildung 1 beschrieben. </li><li> Offene Bühne Scan-Funktion (in der Menüleiste: Geräte / Bühne / Scan Stage). Zum Erwerb 24 Bilder je 12 Mikrostrukturen bei 20-facher Vergrößerung, geben Sie 6 Spalten und 4 Zeilen mit -400 um X Schrittweite und 300 um Y-Schrittweite. In Set Journal to Execute, laden Sie die Zeitschrift MDA.JNL. Dann drücken Sie Scan, um die automatisierte Übernahme der gesamten Block in den drei Wellenlängen zu starten. HINWEIS: Die X-und Y-Schrittweite hier angegebenen werden nach der Anzahl der Mikrostrukturen in einem Kamera-Bereich variieren. Abhängig von Ihrer Bühne einzurichten, Richtung in X-und / oder Y negative Werte für Bewegung in die richtige Richtung erfordern. </li></ol> 5. Automatisierte Bildverarbeitung und-analyse Viele Bildbearbeitungs-und Analyse-Software-Pakete gibt. Die nachfolgend beschriebenen Verfahren skizzieren Bildverarbeitung und-analyse Schritten von 2 maßgeschneiderte Makros für die Open-Source-Programm ImageJ geschrieben durchgeführt. Das erste Makro CellRef schafft eine Referenzzelle, die zweite Hypotenuse Maßnahmen Steifigkeit / Zusammenbruch der Zellmembran. Beide sind auf Anfrage erhältlich durch <a href="www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> . <ol><li> Neues Bild-Stacks für alle drei Kanäle auf Mikrostrukturen (Makro CellRef) zentriert. Verwendung von Mikrostrukturen vermeidet Zelle Clustering und Verklumpung, stark vereinfacht den ersten Schritt in der automatisierten Bildverarbeitung, die Lokalisierung und Segmentierung der einzelnen Zellen ist. Die fluoreszenzmarkierten Mikrostruktur Bilder werden verwendet, um zu definieren und abzugrenzen Regionen auf der Mikrostrukturen zentriert. Diese Regionen werden dann auf die Bilder in andere Kanäle erworben umgesetzt und beschnitten. Entsprechende beschnittene Bilder werden dann in Stapel für jede Wellenlänge zusammengesetzt. Ein RGB-Stack ist auch aus der Zusammenführung der drei Kanäle (Abbildung 2) erstellt. </li><li> Übernehmen einzelne Zelle Auswahlfilter (Makro CellRef) Wie bereits erwähnt, sind 10-30% (2000 bis 6500) der Mikrostrukturen durch eine einzelne Zelle oder mehrere Zellen besetzt, während die übrigen Mikrostrukturen leer sind. Sie können die Bilder, die Mikrostrukturen von nur einer einzigen Zelle besetzt zeigen, erkennt das Makro die Anzahl der Kerne pro Bild und eliminiert aus allen Stacks (RGB und verschiedene Wellenlängen) solche mit mehr als einem Kern oder gar keine Kerne (Abb. 3). </li><li> Beseitigen Sie nicht normierten und Zellen, die nicht vollständig über die Mikrostruktur gestreckt mit Zellfläche cut-off Filter (Makro CellRef) So entfernen Sie sich teilenden Zellen, dass die Kerne Filter entgangen wäre, einen anderen Filter mit dem FITC-Kanal für Aktin angewendet wird. Zellfläche berechnet und diese unter einen bestimmten abgeschnitten (Zellbereiche etwa 2-mal weniger als Interphase Zellfläche) sind von allen Stapel entfernt. Die Zellhülle Bereich wird durch die Größe des Musters bestimmt. </li><li align zelle bilder cellref> Von den vorherigen Schritten wurden Bilder mit einzelnen mikrostrukturierten Zellen ausgewählt. Auch wenn diese Bilder auf Mikrostrukturen zentriert sind, werden sie niemals alle perfekt aufeinander abgestimmt. Zum Abschluss der Bildverarbeitung, ein ImageJ-Plugin (MultiStackReg) wird angewandt, um alle gesammelten Bilder und alle Kanäle auf die Mikrostruktur Position basiert auszurichten. Dieser Schritt erzeugt ausgerichtet Stapel von einzelnen Bildern, die nun für einzelne Zelle Analyse oder Schaffung einer Referenz Cell (Abbildung 4) verwendet werden können <li> Der Aufbau eines Referenz-Cell (Makro CellRef) Wachsende Zellen auf Mikrostrukturen bedeutet, dass alle Zellen ähnliche Formen haben. Diese Normierung erlaubt eine präzise Ausrichtung und Überlagerung von vielen Zell-Bilder. Zusammenfassend das Signal in jedem Bild über den gesamten Stapel ermöglicht es, zu visualisieren und zu messen eine "durchschnittliche Drogen-Effekt". Die endgültige Gesamtbild oder Reference Cell ist ein einzigartiges und nützliches Werkzeug für die Darstellung und Bildanalyse und kann nur mit mikrostrukturierten Zellen (Abbildung 4) bezogen werden. In ImageJ, die Referenzzelle wird, indem eine Projektion des gefilterten und ausgerichtet Bilder aus einem Stapel aufgebaut (Bild&gt; Stacks&gt; Z-Projekt). Mehrere Projektion Methoden wie beispielsweise die durchschnittliche oder maximale Intensität aufgetragen werden aber in der Regel eine mittlere Projektion gewählt wird, die beseitigt wichtigsten Ausreißer des Bildes Stapel. Zur Erleichterung der Prüfung der Ergebnisse ist eine LUT (Look Up Tables) Umwandlung der einfarbigen Bild in eine farbcodierte Frequenz Karte angewendet. </li><li> Messung und Quantifizierung von Parametern von Interesse (Makro Hypotenuse) In diesem Video-Artikel sind L-Mikrostrukturen verwendet, weil die Form organisiert das Aktin-Zytoskelett in einen einzigen großen Stress Faser. Durch die Hervorhebung Aktin auf diese Weise kann blebbistatin die Auswirkungen auf das Zytoskelett in vielen Arten bestimmt werden: die Messung von Veränderungen in der Krümmung des Aktin-Stress-Faser, Färbeintensität, Länge oder Dicke des Stress-Faser, Änderungen in morphometrische Merkmale des Aktin-Filamenten oder Zellform etc. Diese Parameter können entweder auf einzelne Zelle Bilder oder auf die letzte Referenz Zelle selbst gemessen werden. Hier wurde der Einfluss von 5 uM blebbistatin durch Zählen der Anzahl der eingestürzten Zellen mit einem zweiten ImageJ Makro namens Hypotenuse (Abbildung 7) charakterisiert. Kurz gesagt, werden Schwellenwert Bilder der L-Mikrostruktur verwendet werden, um eine theoretische Hypotenuse der Zelle Dreiecksform zu definieren. Als nächstes wird Schwellenwert des Aktin gefärbt Bildern durchgeführt, um annähernd den tatsächlichen Zellform. Der Bereich zwischen der theoretischen Hypotenuse der Zelle Dreieck und dem tatsächlichen konkave Zellmembran wird dann gemessen. Wenn die Zelle zusammengebrochen ist, wird ein Bereich unterhalb des theoretischen Hypotenuse. Der Anteil der kollabierte Zellen genutzt, um Kontrolle zu vergleichen und behandelt Bedingungen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiele von dem, was Zellen möchte auf Mikrostrukturen sofort schauen und mehrere Stunden nach der kritischen Waschschritten in 1,6 bis 1,8 beschrieben werden, sind in Abbildung 5 dargestellt. Nach 15 min auf CYTOOchips, sind rund HeLa-Zellen in gleichen Abständen darauf hinweist, dass sie auf die Fibronektin Mikrostrukturen (Abbildung 5a) eingehalten beobachtet. Die Haftung ist abgeschlossen, wenn die Zellen immobilisiert trotz leichtem Schütteln des Kulturgefäßes bleiben. Zur Minimierung der Anzahl der Mikrostrukturen von mehreren Zellen besetzt sind Chips dann mit PBS gespült, um Zellen schweben über dem cytophobic Bereichen zu entfernen. Nach mehreren Stunden werden die Zellen, die vollständig über die Mikrostrukturen sind gespannt, wie sie in Abb. 5b gezeigt aussehen. Typische einzelne Zelle Bilder nach Inkubation von Zellen mit blebbistatin, Fixierung und Färbung von Aktin und Kerne sind in Abbildung 6 dargestellt. Nach automatisierte Übernahme von mehreren Bildern und Bildverarbeitung mit dem ImageJ CellRef Makro ist eine farbcodierte Frequenz Karte generiert, zeigt die Intensität der Aktin gemittelt über alle Zellen Bilder (Abb. 6c und 6f). Der Vergleich der Referenzzelle für unbehandelten und behandelten Bedingungen zeigt das Potenzial dieses Ansatzes für die einfache Beobachtung des Phänotyps unter Studium und ist besonders nützlich für die Erkundung zellulären Arzneimittelwirkungen. Ein Beispiel für eine mögliche Analyse der Wirkung von blebbistatin auf Zellen ist in Abbildung 7 dargestellt. Die Zahl der Zusammenbruch Zellen (dh Zellen mit einem leeren Bereich bestehenden unter dem theoretischen Hypotenuse) in 50 Kontroll-Zellen erkannt und 50 Zellen mit 5 uM blebbistatin behandelt werden, als von der ImageJ Hypotenuse Makro erkannt wird, erscheint. Die erhöhte Anzahl von zusammengebrochen Zellen in der blebbistatin behandelten Population spiegelt Entspannung der Stress-Fasern und damit Spannung an der Membran durch blebbistatin Hemmung der actinomyosin kontraktilen Kräfte innerhalb der Zelle. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vorgehensweise, um eine neue Zeitschrift mit Metamorph erstellen. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Flussdiagramm der automatischen Bildverarbeitung Verfahren. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Herausfiltern einzelner Zellen. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Building a Reference Cell. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Zellaussaat. A) Hela Zellen Mikrostrukturen nach dem Spülschritt (4-fache Vergrößerung) eingehalten B) HeLa-Zellen nach der vollständigen Verteilung auf L Mikrostrukturen (10fache Vergrößerung). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Vergleich nonpatterned und mikrostrukturierten Zellen in Kontroll-und Drogen behandelt Bedingungen. HeLa-Zellen wurden für 3 Stunden ausgesät und mit 5 uM blebbistatin für 1 Stunde (unteres Bild) oder unbehandelt (oberes Bild). In der Kontrollgruppe nonpatterned Zellen (a), montiert Aktin in mehrere Fasern, die sich unmerklich nach Behandlung mit 5 uM blebbistatin (d) zu demontieren. Auf L-Mikrostrukturen, Kontroll-Zellen eine dreieckige Form (b) erlassen und entwickeln eine große Aktin-Faser (Stress-Faser) zwischen den 2 Spitzen der L. Im Vergleich zu nonpatterned Zellen (d), induziert blebbistatin eine große phänotypische Veränderungen auf L-mikrostrukturierten Zellen (e). Direkte Visualisierung von Arzneimittelwirkungen und den Vergleich von Kontroll-und behandelten Bedingungen können sich schnell visualisiert werden mit der Referenzzelle Präsentation aus 20 Zellen aufgebaut. Ähnlich wie einzelne Zellen, ist eine klare und intensive Beanspruchung Faser, die zur Kontrolle Reference Cell (c), während blebbistatin Zellen kollabieren und den großen Stress Faser verschwindet (f) behandelt. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Beispiel für eine Analyse der Auswirkungen von blebbistatin auf Zellen mit dem Makro Hypotenuse. Während 25% der Kontroll-Zellen wurden zusammengebrochen, das 3-fache auf 75% erhöht in den 5 uM blebbistatin behandelten Zellen spiegelt die geschwächte actinomyosin kontraktilen Netz (n = 50 Zellen).

<ol><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+guides+the+orientation+of+the+cell+division+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis.</a> Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).</li>
<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropy+of+cell+adhesive+microenvironment+governs+cell+internal+organization+and+orientation+of+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).</li>
<li>Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nat Methods. , (2010).</li>
<li>Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+network+mechanics+and+active+contractility+determine+cell+and+tissue+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape.</a> Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+cadherins+control+nucleus+and+centrosome+position+and+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity.</a> J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).</li>
<li>Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+patterns+epithelial-mesenchymal+transition+via+intercellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction.</a> J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).</li>
<li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4872-4877 (2010).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li>
<li>Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 11594-11599 (2005).</li>
<li>Pouthas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+migrating+cells%2C+the+Golgi+complex+and+the+position+of+the+centrosome+depend+on+geometrical+constraints+of+the+substratum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum.</a> J Cell Sci. 121, 2406-2414 (2008).</li>
<li>Thery, M., Jimenez-Dalmaroni, A., Racine, V., Bornens, M., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+study+of+mitotic+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation.</a> Nature. 447, 493-496 (2007).</li>
<li>Thery, M., Pepin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63, 341-355 (2006).</li>
</ol>

Alle Autoren außer Anne Béghin sind Mitarbeiter von CYTOO SA, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel vorgestellten produziert.

Wahl der Mikrostruktur Während die Wirkungen von 5 uM blebbistatin kaum nachweisbar auf Standard-Kultur unterstützt werden, ist eine effiziente Quantifizierung auf Mikrostrukturen, die Aktin-Konzentration in einem einzigen großen Stress Faser möglich. Dies verbessert die Visualisierung des Aktin-Zytoskeletts Beihilfe genaue Quantifizierung der blebbistatin Auswirkungen auf die Zelle. Die Wahl der Mikrostruktur Form ist entscheidend bei der Gestaltung des Tests und ist nach der phänotypischen Veränderung in der Studie hervorgehoben werden entwickelt. Schlussfolgerungen Mikrostrukturen erleichtern die Visualisierung und Quantifizierung von Arzneimittelwirkungen, vor allem bei niedrigen Konzentrationen. Der Ersatz von homogenen ebenen Substraten mit Klebstoff Mikrostrukturen für die Zell-basierte Assays verbessert die Genauigkeit, Empfindlichkeit und Qualität der produzierten Daten. In Folge werden weniger Zellen für die Analyse notwendig, um zu erreichen robusten statistischen Ergebnisse 3. Adhesive Mikrostrukturen bieten eine echte Chance für die Verbesserung der funktionellen Studien und die Erforschung phänotypische Veränderungen bei niedrigeren Wirkstoffkonzentrationen, um zu vermeiden toxische oder indirekten Arzneimittelwirkungen. Wenn adäquate Screening-Plattformen verwendet werden, können Mikrostrukturen erfüllen die Anforderungen der Pharma-Unternehmen zur Verbesserung der Gen / Wirkstoff-Screening-Anwendungen. Einige weitere Beispiele für aktuelle Publikationen, die Mikrostrukturen ausgebeutet haben für die Analyse und Quantifizierung von zellulären Phänomen sind unten 3-13 zitiert.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Zellkultur </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM-FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips sind für die Adsorption des Proteins Ihrer Wahl </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1x </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Zählkammer (Kova Folie) </td><td> Prolabo </td><td> 71287,01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax-I </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (f tal Rinderserum) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Penicillin &amp; Streptomycin </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 Vertiefungen-Platte </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Zentrifuge </td><td> Fisher Scientific </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Drogen, Fixierung und Immunfärbung </td></tr><tr><td colspan="2" > Zytoskelett Buffer 1X (CB) </td><td > Sigma </td><td > MES: M8250 KCl: I2636 MgCl: M2393 EGTA: E3889 </td><td > 10 mM MES pH 6,1, 138mm KCl, 3 mM MgCl, 2mM EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > Sucrose </td><td > Sigma </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> Mix 10 ml PFA 32% mit 54 ml CB 1.185X </td></tr><tr><td colspan="2"> Triton-X100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PBS-Tabletten </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Bovin Serumalbumin (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin-FITC </td><td> Sigma </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Cl 0,1 M </td><td> Sigma </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Image Acquisition </td></tr><tr><td colspan="2"> Epifluoreszenz-Mikroskop </td><td> Nikon</td><td> Eclipse-Ti </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> CCD-Kamera </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ImageJ Software </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verbesserte visualisierung und quantitative analyse von arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten cells

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Bis heute sind die meisten HCA (High Content Analysis) Studien mit adhärenten Zelllinien auf ein homogenes Substrat in Gewebekultur-behandelte Mikro-Platten gezüchtet durchgeführt. Unter diesen Bedingungen verbreiten Zellen teilen und in alle Richtungen, was zu einer inhärenten Variabilität in der Zellform, Morphologie und Verhalten. Die hohe Zell-Zell-Varianz der Gesamtbevölkerung behindert den Erfolg des HCA, vor allem für die Medikamentenentwicklung. Die Fähigkeit von Mikrostrukturen, die Form und der inneren Polarität von jeder einzelnen Zelle zu normalisieren bietet eine enorme Chance für die Lösung dieser kritischen Engpass 1-2. Um den Zugang und die Nutzung der Mikrostrukturierung Technologie hat CYTOO eine Reihe von bereit Mikrostrukturen zu verwenden, in Deckglas und Mikrotiterplatten-Formate entwickelt. In diesem Video-Artikel bieten wir Ihnen ausführliche Protokolle über alle Verfahren von Zellaussaat auf CYTOOchip Mikrostrukturen, medikamentöse Behandlung, Fixierung und Färbung der automatisierten Erfassung, automatische Bildverarbeitung und abschließende Analyse der Daten. Mit diesem Beispiel zeigen wir, wie Mikrostrukturen können Zell-basierte Assays zu erleichtern. Veränderungen der Zelle Zytoskeletts sind nur schwer in Zellen auf homogenen Substraten kultiviert quantifizieren, aber die Kultivierung von Zellen auf Mikrostrukturen führt zu einem reproduzierbaren Organisation des Aktin-Geflecht durch systematische Positionierung der Zelladhäsion Kontakte in jeder Zelle. Solche Normalisierung der intrazellulären Architektur ermöglicht die Quantifizierung der auch kleine Effekte auf das Aktin-Zytoskelett, wie in diesen Satz von Protokollen über blebbistatin, einem Inhibitor der Aktin-Myosin-Interaktion gezeigt.

Adhesive Mikrostrukturen, dass zelluläre Architektur normalisieren kann die Empfindlichkeit in der Detektion von Arzneimittelwirkungen, die Verbesserung der Reproduzierbarkeit und vereinfachen automatisierte Bildaufnahme und-analyse werden. Eine solche Technologie profitieren Arzneimittel / siRNA Screening-Assays, auf konventionellen Zellkultur unterstützt durchgeführt und somit leidet übermäßige Zelle zu Zelle Variabilität.

Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

Bisher wurden die meisten HCA-Studien (High Content Analysis) mit adhärenten Zelllinien durchgeführt, die auf einem homogenen Substrat in gewebekulturbearbeiteten ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, zu zeigen, wie die Normalisierung der Zellarchitektur und -position, die auf spezifischen adhäsiven Mikromustern erreicht wird, eine einfache Automatisierung der Bildaufnahme und eine unkomplizierte Bildverarbeitung mit empfindlicher und robuster Quantifizierung von Arzneimittelwirkungen ermöglicht, was auf herkömmlichen Glasdeckträgern nicht erreichbar ist. Dies wird erreicht, indem Heli-Zellen auf SI-Zwei-Chips ausgesät werden, die L-förmige, mit SI-Drei markierte Mikromuster tragen. Die Zellen nehmen eine dreieckige Form an und bilden eine Hauptspannungsfasern, die sich über die beiden Enden des L erstreckt. Die gemusterten Zellen werden anschließend mit Lebos-Statins behandelt oder unbehandelt belassen, danach fixiert und angefärbt, um das Aktin-Zytoskelett und die Zellkerne sichtbar zu machen.Bilder der mikrostrukturierten Zellen werden anschließend aufgenommen und mithilfe des cell ref-Makros zur Erstellung eines Bildstapels für die Analyse sowie des hypotenuse-Makros zur Quantifizierung von Phänotypen verarbeitet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die einen signifikanten Effekt niedriger Dosen von BLEs Statin auf mikrostrukturierte HELOC-Zellen zeigen, der unter Standardzellkulturbedingungen nicht nachweisbar ist. Hallo, willkommen.Heute sind wir hier, um Sie Schritt für Schritt durch unseren experimentellen Protokollablauf zu führen, der erklärt, wie adhesive Mikromuster für die Zellanalyse verwendet werden können, und Ihnen zudem experimentelle Daten zeigen, die die einfache Quantifizierung sehr geringer Wirkstoffdosen auf diesen adhesiven Mikromustern veranschaulichen. Wenn Sie diese Mikromuster zum ersten Mal sehen, werden Sie sofort verstehen, wie sie Variabilitätsprobleme bei der Bildaufnahme während der Zellanalyse lösen können. Denn durch ein echtes Zellarray, vergleichbar mit einem Mikroarray, können Sie den Mikroskoptisch einfach von Zelle zu Zelle bewegen, um nacheinander Bilder schrittweise aufzunehmen.Doch das ist natürlich nicht der einzige Vorteil, den mikroskopische Muster bieten. Sie bringen weitaus mehr Verbesserungen mit sich, da auf bestimmten typischen mikroskopischen Mustern wie dem Kreuzbo oder dem Y die innere Zellarchitektur normalisiert wird. Das bedeutet, dass Organellen, der Spindelapparat, das Cytoskelett und verschiedene Proteinnetzwerke von Zelle zu Zelle an denselben Positionen oder in derselben Ausrichtung vorliegen, wodurch die Wirkung von Wirkstoffen auf diese spezifischen Muster deutlich besser vorhersehbar und quantifizierbar wird. Dies mag im Gegensatz zu dem erscheinen, was üblicherweise in der klassischen Petrischale oder Mikroplatte durchgeführt wird.Nun, weil man natürlich oft sieht, wie Zellen sich bewegen und unterschiedliche Morphologien annehmen. Auf den adhäsiven Mikromustern hingegen beginnen alle Zellen gleich auszusehen, da sie auf dieses adhäsive Mikromuster reagieren und ihre Architektur auf dieselbe Weise organisieren. Dies mag zwar tatsächlich etwas künstlich erscheinen, aber wenn man genauer hinsieht, ist die Petrischale dann nicht noch künstlicher?Da in Geweben die Zellen durch benachbarte Zellen sowie durch die extrazelluläre Matrix eingeschränkt sind, erhalten sie sehr viel räumliche Information, die die Zellarchitektur ausrichtet. Und genau diese örtliche Anordnung mittels Mikromustern ist es, was wir tun.Wir stellen diese räumliche Information in Zellen wieder her, und alle Zellen reagieren darauf und organisieren sich auf dieselbe Weise. Da nun alle Zellen gleich aussehen, können wir das Konzept der Referenzzelle einführen, was bedeutet, dass wir alle Bilder mitteln und ein einzelnes Bild erhalten, das wirklich repräsentativ dafür ist, wie die Zelle unter einer bestimmten Bedingung aussieht. Anschließend können Sie eine Substanz hinzufügen und erneut die Referenzzelle betrachten, um zu sehen, wie sich die Morphologie oder Organisation der Zelle als Reaktion auf diese Substanz verändert hat.Platzieren Sie zwei Situ Two-Chips einzeln in zwei unabhängige Vertiefungen einer 6-Loch-Platte, wobei sichergestellt werden muss, dass das Situ Two-Logo lesbar ist. Die für dieses Experiment verwendeten Situ Two-Chips weisen Mikromuster auf, die mit FibroGen SI drei gefärbt sind, und sollten vor der Verwendung im Dunkeln aufbewahrt werden. Sammeln Sie Hela-Zellen, die zu etwa 80 % konfluent sind, durch Trypsin und überprüfen Sie mikroskopisch, ob sie ausreichend einzeln vorliegen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 ×g für vier Minuten und resuspendieren Sie sie vorsichtig. Zählen und verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 15.000 Zellen pro Milliliter.In unvollständigem D-M-E-M-F 12-Kulturmedium 60.000 Zellen pro Vertiefung ansiedeln. Die Platte sollte so wenig wie möglich bewegt werden, um Drehbewegungen im Medium zu vermeiden, die dazu neigen, die Zellen in der Mitte zu konzentrieren. Die Zellen 10 Minuten lang unter dem Abzug sedimentieren lassen, anschließend in den Zellinkubator bringen.Innerhalb von 10 bis 20 Minuten im Zellinkubator beginnen die Zellen nach 10 Minuten zu adhärieren; überprüfen Sie regelmäßig unter dem Mikroskop, wann die Zellen angeheftet sind. Wechseln Sie das Zellmedium und entfernen Sie überschüssige Zellen, indem Sie den folgenden Vorgang viermal wiederholen. Halten Sie die Platte flach und aspirieren Sie vorsichtig das Medium von der Seite der Vertiefung.Stellen Sie sicher, dass genügend Medium vorhanden ist, um ein Austrocknen des Chips zu vermeiden. Geben Sie vier Milliliter PBS hinzu und aspirations beginnend in der Mitte des Chips. Bewegen Sie sich dann zur Seite der Vertiefung, um wie zuvor den größten Teil des PBS abzusaugen, und überprüfen Sie unter dem Mikroskop auf schwebende Zellen.Wenn eine große Menge schwimmender Zellen verbleibt, wiederholen Sie den Waschvorgang. Wenn nur sehr wenige Zellen vorhanden sind, aspirations einen Teil des PBS ab und ersetzen Sie ihn durch zwei Milliliter frisches Medium; aspirations ab und geben Sie zweimal vier Milliliter frisches Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang in einem Zellinkubator, um den Zellen ausreichend Zeit zum vollständigen Ausbreiten zu geben.Mithilfe dieser Methode werden zwischen 10 und 30 % der Mikromuster von einer einzelnen Zelle besetzt, während andere Muster entweder leer bleiben oder von mehreren Zellen besetzt werden. Um die Zellen mit BLEs-Statin zu behandeln, verdünnen Sie die 17 Millimolar starke Wirkstoff-Stammlösung auf eine Endkonzentration von fünf Mikromolar mit 0,1 % DMSO in vier Milliliter Medium. Für die Kontrolle bereiten Sie Medium mit nur 0,1 % DMSO vor, aspirieren Sie das Zellmedium und ersetzen Sie es schnell durch die BLEs-Statin- oder Kontrolllösungen, um zu verhindern, dass der Chip austrocknet.Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Während dieser Inkubation bereiten Sie den Cytoskelettpuffer vor. Geben Sie ein Gramm Saccharose zu zwei Millilitern cb. Dies hilft, die inneren Zellstrukturen zu erhalten. Mischen Sie ein Milliliter CB-Saccharose mit vier Milliliter 5 % PFA. Geben Sie zwei Milliliter PFA in die CB-Saccharose-Lösung. In zwei Vertiefungen einer frischen sechswelligen Platte. Zum Fixieren der Zellen den CY2-Chip mit einer Pinzette aufnehmen und in die sechswellige Platte geben, die zwei Milliliter PFA in CB-Saccharose-Lösung enthält. Die Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, das PFA entfernen und die Zellen einmal mit PBS waschen, anschließend mit zwei Millilitern 100 Millimolar Ammoniumchlorid 10 Minuten lang waschen.Um die verbleibende PFA-Vernetzungsaktivität abzubrechen, permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter PBS mit 0,1 % Tritton X-100 für drei Minuten hinzufügen, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und färben Sie die Aktinfilamente mit zwei Milliliter ZI-konjugiertem Fain im Verdünnungsverhältnis 1:2000 in PBS mit 1,5 % BSA, inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie die Zellen einmal mit zwei Milliliter PBS. Danach färben Sie die Kerne.Geben Sie zwei Milliliter einer Ein-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung von hawked in PBS hinzu und inkubieren Sie drei Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie zweimal mit je zwei Milliliter PBS. Montieren Sie die beiden Seitenchips mit 25 bis 30 Mikrolitern Montagemedium wie al auf einem Standardobjektträger.Um Bilder in drei Wellenlängen aufzunehmen, verwenden wir die Metamorph-Bildgebungssoftware und ein NIK icon eclipse T Mikroskop, das mit einer CCD Hema Matsu Kamera und einem Intens lite Quecksilber-Faser-Strahler ausgestattet ist. Wählen Sie zunächst eine 20x-Vergrößerung aus.Öffnen Sie als Nächstes in der Menüleiste die mehrdimensionale Aufnahme, um die verschiedenen Parameter des Experiments einzurichten. Geben Sie zuerst an, wo Ihre Daten gespeichert werden sollen.Stellen Sie die Anzahl der Wellenlängen auf drei ein, wählen Sie die SI-Drei-Wellenlängen-Einstellung aus und positionieren Sie den Objektträger so, dass 12 Mikromuster im Kamerafeld zentriert sind. Die Anzahl der pro Feld sichtbaren Mikromuster variiert je nach Kamera- und Objektivkonfiguration. Stellen Sie die Belichtungszeit für jede Wellenlänge ein und aktivieren Sie den Autofokus.Erstellen Sie für PS drei ein Journal, das eine mehrdimensionale Aufnahme durchführt, und speichern Sie es als MDA jnl. Öffnen Sie die Scan-Stufen-Funktion, um 24 Bilder aufzunehmen, von denen jedes 12 Mikromuster enthält. Geben Sie sechs Spalten und vier Zeilen mit einer x-Schrittweite von minus 400 Mikrometer und einer y-Schrittweite von 300 Mikrometern im Journal-Setup ein, um das Journal MDA jnl hochzuladen; drücken Sie Scan, um die automatisierte Aufnahme der 24 Bilder in den drei Wellenlängen zu starten.In diesem Video werden L-Mikromuster verwendet, um die Bildung einer einzelnen, großen Aktin-Stressfaser auszulösen, die den nicht angehefteten Teil der Zelle stützt, und um die Visualisierung und Messung der Auswirkungen von Statinen auf Zellen im Vergleich zu Zellen, die auf reiner Fibronectin-Oberfläche sitzen, zu vereinfachen. Für die automatisierte Bildverarbeitung und -analyse stellen wir zwei eigens entwickelte Makros vor, die für das Open-Source-Programm ImageJ geschrieben wurden. Aus einem Stapel roher Bilder extrahiert das erste Makro einzelne Zellen und erzeugt eine Referenzzelle. Das zweite Makro misst den Kollaps der Zellmembran.Der erste Schritt ist die Segmentierung einzelner Zellen aus Rohbildern. Die fluoreszenzmarkierten Mikromusterbilder werden verwendet, um Bereiche zu begrenzen, die auf die Mikromuster zentriert sind; diese werden in den Bildern für jede Wellenlänge zugeschnitten und zu Stapeln für jede Wellenlänge neu zusammengesetzt. Um Mikromuster mit einzelnen Zellen auszuwählen, erfasst das Makro die Anzahl der Kerne pro Bild und entfernt in allen Stapeln jene, die entweder mehr als einen Kern oder keinen Kern enthalten.Schließlich wird das Image-J-Plugin Multi-Stack-Reg verwendet, um alle gesammelten Bilder und Kanäle basierend auf der Position des Mikromusters neu auszurichten. Dieser Schritt erzeugt Stapel von Einzelbildern, die nun für die Einzelzellanalyse oder zur Erstellung einer Referenzzelle verwendet werden können. In Image J wird die Referenzzelle durch Projektion der gefilterten und ausgerichteten Bilder aus einem Stapel konstruiert.Mehrere Projektionsmethoden können angewendet werden, üblicherweise wird jedoch eine Medianprojektion gewählt, um Ausreißer des Bildstapels zu eliminieren. Die Referenzzelle ist ein einzigartiges und nützliches Werkzeug für Darstellung und Bildanalyse, das nur mit mikrostrukturierten Zellen erhältlich ist. Zur Erleichterung ihrer Untersuchung wird eine Farbtabelle (Lookup Table oder LUT) angewendet, um das einfarbige Bild in eine codierte Frequenzkarte umzuwandeln.Um den Wirkmechanismus von BLEs Statin zu charakterisieren, wurden die Steifigkeit und der Kollaps der Zelle mithilfe eines zweiten J-Makros in ImageJ analysiert. Kurz gesagt, werden Schwellenwert-Bilder des L-Mikromusters verwendet, um die theoretische Hypotenuse der dreieckigen Zellform zu definieren. Anschließend erfolgt die Schwellenwertbestimmung der Aktin-Färbungsbilder, um die Zellform festzulegen.Die Differenz der Fläche zwischen der theoretischen Hypotenuse und der tatsächlichen konkaven Zellmembran wird dann gemessen; Zellen mit einer Fläche unterhalb der theoretischen Hypotenuse gelten als kollabiert. Die Wirkung von fünf Mikromolar BLEs-Statin wurde durch den Vergleich der Anzahl kollabierter Zellen unter behandelten und Kontrollbedingungen charakterisiert. Typische Bilder von L-mikrostrukturierten Zellen, die mit BLEs-Statin behandelt oder unbehandelt gelassen wurden, sind dargestellt; die Zellen wurden fixiert und angefärbt sowie mikrostrukturiert.Actin und Kerne sind jeweils in Rot, Grün und Blau dargestellt. Beachten Sie den Einfluss von BLEs Statin auf die Zellform im Vergleich zu Kontrollbedingungen. Hier werden repräsentative Zellen nach Inkubation mit BLEs Statin oder Kontrollen auf unbeschichtetem Fibronectin gezeigt.Die Zellen wurden fixiert und gefärbt, wobei Aktin und Kerne jeweils grün und blau dargestellt sind. Beachten Sie die Ähnlichkeit zwischen behandelten und kontrollierten Bedingungen. Typische Bilder von Referenzzellen, die aus mit BLEs-Statin behandelten oder unbehandelten Zellen gewonnen wurden, sind dargestellt.Beachten Sie das Potenzial dieses Ansatzes für die einfache Beobachtung des untersuchten Phänotyps. Hier ist ein Beispiel einer Analyse der Wirkungen von BLEs Statin auf Zellen mithilfe des Makro-Hypotenuse. Während 25 % der Kontrollzellen kollabiert waren, stieg dieser Wert bei den mit fünf Mikromolar BLEs Statin behandelten Zellen dreifach auf 75 % an, was das geschwächte Aktinin-Kontraktionsnetzwerk widerspiegelt.Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie adhäsive Mikromuster mehrere Engpässe in der Hochdurchsatz-Analyse lösen. Erstens vereinfachen adhäsive Mikromuster die Bildaufnahme, -verarbeitung und -analyse erheblich. Zweitens ermöglichen Mikromuster die Detektion sehr subtiler Wirkungen von Wirkstoffen in sehr niedrigen Dosen, da die Zelle-zu-Zelle-Variabilität reduziert wird, indem Morphologie und Verhalten der Zellen normalisiert werden.Und schließlich benötigt man im Vergleich zu den Tausenden von Zellen, die normalerweise notwendig sind, um ein gutes Ergebnis in der Zellanalyse zu erzielen, nur einige Dutzend Zellen, um mit unserer Referenzzelle ein robustes und signifikantes Ergebnis zu erhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir zeigen eine einfache Methode für die Platzierung Zellen an gewünschten Stellen auf einem Substrat. Diese Methode Mustern Zellen, indem ein Silikon-Chip mit Vertiefungen, die mit Zellen auf dem Substrat gefüllt. Diese Methode bietet eine neue Art und Weise zu modulieren diffusionsfähig und juxtacrine Signalisierung zwischen den Zellen.

Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip

Wässriger Zweiphasensysteme wurden gleichzeitig Muster mehrere Populationen von Zellen verwendet. Dieses schnelle und einfache Methode zur Musterbildung Zelle nutzt die Phasentrennung der wässrigen Lösungen von Dextran und Polyethylenglycol und die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymerlösungen besteht.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Diese 3D-Mikrofluidik-Drucktechnologie druckt Arrays von Zellen auf untergetauchte Oberflächen.  Wir beschreiben, wie Arrays von Zellen mikrofluidisch in 3D-Durchflusszellen auf untergetauchte Oberflächen gebracht werden.  Durch das Bedrucken von submersen Oberflächen wurden Zell-Microarrays hergestellt, die ein Wirkstoffscreening und die Beurteilung der Zytotoxizität in einer Vielzahl von Bereichen ermöglichen.

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Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Die hier vorgestellte Methode verwendet Mikromuster ungemilzt mit quantitativer Bildgebung, um die räumliche Organisation innerhalb von Säugetierkulturen aufzuzeigen. Die Technik ist in einem Standardlabor für Zellbiologie leicht zu etablieren und bietet ein beschreibbares System zur Untersuchung von Mustern in vitro.

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Generierung heterogener Arzneimittelgradienten über Krebspopulationen auf einem mikrofluidischen Evolutionsbeschleuniger zur Echtzeitbeobachtung

Diese Methode soll die Mechanismen veranschaulichen, mit denen extrazelluläre Matrix-Cues wie Substratsteifigkeit, Proteinzusammensetzung und Zellmorphologie Schwann-Zell(SC)-Phänotyp regulieren.

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